Memoire Online - Activité progestative et activité oestrogénique de "holarrhena floribunda" (G. Don) Durand et Schinz (apocynaceae), une plante de la pharmacopée traditionnelle du Burkina Faso

pour obtenir le titre
de Docteur de l'Université de Ouagadougou
Spécialité: Sciences Biologiques Appliquées
Option: Physiologie de la Reproduction
par
Balé BAYALA
Sur le thème :

Activité progestative et activité oestrogénique de Holarrhena floribunda (G.
Don) Durand et Schinz (Apocynaceae), une plante de la pharmacopée
traditionnelle du Burkina Faso.

DEDICACE

A LA MEMOIRE DE MON PERE BALI BAYALA, DE MA MERE BLANDINE EYOW KANKO, DE MES FRERES AINES ANDRE BAYALA ET PASCAL BAYALA. LA VOLONTE DE DIEU A VOULU QU'EN CE JOUR VOUS NE SOYEZ PAS PRESENTS. MERCI POUR TOUT VOTRE SOUTIEN DURANT TOUTES CES ANNEES D'ETUDES. PUISSENT VOS AMES REPOSER EN PAIX.

A ASSITA SENE ET A MES FRERES ET SOEURS QUI ONT ETE L'OBJET DE TANT DE PRIVATIONS ET D'ABSENCES DE MA PART.

Remerciements

Ce travaiL a été réaLisé au Laboratoire de PhysioLogie AnimaLe de L'Université de Ouagadougou, en coLLaboration avec L'I.N.E.R.A (Département des Productions AnimaLes), sous La direction scientifique du Professeur Laya Sawadogo. Je tiens à Lui adresser mes sincères remerciements pour La confiance qu'iL m'a accordé en m'accueiLLant dans son Laboratoire.

Je voudrais égaLement remercier très sincèrement Le Docteur Hamidou Hamadou Tamboura, Chargé de Recherche au Département des Productions AnimaLes de L'I.N.E.R.A, Codirecteur de ce travaiL, travaiL qu'iL a suivi avec attention et avec une grande disponibiLité. Ce fut un réeL pLaisir de côtoyer votre très grande modestie et votre humanisme sans mesure.

Je tiens à remercier Le Directeur de L'I.N.E.R.A, Le Professeur BoLy Hamidou pour ses conseiLs et ses encouragements ainsi que toute son administration

Je remercie Le CREAF de Kamboinsè et tous Les chercheurs du Département Productions AnimaLes à savoir Les Docteurs Tingsmerson Ouedraogo, Augustin Kanwé, Hamadé Kagoné, Aissata Wèrème, Chérubin Hien OLLo, Henri Kaboré, Amadou Traoré, Les ingénieurs, Ferdinand OuLbiLbiga, Rasmané Sanfo, Adama Kaboré, Les Techniciens, Moumouni Sanou, Sidiki Idogo, Boukary Sinon, ALain MiLLogo, Madame Dakouré, Madame Zerbo. Je ne saurai oubLier Les manoeuvres du Département, Benjamin Ouédraogo, Boukary Dicko, Boureima Dicko et Sakande AbdouLaye pour Le grand soutien qu'iLs m'ont apporté.

Aux enseignants Chercheurs du Département BioLogie et PhysioLogie AnimaLe, Les Professeurs Gustave Kabré et Guenda Wendengoundy, Les Docteurs Raymond BeLemtougry, Youssoufou Ouédraogo, Lamini Ouédraogo, Drissa Sanou, Youssouf Ouattara, Moussa Zongo, Antoine Sanou , je tiens à vous dire grand merci pour tous Les conseiLs et aides de toute nature que vous m'avez accordé pour La réaLisation de cette thèse.

Je tiens à remercier très sincèrement Le Professeur Augustin Béré, Le Professeur Sita Guinko, Le Docteur Hamadou Dicko pour Leur conseiLs et Leurs aides de toute nature.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance au Professeur Pierre I. Guissou et à toute son équipe du Laboratoire de PharmacoLogie et ToxicoLogie de L'I.R.S.S, à savoir Les Docteurs SyLvin Ouedraogo, Hassanata MiLLogo, Marius Lompo, Aristide Traoré, Noya Somé et à ses deux techniciens Kadeba et Yaro.

A mes très chers ami (e)s et frères CharLes Daboné, OLivier Gnankiné, Sandra Kambou, Moussa GueLbeogo, Tiganadaba Lodoun, ImäeL Nestor BassoLé, Athanase BadoLo, Bah Niango MaLick, ALy Sawadogo, PitaLa Wéré, CharLes Lamien, ALine Medah, Martin Tiendrebeogo, Yaya Bayané, Hamade Ouedraogo, PauLin Ouaba, Marie Laure Guissou, SyLvie Yaméogo, Christiane Sawadogo, IsabeLLe Sourabié, GhisLaine Yao, je voudrais vous remercier pour tout Le soutien que vous avez pu m'apporter tout au Long de L'éLaboration de cette thèse.

Je voudrais adresser mes sincères remerciements à toute L'Equipe de NeurobioLogie et Maîtrise des Fonctions Saisonnières de L'I.N.R.A/NouziLLy de Tours (France) pour L'accueiL et Le soutien dont j'ai été L'objet au cours de mon séjour dans Leur Laboratoire.

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Différentes espèces de Holarrhena rencontrées en Asie et en Afrique P. 10

Tableau II : Noms vernacuLaires de Holarrhena floribunda des Langues de queLques

Tableau VI : ProtocoLe d'administration de La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe pendant une période de quatre (4) jours. P. 43

Tableau VII : ProtocoLe d'administration de La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe pendant une période de sept (7) jours. P. 45

Tableau VIII : ProtocoLe d'administration des produits pour La recherche de L'activité progestative. P. 47

Tableau IX : ProtocoLe d'administration des produits pour La recherche de L'activité antiprogestative. P. 55

Tableau X : Temps de rétention et surface des pic des extraits avant et après enrichissement avec de La progestérone pure. P. 56

Tableau XI : Concentration (ìg/mL) et quantité (g) de La progestérone dosée par H.P.L.C dans Les extraits de H. floribunda. P. 56

Tableau XII : Quantité de progestérone dosée par Radio-immunoLogie dans Les extraits des feuiLLes de H.floribunda. P. 57

Tableau XIII : Nombre de souris mortes après 1, 24, 48 et 72 heures d'observations. P. 58

Tableau XIV : Pourcentage (%) de mortaLité des souris pour Le test finaL de La DL50 des extraits du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda administrés par voie sous-cutanée. P. 59

Tableau XV : VaLeurs des D.L et des rapports DL5/DL95, DL50/DL95, DL5/DL50 de La toxicité généraLe aiguë de L'extrait du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda par voiesouscutanée. P. 60

TabLeau XVI : Evolution du poids des souris et pourcentage de perte de poids. P. 61

Tableau XVII : Effet des différentes doses de L'extrait du macéré aqueux de H. floribunda sur Le poids de queLques organes en toxicité généraLe aiguë. P. 62

TabLeau XVIII : Principaux syndromes d'intoxication observés pendant toute la
durée du test et leur variation en fonction des différentes doses. P. 62

Tableau XIX : Effet de La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe administrée pendant quatre(4) jours sur Le poids des souris, du déciduome et L'apparition des sites d'impLantations. P. 64

Tableau XX : Effet de La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe administrée pendant sept (7) jours sur Le poids des souris, du déciduome et L'apparition des sites d'impLantations. P. 65

Tableau XXI : Effet des différents traitements sur Le poids des souris, des cornes utérines, du déciduome et L'apparition des sites d'impLantation pour La mise en évidence de L'activitéprogestative. P.66

Tableau XXII : Effet des différents traitements sur Le poids des souris, du déciduome et L'apparition des sites d'impLantation pour La mise en évidence de L'activité antiprogestative. P.68

Tableau XXIII : EvoLution pondéraLe des rattes avant et après 7 jours de traitements et Le pourcentage de rattes présentant une ouverture vaginaLe. P. 69

TabLeau XXIV : Effet des différents traitements sur le poids des rattes entières et le pourcentage de rattes présentant une ouverture vaginale. P. 75

LISTE DES FIGURES

Figure 4 : Les différentes étapes du cycle oestral à partir de la réalisation d'un frottis vaginal P. 19 et P. 20

Figure 5 : Section transversaLe de La corne utérine de La ratte dans LaqueLLe Le déciduome se différentie. P. 23

Figure 6 : Préparation hormonaLe à partir de La progestérone et de L'oestradioL pour La
mise en évidence de La réaction déciduaLe P. 24

Figure 7 : Les voies de La stéroidogénèse à partir du choLestéroL. P. 29

Figure 8: RéguLation des hormones hypophysaires et ovariennes et mécanismes de rétroaction des oestrogènes et de La progestérone sur L'axe hypothaLamo-hypophysaire.

Figure 9 : InstiLLation de L'huiLe d'arachide de Laboratoire dans La corne utérine P. 35

Figure 10 : Chromatogramme du temps de rétention de La progestérone. P. 37

Figure 11 : Courbe étaLon de La progestérone : reLation surface pic / concentration. P. 38
Figure 12 : Courbe étaLon de dosage de La progestérone par radio-immunoLogie. P. 39

Figure 16 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur les poids frais et sec de l'utérus chez la ratte ovariectomisée. P. 70

Figure 17 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur La variation des poids frais des gLandes surrénaLes après 7 jours de traitement chez La ratte ovariectomisée. P. 71

Figure 18 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur Le poids frais des gLandes surrénaLes après 7 jours de traitement chez La ratte ovariectomisée. P. 72

Figure 19 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur Le taux de choLestéroL après 7 jours de traitement chez La ratte ovariectomisée. P. 73

Figure 20: Effet des différents traitements de H. floribunda sur le taux de glucose après 7 jours de traitement chez la ratte ovariectomisée. P. 74

Figure 21 : Variation pondérale de l'utérus de ratte ayant subi différents traitements pendant7jours. P. 76

Figure 22 : Variation pondérale des ovaires de rattes ayant subi différents traitements pendant 7 jours. P. 77

Figure 23: Variation pondérale de glandes surrénales des rattes ayant subi différents traitements pendant 7 jours. P. 78

Figure 24 : Evolution du taux de protéines dans les cornes utérines et dans les ovaires après 7 jours. P. 79

Figure 25 : Evolution du taux de glucose dans les cornes utérines et dans les ovaires après7joursdetraitement. P. 80 Figure 26 : Evolution du taux de cholestérol dans les cornes utérines et dans les ovaires après 7 jours de traitement. P. 81

SIGLES ET ABBREVIATIONS

Inera : Institut de L'Environnement et des Recherches AgricoLes INRA : Institut NationaL de La Recherche Agronomique

ABSTRACT

Holarrhena floribunda (G. Don) Durand and Schinz an Apocynaceae was commonLy used in veterinarian an human traditionaL therapeutic to fight against abortion and infertiLity. The aim of the present study is to verify its utiLization by evaLuating progesterone activity by deciduaL reaction and estrogenic activity by uterotrophics assays. Research was preLiminary made by HPLC and RIA on the presence of progesterone in three aqueous extractions : macerate, decoction and infusion. Safety measures of utiLizations have been evaLuated by acute toxicity.

ResuLts have reveaLed as much in HPLC as in RIA, the presence of the progesterone in the Leaves of H. floribunda. However the quantity of progesterone is more higher in the macerate extract than in decoction and in infusion extract.

The vaLues of DL50 and index security are respectiveLy 1509 mg/kg and 10,3. These vaLues show an average toxicity and a great manoeuvrabiLity of the macerate aqueous extracts of Leaves of H. floribunda administered subcutaneousLy.

The research of progesterone activity shows progesterone potentiaLisation by the macerate aqueous extracts of Leaves of H. floribunda. This potentiaLisation showed an increase of the weight of the deciduoma and the number of spots simiLar to bLastocysts impLantation sites when the extract and the pure progesterone were administered simuLtaneousLy.

On the other hand the macerated aqueous extracts of Leaves of H. floribunda showed an estrogenic activity. This activity firstLy showed an increase of weight of wet and dry uterus and vaginaL opening of rats. SecondLy by an increase of the totaL protein and the gLucose LeveL and a decrease of the LeveL of choLesteroL in uterine horns.

In concLusion, the potentiaLisation of the progesterone by macerate aqueous extracts of Leaves of H. floribunda and their estrogenic activity justify their utiLization in traditionaL veterinary therapeutic. H floribunda contains some phytoestrogens, that couLd be beneficiaL in the fight against cancers, cardiovascuLar diseases and some affections of menopausaL women Like osteoporosis, if thorough studies are made.

Mots dles : Holarrhena floribunda, folk medicine, progesterone activity, estrogenic activity

TABLE DES MATIERES

CHAPITRE II :HOLARRHENA FLORIBUNDA (G. DON) DURAND ET SCHINZ

CHAPITRE III: ORGANISATION DE L'APPAREIL GENITAL DE LA RATTE ET DE LA SOURIS FEMELLE 16

(HPLC) dans Les extraits de Holarrhena floribunda et par radio-immunoLogie. 32

Introduction générale

Le contrôle de la fertilité humaine ou animale a de tout temps préoccupé les hommes. Dans l'espèce humaine, la tendance globale actuelle en matière d'investigation est à la recherche de moyens de réduction ou d'inhibition de la fertilité en raison de l'explosion démographique pour faire face à la faible disponibilité des ressources économiques et alimentaires.

L'humanité dispose de nos jours de méthodes modernes (substances de synthèse et hormones d'origine animaLe) utiLisées pour Le contrôLe de La fertiLité chez La femme ou chez L'homme. Les méthodes ou substances utiLisées jusque Là présentent pour La pLupart certains inconvénients et rebutent un grand nombre de personnes.

Les besoins économiques et alimentaires imposent par contre, la recherche de moyens pour la stimulation de la fertilité et de la productivité des espèces d'animaux domestiques économiquement rentables. L'amélioration de la productivité des animaux est réalisée à travers diverses méthodes de maîtrise de la reproduction et d'insémination artificielle. Ces méthodes nécessitent des outils spéciaux qui demeurent encore très peu maîtrisés et utilisés par les Africains. La médecine traditionnelle propose par contre des plantes réputées comme moyens efficaces de stimulation ou d'inhibition de la fertilité. Il faut par ailleurs noter que le recours `' à la médecine par les plantes», séduit plus la population et est l'objet d'un regain d'intérêt de plus en plus croissant en Afrique. Entre autres raisons explicatives de cet engouement, figure l'échec de la médecine moderne ou conventionnelle face à certaines pathologies (cancer, hépatite, maladies virales,....) et son coût prohibitif pour les populations aux ressources financières très limitées.

Les éLeveurs africains utiLisent de nombreuses pLantes pour Les soins de Leur bétaiL à teL point qu'on parLe de médecine vétérinaire traditionneLLe même si ceLLe-ci reste encore très peu connue par rapport à La médecine traditionneLLe humaine. Parmi ces pLantes, ceLLes qui sont utiLisées pour L'améLioration de La fertiLité animaLe retiennent une attention particuLière dans La mesure où Le Burkina Faso est un pays à économie essentieLLement tournée vers L'agricuLture avec des produits d'éLevage qui tiennent Le second rang, 10,6% en terme de recettes d'exportation après Le coton (STC-PDES/MF (1998)). Parmi Les maux qui sont à La base de La mauvaise productivité animaLe, figurent Les avortements et Les probLèmes Liés à L'infertiLité. Des études menées par Bourzat en 1980 sur Les avortements, montrent chez La seuLe espèce caprine, des taux de 30,5% et 29,5%, respectivement chez Les types génétiques "mossi" et "sahéLien". Pendant La saison sèche ce taux peut s'éLever à 40,44%. La même étude reprise par

Tamboura et at. (1998) donne pour Les espèces bovines, ovines et caprines des taux d'avortement respectivement de 35,7%, 50% et 20,13%. Les pertes sont aLors énormes et constituent un important manque à gagner pour L'économie du pays.

Des enquêtes ethnobotaniques réaLisées au Burkina Faso ont reLevé Les atouts thérapeutiques que pourrait présenter L'utiLisation de certaines pLantes dans Le domaine de La reproduction humaine et animaLe pour corriger des probLèmes d'infertiLité ou d'avortement (Aké-Assi, 1992 ; NacouLma, 1996 ; Tamboura et at., 1998 ; Arbonnier, 2000). Parmi ces pLantes figure Hotarrhena ftoribunda (G Don) Durand et Schinz (H. ftoribunda), une pLante de La famiLLe des Apocynacées. Cette pLante est non seuLement utiLisée pour guérir Les affections de La sphère génitaLe teLLes Les vaginites, La bLennorragie ou La gonococcie, mais aussi pour L'améLioration de La fertiLité et La Lutte contre L'avortement. Parmi Les causes de L'infertiLité et des avortements, figure en bonne pLace La déréguLation des hormones stéroïdiennes (progestérones et oestrogènes) ou La production insuffisante de ces hormones suite à un dysfonctionnement des ovaires ou de L'axe hypotaLamo-hypophysaire. Les différentes investigations menées sur Le pLan chimique ont mis en évidence L'existence de La progestérone dans Les feuiLLes de H. ftoribunda, une espèce récoLtée en Inde et au SénégaL (Schmit, 1950 ; Leboeuf et at., 1964, 1969). Paris et at. (1959) et MiLLogo (1992) ont réussi à mettre en évidence des fLavonoïdes dans Les feuiLLes de H. ftoribunda. Les fLavonoïdes sont des substances pouvant présenter des activités oestrogéniques (Hodek et at., 2002 ; CemeLi et at., 2004 ; VaLachovicova et at., 2004 ; Zieran et at., 2004). Dans La mesure où depuis L'avènement de La maLadie de La vache foLLe, Les nouveLLes exigences internationaLes sont de pLus en pLus à L'excLusion du recours aux hormones d'origine animaLe et aux hormones de synthèse, iL est extrêmement important de mener des investigations dans La recherche des phytohormones (Reich et at., 2002 ; Kersseboom et at., 2002 ; OMS, 2002 ; ViLLmeur, 2003). Les phytohormones, substances contenues dans Les pLantes et possédant des activités hormonaLes oestrogéniques, progestatives ou androgéniques sont donc de pLus en pLus recherchées.

Les parties de H. ftoribunda utiLisées par Les éLeveurs burkinabè possèdent-eLLes une activité progestative ou oestrogénique? C'est Là notre préoccupation principaLe en réaLisant des tests bioLogiques appropriés afin de vérifier expérimentaLement Les propriétés supposées en médecine traditionneLLe de cette pLante en tant que substance stimuLante de La fertiLité femeLLe. Des tests in vivo d'activités oestrogéniques et progestatives ont donc été réaLisés.

Mais avant toute investigation in vivo de L'activité progestative ou oestrogénique, IL était judicieux de vérifier La présence de La progestérone dans L'Holarrhena récoLté au Burkina Faso. IL a été donc recherché seLon Les trois (3) modes de préparations aqueuses (macération, décoction et infusion) couramment utiLisées en thérapeutique traditionneLLe, La présence de La progestérone dans Les feuiLLes de H. floribunda. Au préaLabLe, Les mesures sécuritaires d'utiLisations des extraits aqueux de H. floribunda ont été testées par L'évaLuation de La toxicité généraLe aiguë.

Première partie :

Revue bibliographique

CHAPITRE I : UTILISATION DES PLANTES EN MEDECINE

TRADITIONNELLE

1. Utilisation des plantes

La médecine traditionneLLe d'après L'OMS, se rapporte aux pratiques, méthodes, savoirs et croyances en matières de santé qui impLiquent L'usage à des fins médicaLes de pLantes, de parties d'animaux et de minéraux, de thérapies spiritueLLes, de techniques et d'exercices manueLs séparément ou en association pour soigner, diagnostiquer et prévenir Les maLadies ou préserver La santé.

L'homme, par une approche progressive a découvert Les vertus bénéfiques des pLantes faciLitées par L'organisation des rapports sociaux, en particuLier à partir du néoLithique (8000 ans av. J.C). IL faut néanmoins noter que Les thérapies traditionneLLes par Les pLantes, varient d'une cuLture à L'autre, d'un continent à L'autre et même d'un pays à L'autre. Comparativement à La médecine moderne, La médecine traditionneLLe a Le même objectif c'est à dire guérir ou prévenir une maLadie. Cependant La conception des causes d'une maLadie et Les méthodes empLoyées pour La guérir diffèrent.

L'observation attentive, associée à La transmission des informations reçues au cours du temps font que certains hommes deviennent capabLes de poser un diagnostic, de retrouver La pLante qui soigne et finaLement de guérir La maLadie.

2. Les limites de l'usage des plantes en médecine traditionnelle

L'une des difficuLtés majeures de La médecine traditionneLLe humaine et vétérinaire est La méconnaissance de La pLupart des espèces végétaLes intervenant dans Le domaine de La santé. IL s'impose donc un souci majeur de recensement et de reconnaissance de toutes ces espèces végétaLes. CeLa serait donc possibLe si au niveau de chaque Etat, iL se formait un réseau organisé, composé de tradipraticiens et de chercheurs intervenant dans Le domaine de La médecine traditionneLLe et travaiLLant de manière convergente. CeLa sera encore pLus fructueux s'iL existait une passereLLe étroite entre d'abord Les chercheurs et Les tradipraticiens et ensuite entre Les hôpitaux de type modernes et Les structures traditionneLLes.

égaLement L'absence de preuves de standardisation ou de données scientifiques de son innocuité, de son efficacité et de sa quaLité. IL s'impose donc La nécessité de prendre des mesures pour garantir un usage correct et durabLe des remèdes afin de protéger et préserver Le savoir traditionneL ainsi que Les ressources natureLLes nécessaires à son appLication.

Les pratiques de La médecine traditionneLLe n'étant pas écrites dans certains pays d'Afrique, eLLes se perdent ou sont modifiées car se transmettent de bouche à oreiLLe. Ces pratiques médicaLes sont très souvent entourées d'un certain mysticisme qui cachent Les éLéments bioactifs et ceLa entrave énormément L'étude du médicament traditionneL.

3. Les principales caractéristiques des remèdes à base de plantes

Dans La médecine traditionneLLe, tous Les organes des pLantes sont utiLes. Mais ce sont principaLement Les feuiLLes, Les tiges feuiLLées, Les écorces de tiges, Les racines et Les écorces de racines qui sont Les pLus utiLisées (Bitsindou, 1996). Les feuiLLes sont très utiLisées d'abord pour La faciLité de Leur cueiLLette et ensuite parce qu'eLLes sont Le siège de La biosynthèse et du stockage des métaboLites responsabLes des propriétés bioLogiques des pLantes (MazLiak, 1974 ; Bigendako-PoLygenis, 1989; Bitsindou, 1996).

Les modes de préparation des recettes traditionneLLes sont très variés (Kanyinda, 1983 ; MaLgras, 1992). On distingue :

4. Les phytohormones

CHAPITRE II : HOLARRHENA FLORIBUNDA (G. DON) DURAND ET SCHINZ.

1. L'espèce Holarrhena floribunda (G. Don) Durand et Schinz

2. Description de l'espèce H. floribunda

3. Distribution géographique de H. floribunda (G. Don) Durand et Schinz

4. Noms vernaculaires

Pays		Langue			Noms vernaculaires

	·	Mooré	·	Kinkirs yoabga, kinkirs yabraogo	Burkina Faso
	·	PeuL	·	Tarki, taraki
	·	DiouLa	·	toumatiof
	·	Sérère	·	Nap, lop
	·	OuoLof	·	Seoulou	Sénégal

	·	Casamance	·	Kerko
	·	DioLa	·	toumatiof
	·	Agni	·	Céré
	·	Yacouba	·	kouro	Côte d'Ivoire
	·	BaouLé	·	sébé
	·	Attié	·	sahoué
	·	Gouro	·	toro-toro
	·	FouLLah	·	gaoulen, indamma ou Ndamma	Guinée
	·	MaLinké	·	kouna sana
	·	Soussou	·	yété ou yaté
	·	Mandingue	·	tiariko	Soudan

	·	Bambara	·	Tou-fou

5. Eléments de phytochimie

6. Activités pharmacologiques

7. Utilisations traditionnelles de H. floribunda

CHAPITRE III: ORGANISATION DE L'APPAREIL GENITAL DE LA RATTE ET DE LA SOURIS FEMELLE

1. Organisation de l'appareil génital

2. Le cycle oestral de la ratte et de la souris.

A L'oestrus, iL y a La Libération des ovuLes au niveau de L'ovaire. Les ovuLes se Lient aux gamètes mâLes et après pLusieurs divisions successives donnent des bLastocystes. Les bLastocystes vont s'impLanter au niveau de La paroi utérine pour La formation des futurs embryons.

Figure 4.a : Metestrus : Nombre important de leucocytes (L) par rapport aux ceLLuLes épithéliales (E) et aux cellules cornifiées (C).

Figure 4.d : Proestrus : Le frottis est constitué soit uniquement de cellules épithéliales (E) soit d'un mélange de cellules épithéliales en grand nombre et de cellules cornifiées (C) et des leucocytes (L) en petit nombre. E ou E > C ou E > L (Rhodes et al., 2002).

3. L'implantation du blastocyste

L'impLantation du bLastocyste dans L'utérus dépend de La réceptivité de L'endomètre. Le concept de La réceptivité de L'utérus a été étabLi pour La première fois chez Le rat avant d'être étendu à d'autres espèces (Psychoyos, 1973, 1986, 1993).

Le processus de L'impLantation nécessite une synchronisation précise entre Le déveLoppement du bLastocyste et La réceptivité utérine contrôLée par Les stéroïdes ovariens et différents médiateurs. ELLe nécessite égaLement une profonde transformation de L'endomètre, L'acquisition de propriétés adhésives des ceLLuLes trophobLastiques et un contrôLe de L'invasion de L'endomètre par Le trophobLaste. Le moment de L'impLantation varie seLon Les espèces. Dans Le processus de L'impLantation, La réaction déciduaLe du stroma endométriaL est une des transformations majeures réaLisées au niveau de L'endomètre. Chez La ratte et La souris, L'impLantation survient cinq (5) jours après L'ovuLation.

ceLLuLes endométriaLes. Cette réaction appeLée réaction déciduaLe, se caractérise par

22 une différentiation des ceLLuLes du stroma de L'endomètre pour donner La décidue. Le tissu déciduaL exerce une fonction endocrine par La production de proLactine, de facteurs de croissance et joue un rôLe important dans Le contrôLe de L'invasion de L'endomètre par Le trophobLaste. Le tissu déciduaL intervient dans La nutrition de L'embryon et est égaLement source d'approvisionnement en hormone.

En absence du bLastocyste et si L'endomètre reçoit un traitement hormonaL approprié, La réaction déciduaLe peut être décLenchée expérimentaLement soit par des stimuLi physiques (grattage, pincement, piqûre de La muqueuse) soit chimiquement par une injection de prostagLandines (PGF2_á, PGE2), d'histamine, de CO2 ou par une injection intraveineuse d'huiLe de Laboratoire dans La cavité utérine. Dans ce cas La décidue est appeLée déciduome (Figure 5). Le déciduome est simiLaire à La décidue dans sa formation, sa régression et sa capacité sécrétrice. Le processus de mise en pLace de La décidue ou du déciduome s'appeLLe déciduaLisation (Gu et at. , 1999 ; FazLeabas et at. , 2001). Dans tous Les cas, La réaction déciduaLe se caractérise par deux phénomènes majeurs : d'abord par un accroissement de La perméabiLité de La paroi utérine et une augmentation très importante de La taiLLe et du poids de L'utérus, puis par L'apparition des sites d'impLantation. Cette augmentation est Le résuLtat d'une différenciation des ceLLuLes épithéLiaLes et des ceLLuLes du stroma de L'utérus.

PLusieurs hormones interviennent dans Le processus de mise en pLace du déciduome, mais Les travaux de Sengupta et at. (2000) ont démontré que La réaction déciduaLe résuLte essentieLLement de L'action conjuguée de L'oestradioL et La progestérone (Figure 6). Les niveaux éLevés de L'oestradioL sécrété durant La phase proestrus, préparent La muqueuse et initient Les modifications au niveau de L'endomètre, LesqueLLes sont renforcées par une éLévation progressive des taux de La progestérone, puis suit une phase de décroissance de L'oestradioL pendant Le postoestrus (CLarke et at., 2004).

Figure 5: Section transversaLe de La corne utérine de La ratte dans LaqueLLe Le déciduome se différentie (Turner, 1955).

Figure 6: Préparation hormonale pour la mise en évidence de la réaction déciduale. Les principales hormones sont la progestérone et l'oestradiol. Le niveau d'oestradiol élevé chute à partir de l'ovulation pour atteindre un niveau inférieur au niveau de base. Le niveau de la progestérone augmente à partir de l'ovulation pour atteindre un plateau s'il y a implantation. Cela peut être repris sur des animaux ovariectomisés ou pseudogestants en préparant pendant les trois(3) premiers jours l'utérus avec de fortes doses d'oestradiol. Les jours quatre et cinq étant les jours de l'ovulation, les animaux ne reçoivent aucun traitement. Les jours suivant les animaux reçoivent de faibles doses d'oestradiol et de la progestérone. Le huitième jour, jour de sensibilité maximale de l'utérus, les animaux reçoivent un stimulus physique ou chimique pour mimer la présence d'un embryon.

CHAPITRE IV : LES STEROIDES OVARIENS

L'ovaire est un organe compLexe ayant une doubLe fonction : production et Libération des ovuLes et production de certaines hormones. Ces hormones jouent un rôLe important dans La réguLation de La croissance, du déveLoppement, et de L'entretien des structures nécessaires à La perpétuation de L'espèce. Les principaux stéroïdes ovariens sont La progestérone et Les oestrogènes dont La forme La pLus active est La 17- - oestradioL.

1. La progestérone

1.1 Rôles physiologiques

La progestérone est une hormone sexueLLe femeLLe du groupe des progestagènes. ELLe est sécrétée par Le corps jaune dans L'ovaire dans La deuxième partie du cycLe sexueL. Pendant toute La durée du cycLe, eLLe agit sur L'utérus chez LequeL, eLLe rend fonctionneLLe Les gLandes sécrétrices de gLycogène pour nourrir L'éventueL embryon et stimuLe Leur sécrétion. La progestérone agit sur Le compLexe hypotaLamo-hypophysaire par un rétrocontrôLe toujours négatif. En effet, Le compLexe hypotaLamo-hypophysaire, par L'intermédiaire de La LH, permet La sécrétion de La progestérone par Le corps jaune. La progestérone en pLus de son rôLe dans Le maintien de La gestation est un intermédiaire dans La biosynthèse à partir du choLestéroL, des stéroïdes surrénaux, testicuLaires ou ovariens.

1.2 Les récepteurs de la progestérone

La progestérone est considérée comme L'hormone de La gestation. Au tout début de La gestation, La progestérone coordonne une série compLexe d'événements qui vont de La différenciation de L'utérus pour L'impLantation à La synchronisation du déveLoppement de L'embryon. La progestérone agit via ses récepteurs progestéroniques (PR) qui sont des protéines compLexes composées de deux isoformes PRA et PRB, originaires d'un même gène (Schrader et at, 1972 ; ConneeLy et at, 1987 ; Kastner et at, 990). La reLation entre Les deux isoformes et Leur activité bioLogique est encore méconnue de nos jours. Le consensus est que Les récepteurs de La progestérone sont activés par Les oestrogènes via Les récepteurs oestrogéniques (Kim et at., 2000 ; MyLonas et at., 2004). Ainsi certains effets de La progestérone sont attribués à La combinaison de

L'oestrogène et de La progestérone. Cependant des études ont montré que La progestérone est essentieLLe pour L'induction de La déciduaLisation car Le processus de mise en pLace du déciduome ne peut aboutir que si Les récepteurs progestéroniques de L'utérus ont été stimuLés (Lydon et at., 1995).

2. Les oestrogènes

2.1 Rôles physiologiques

La forme La pLus active des oestrogènes est L'oestradioL. L'oestradioL est essentieLLement sécrété par Les ceLLuLes de La granuLosa et de La thèque interne de L'ovaire.

Les organes cibLes cLassiques des oestrogènes sont : La gLande mammaire, L'utérus, Les ovaires, Le vagin. Dans ces organes, grâce à ses effets anaboLisant et mitotique, Les oestrogènes stimuLent La proLifération ceLLuLaire et La biosynthèse des récepteurs de La progestérone (Curtis et at., 2002). L'utérus s'est révéLé être L'organe par exceLLence mettant bien en évidence de manière assez caractéristique, Les effets des substances oestrogéniques chez La femeLLe (Prakash et Roy, 1984; Kuivan et Desombe, 1985). Les tests menés sur L'utérus pour L'évaLuation de L'activité oestrogénique d'une substance sont des tests utérotrophiques (DieL et at., 2002).

L'administration de substances oestrogéniques pures ou présentes dans des extraits de pLantes, à des rattes immatures ou ovarectomisées provoque L'augmentation importante de La masse et du poids de L'utérus, L'ouverture du méat vaginaL, La cornification des ceLLuLes de La muqueuse vaginaLe, La réduction du taux de choLestéroL et L'accroissement des teneurs en protéines totaLes dans Les cornes utérines (Jensen et Desombe, 1972; KatzeneLLenbogen et at., 1979; TeLefo et at., 1998 ; DieL et at., 2002).

Les oestrogènes ont égaLement des actions sur des tissus cibLes non cLassiques teLs : Les os, Le système immunitaire, Les reins, Le foie etc.

D'après Turner et at. (1994), Mc Ewen (2001), MikkoLa et at. (2002), une déficience en oestrogènes entraînerait un certain nombre de pathoLogies teLs : L'artérioscLérose, L'ostéoporose, La perte des réfLexes cognitifs et une dégénérescence du système nerveux centraL. L'action protectrice des oestrogènes des maLadies cardio-vascuLaires serait Liée à La diminution du taux de choLestéroL sanguin après administration des oestrogènes (MendeLsohon et at., 1994 ; Barret-Connor et at., 1996 ; Bjarnason et at., 2001).

Sur La fonction de reproduction mâLe, Les oestrogènes ont été détectés dans La prostate et sont censés avoir un rôLe dans Le déveLoppement de cet organe (Prins et al., 2001). Les oestrogènes préviennent indirectement Le cancer de La prostate par une inhibition du feed-back sur Le compLexe hypotaLamo-hypophysaire conduisant à une réduction du taux d'androgène circuLant simiLaire à L'effet d'une castration (Harkonen et al., 2004).

Le tabLeau IV, donne Les différents organes et tissus sur LesqueLs agissent Les oestrogènes.

Tableau IV : Les organes et les tissus sensibles aux oestrogènes (Diel at al., 2002).

2.2 Les récepteurs oestrogéniques

L'activité oestrogénique et anti-oestrogénique de toute substance qu'eLLe soit animaLe ou végétaLe dépend de sa capacité à se fixer sur Les récepteurs oestrogéniques. Deux sous types de récepteurs oestrogéniques sont connus : Les récepteurs a (ER a) (Green et at., 1986) et Les récepteurs B (ER B) (Kuiper et at., 1996 ; MosseLman et at., 1996). Ces deux sous types de récepteurs sont distincts du point de vue de Leur distribution dans Les tissus et de Leurs rôLes physioLogiques (Couse et at., 1997 ; Kuiper et at., 1997) mais interagissent tous avec L'oestradioL. Le récepteur ER a est Largement distribué dans tous Les tissus de reproduction et a été Le premier à être identifié.

Le récepteur ER B a été identifié un peu pLus tard (Kuiper et at., 1996). Chez La souris, Les ER B ont une pLus grande expression dans Les ovaires, L'utérus, Les poumons, Les neurones. Cependant, dans tous ces tissus exceptés L'ovaire, Les récepteurs ER a sont Les pLus abondants et s'expriment Le pLus (Couse et at., 1997). Des études sur Les humains ont montré une transcription des récepteurs ER B dans Les seins, Les ovaires, Les testicuLes, Le thymus, Les intestins et Les reins (Enmark et at. , 1997).

3. Biosynthèse des oestrogènes et de la progestérone

La progestérone et Les oestrogènes sont des hormones stéroïdiennes synthétisées Lors de La stéroïdogénèse. Les différentes étapes de Le stéroïdogénèse partent du choLestéroL et font intervenir Le cytochrome P450 qui convertit Le choLestéroL en prégnènoLone. La coupure de La chaîne LatéraLe de La prégnènoLone et de La progestérone est assurée par Le cytochrome P450C17. Un troisième cytochrome, Le P450 aromatase (P450aro) assure La conversion des androgènes (Androstenédione et La testostérone) en oestrogènes. Le P450aro est situé comme tous Les autres cytochromes dans Le réticuLum endopLasmique. L'aromatisation comporte deux hydroxyLations du méthyLe C-19 et une hydroxyLation sur Le C-3, suivie de La perte du carbone 19 (Figure 7).

Les sources du choLestéroL pour Les ceLLuLes stéroïdiennes sont assurées par Les esters du choLestéroL véhicuLés par Les Lipoprotéines de basse densité (L.D.L) et très faibLement par Les Lipoprotéines de haute densité (H.D.L).

4. Stéroïdogénèse ovarienne

Les ceLLuLes stéroïdiennes du foLLicuLe ovarien sont : Les ceLLuLes de La thèque interne et Les ceLLuLes de La granuLosa. Les ceLLuLes de La granuLosa dépourvue de P450C17, ne peuvent pas synthétiser Les androgènes précurseurs des oestrogènes. Les ceLLuLes de La thèque peuvent assurer La conversion du choLestéroL en progestérone et en testostérone. ELLes possèdent un récepteur de La LH qui stimuLe La conversion du choLestéroL en prégnènoLone. Les ceLLuLes de La granuLosa importent Les androgènes thécaux pour synthétiser Les oestrogènes et eLLes possèdent un récepteur de La FSH qui joue un rôLe essentieL dans Le contrôLe de L'activité aromatase.

La stéroïdogénèse ovarienne n'est pas La seuLe voie de production des stéroïdes sexueLs. IL existe une production extragonadique à partir de précurseur de stéroïdes. L'Androstenédione peut être converti en testostérone par divers organes teLs Le foie, La peau, La prostate, Les gLandes surrénaLes.

5. Régulation et action des oestrogènes et de la progestérone sur l'axe hypothalamo-hypophysaire

Les neurones de L'hypothaLamus sécrètent une neuro-hormone, La GnRH (Gonadotrophin ReLeasing Hormone). La GnRH est véhicuLée par Le système porte hypothaLamo-hypophysaire de L'hypothaLamus à L'hypophyse antérieure ou adénohypophyse. ELLe stimuLe La sécrétion de deux hormones par Les ceLLuLes endocrines gonadotropes de L'adénophypophyse, La FSH et La LH qui sont véhicuLées dans L'organisme par La circuLation sanguine. Chez La ratte ovariectomisée, iL est observé in vivo une augmentation de 5 à 10 fois Le niveau de LH et de FSH. Mais une injection d'un antagoniste de GnRH supprime Les effets de La castration (Counis et at., 2001).

La FSH et La LH à Leur tour stimuLent Les ceLLuLes endocrines de L'ovaire. Ces ceLLuLes sécrètent deux types d'hormones que sont Les oestrogènes et La progestérone. Ces deux hormones ovariennes, véhicuLées par La circuLation sanguine agissent au niveau de divers organes cibLes et permettent La réaLisation de La fonction de reproduction ( Figure 8).

Les oestrogènes et La progestérone agissent en rétroaction au niveau de L'hypothaLamus et de L'hypophyse.

Durant La phase foLLicuLaire, La fréquence de GnRH augmente progressivement. Ceci conduit à une Légère augmentation de La sécrétion de FSH et de LH et ainsi à une

hausse de La sécrétion d'oestrogènes. Cette hausse exerce une rétroaction positive sur L'axe hypothaLamo-hypophysaire induisant une forte stimuLation des sécrétions de GnRH, FSH et de LH conduisant à un pic de LH très important et dans La moindre mesure à un pic de FSH. Le pic de LH a pour conséquence Le décLenchement de L'ovuLation.

Durant La phase Lutéinique, Le foLLicuLe ovarien transformé en corps jaune produit de La progestérone. Cette hormone exerce une rétroaction négative sur L'axe hypothaLamo-hypophysaire réduisant ainsi La sécrétion de GnRH, FSH et de LH. Dans Le même temps, La synthèse d'oestrogènes par L'ovaire diminue, retrouvant ainsi un rôLe de rétroaction négative. IL faut donc remarquer que Les sites de La rétroaction positive de L'oestradioL sont à La fois hypothaLamique (induction d'un pic de Libération de GnRH) et hypophysaire. Chez un singe présentant une Lésion hypothaLamique affectant La Libération de GnRH, L'administration d'oestradioL induit un pic de gonadotrophines simuLés au pic préovuLatoire. Cette action positive de L'oestradioL passerait en partie par une augmentation du nombre de récepteurs à GnRH (Counis et at., 2001).

6. Rôle des stéroïdes ovariens dans la décidualisation

L'ensembLe du processus de L'impLantation du bLastocyste ne peut avoir Lieu sans une action préaLabLe des oestrogènes et de La progestérone sur L'utérus. La réaction déciduaLe n'est observée qu'après L'action de L'oestradioL sur La muLtipLication ceLLuLaire et ceLLe de La progestérone sur La différenciation ceLLuLaire. Le déciduaLisation se met en pLace à chaque cycLe sexueL et dépend principaLement du taux sanguin d'oestrogènes et de progestérone. La montée pré-ovuLatoire des oestrogènes assure La mise en pLace des récepteurs à La progestérone, hormone indispensabLe à La mise en pLace de La décidue. L'action des oestrogènes se caractérise par une proLifération importante des ceLLuLes épithéLiaLes et L'action de La progestérone par une augmentation des ceLLuLes du stroma. De ce fait, La préparation hormonaLe de L'utérus à La déciduaLisation nécessite fortement La présence de La progestérone (Hewitt et at., 2002). Chez La ratte, La métamorphose déciduaLe est possibLe avec Le seuL apport de La progestérone. Sa réaLisation dépend cependant de L'intensité du stimuLus inducteur. Cependant L'apport oestrogénique est capitaL car, iL permet d'assurer un degré de sensibiLité nécessaire de L'utérus pour La déciduaLisation, évitant ainsi une traumatisation importante de L'animaL.

Figure 8: Régulation des hormones hypophysaires et ovariennes et mécanismes de rétroaction des oestrogènes et de la progestérone sur l'axe hypothalamo-hypophysaire.

Matériel et Méthodes

1. Echantillonage

Les feuiLLes de H. floribunda sont récoLtées entre 7 heures et 9 heures du matin, à GampeLa, une LocaLité située à 25 km à L'est de La viLLe de Ouagadougou. Les récoLtes se font en fin de saison pLuvieuse dans La période de septembre à octobre où La pLante a encore Les feuiLLes toutes vertes et porte encore ses fruits.

La reconnaissance de La pLante s'est faite au Laboratoire de Botanique du C.N.R.S.T où se trouve un spécimen authentifié. Les feuiLLes sont ensuite Lavées à grande eau et séchées sous ventiLation artificieLLe à L'abri du soLeiL et de La poussière à une température ambiante de 30°C et une humidité reLative de 45% . ELLes sont broyées et La poudre est sceLLée dans des sachets pLastiques. Deux sorties de récoLtes se sont effectuées, respectivement en 2000 et 2003.

2. Extractions réalisées pour l'étude

Pour chaque échantiLLon de végétaL récoLté, trois(3) méthodes d'extraction sont effectuées : La macération, La décoction et L'infusion. Pour chaque méthode, 25 g de poudre sont préLevés et homogénéisés avec 500 mL d'eau distiLLée dans des béchers soigneusement couvert avec du papier aLuminium pour protéger La préparation contre La Lumière.

La macération et La décoction se sont effectuées pendant 24 heures respectivement à température ambiante (30-35°C) et à 60°C. L'infusion s'est dérouLée pendant deux (2) heures à une température d'ébuLLition de L'eau fixée à 100°C. Chaque extrait est ensuite fiLtré avec du papier fiLtre puis centrifugé à 35.000 trs/mn pendant 30 minutes. Les surnageants sont préLevés et LyophiLisés pendant trois(3) jours. La LyophiLisation donne une poudre jaune d'odeur piquante. Les rendements d'extraction des deux récoLtes sont résumés dans Le tabLeau V.

Tableau V : Rendement des différentes préparations après La LyophiLisation

3. Animaux d'étude

Les animaux d'étude utiLisés sont des rattes Wistar et des souris SWISS NMRI femeLLes. ILs sont soumis à un rythme nycthéméraL de 12 heures d'écLairement (6h30 à 18h30) et 12 heures d'obscurité. La température moyenne dans L'animaLerie est maintenue à 22 #177;3 °C et L'humidité reLative à 50 #177; 10 %. Les animaux sont nourris avec des granuLés et ont Libre accès à L'eau de boisson.

4. Opérations chirurgicales

4.1 Les ovariectomies

Les animaux devant servir au test de L'activité progestative et oestrogénique subissent une ovariectomie biLatéraLe.

Avant Les ovariectomies, Les animaux sont mis sous anesthésie généraLe à La kétamine (CLorkétam 1000 ; 10 mg/kg). L'animaL est immédiatement posé en décubitus ventraL, Les ovaires sont sectionnés après ouverture de La peau et du péritoine au niveau des fLancs droit et gauche. Le péritoine est recousu avec du fiL de suture (fLexidèLe) non résorbabLe. La peau est refermée à L'aide d'agrafes et une asepsie est réaLisée à La teinture d'iode au niveau de La zone opératoire. Deux semaines après Les ovariectomies, Les souris ou Les rattes sont utiLisées pour Les différentes expérimentations.

4.2 L'instillation

Les souris ovariectomisées pour Le test de L'activité progestative subissent une instiLLation intra-utérine au niveau de La corne utérine droite.

Les souris sont mises sous anesthésie généraLe à La kétamine (CLorkétam 1000 ; 10 mg/kg) et sont pLacées en décubitus ventraL. Le côté droit de La souris est ouvert et L'utérus est repéré par Le fiL de suture non résorbabLe utiLisé pendant Les ovariectomies. L'utérus est retiré à L'aide d'une pince fine, et iL y est injectée 20 uL d'huiLe de Laboratoire (Peanut oiL, SIGMA). L'utérus est ensuite remis à L'intérieur et Le péritoine est resuturé avec du fLexidèLe. La peau est ensuite suturée avec des agrafes et La zone d'opération aseptisée avec de La teinture d'iode. La figure 9 ci-dessous montre L'instiLLation d'huiLe d'arachide de Laboratoire dans La corne droite de L'utérus d'une souris.

Figure 9: Instillation de l'huile d'arachide de laboratoire dans la corne utérine

5. Dosage de la progestérone par Chromatographie Liquide Haute

Performance (HPLC) dans les extraits de H. floribunda et par radioimmunologie (RIA).

La recherche de La progestérone dans Les feuiLLes de H. floribunda , par HPLC et RIA s'est réaLisée sur Les trois modes de préparation : macéré, décocté et infusé. La forme présentant L'extraction La pLus importante de progestérone a été utiLisée pour Les tests bioLogiques.

5.1 Dosage de la progestérone par HPLC

5.1.1 Principe

La HPLC est une technique d'anaLyse chromatographique permettant La séparation des moLécuLes seLon Leurs propriétés physico-chimiques. Pour La séparation, Les moLécuLes sont soumises à une force de rétention exercée par La phase stationnaire et une force éLuante due à La phase mobiLe. Les moLécuLes sont caractérisées par un temps de rétention (RT) et sont éLuées pLus ou moins rapidement seLon Leur affinité avec La phase mobiLe et La phase stationnaire.

La chaîne HPLC utiLisée pour Le dosage de La progestérone est équipée d'un mode d'injection manueLLe avec une vanne rhéodyne, d'une pompe Waters 600^E et d'un détecteur à barrettes de diodes (Waters 996, Photodiode Array Detector). Le LogicieL MiLLenium³² (Waters) permet de piLoter L'ensembLe de La chaîne et de réaLiser L'acquisition des données.

Pour L'anaLyse des extraits de H. floribunda, La phase mobiLe utiLisée est un méLange de soLvant acétonitriLe-eau (70 : 30 ; v/v), Le débit d'éLution appLiqué est de 0,5 mL/mn.

Les échantiLLons sont éLués à travers une coLonne de siLice apoLaire greffée de chaîne C18 (CoLonne Lichtospher RP 18 ; 250×4 (i.d 5 pm). A La sortie de La coLonne, La progestérone est détectée à une Longueur d'onde de 245 nm.

5.1.2 Temps de rétention et courbe étalon de la progestérone

IL a été dans un premier temps anaLysé par HPLC des soLutions standards de progestérone et d'autres métaboLites afin de déterminer Le temps de rétention de La

progestérone dans Les conditions d'anaLyses et de pouvoir ensuite identifier et quantifier La progestérone de nos extraits.

Les métaboLites utiLisés sont La testostérone, La 17-á-hydroxyprogestérone, La 4- androstène-3, 17-dione et La prégnénoLone.

Dans Les conditions d'anaLyse, Le temps de rétention de La progestérone est situé autour de 13,83 minutes, pour un débit d'éLution de 0,5 mL/min. IL faut cependant noter qu'iL y a eu une variation du temps de rétention de La progestérone au cours de L'expérimentation dû à des probLèmes de variation de La température ambiante et de surpression sur Le système HPLC. Pour La confirmation du temps de rétention, iL a été anaLysé à pLusieurs reprises au cours de La journée La soLution standard de La progestérone.

La figure 10 représente Le chromatogramme du temps de rétention auqueL apparaît La progestérone.

Les soLutions standards de progestérone sont préparées dans du méthanoL pour donner une gamme de soLution de 500, 50, 5 et 0,5 ìg/mL. Vingt cinq (25) ìL de chaque

soLution standard ainsi constitué sont injectés et pour chaque échantiLLon La surface du pic obtenu est proportionneLLe à La quantité de progestérone qui y est contenue. CeLa a

permis de construire La courbe étaLon suivant La reLation surface des pics/concentration en progestérone. Cette courbe étaLon servira par La suite à déterminer Les concentrations de La progestérone dans Les extraits de H. floribunda. La figure 11 indique La courbe étaLon et L'équation de La courbe.

Figure 11 : Droite de régression de la courbe étalon de la progestérone : relation surface du pic/concentration

5.1.3 Dosage de la progestérone dans les extraits de H. floribunda

Pour Le dosage de La progestérone dans Les fractions de H. floribunda, 50 mg de LyophiLisât de chaque extrait sont dissous dans un méLange de méthanoLdichLorométhane (11 : 2 ; v/v). Vingt cinq (25) ìL de chaque extrait ainsi constitué sont injectés et La détection de La progestérone s'est faite à 245 nm.

Pour être certain du temps de rétention auqueL apparaît La progestérone des extraits, Les différents extraits ont été enrichis avec de La progestérone pure. L'enrichissement s'est réaLisé avec une soLution standard de progestérone à 0.5 ìg/mL, dans Les proportions suivantes : 50/50 , V/V , extrait/progestérone.

La courbe d'étaLonnage (reLation surface de pic/concentration) étabLie à partir de La soLution standard de progestérone nous permet de caLcuLer La concentration de progestérone dans Les extraits à anaLyser.

5.2 Dosage de la progestérone par RIA.

5.2.1 Principe

Le dosage RIA repose sur La compétition entre une hormone et de sa forme non marquée avec un anticorps spécifique seLon La Loi d'action des masses. La forme de L'hormone qui se trouve en prépondérance dans Le miLieu réactionneL se Lie Le pLus à L'anticorps.

Dans Les extraits de pLante, La progestérone est extraite avant d'être dosée par radioimmunoLogie. L'hormone est mise en compétition avec L'hormone marquée au tritium pour se Lier à un anticorps anti-progestérone. Lorsque L'équiLibre est atteint, Les compLexes hormone-anticorps sont immuno-précipités puis séparés par évaporation (Saumande et al., 1985).

5.2.2 Construction de la courbe étalon

Les points de gamme sont dosés en quadripLicate et Les échantiLLons en dupLicate. La gamme de progestérone pure en ng/tube est La suivante : 0,025 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,8 ; 1,6 ; 3,2.

La figure 12 représente La courbe étaLon du dosage de La progestérone par RIA.

5.2.2 Récupération des fractions par HPLC

Cinquante (50) ìL de chaque extrait à doser en RIA sont injectés en HPLC et anaLysés seLon Les conditions décrites précédemment. Pour chaque extrait, à La sortie du détecteur à barrette de diodes, La phase mobiLe est récupérée pendant toute La durée de L'anaLyse, par fraction de 300 ìL (tube/300ìL/30s). La coLLecte est réaLisée dans des tubes en verre de 5 mL. L'ensembLe des fractions obtenues est ensuite évaporé à sec au Speed-vac pendant une(1) heure à 45°C. A partir de ces fractions évaporées, Le dosage RIA est réaLisé.

5.2.3 Dosage RIA des fractions récupérées par HPLC

Dans chacun des tubes contenant 50 ìL des fractions récupérées, on ajoute 50 ìL de La progestérone marquée au tritium ³H (³H-progestérone). Le miLieu réactif est homogénéisé par agitation au vortex puis L'incubation se fait en une nuit à 4°C.

La progestérone marquée et La progestérone à doser entrent en compétition pour se Lier à L'anticorps spécifique. Le compLexe antigène-anticorps est précipité par L'addition d'un deuxième anticorps spécifique au premier (anticorps anti-anticorps de La progestérone). Ensuite on centrifuge et on éLimine Le surnageant qui contient de La progestérone Libre, on détermine au compteur Gama, La quantité d'hormone marquée fixée par détermination de La réactivité du compLexe, en coups par minutes (cpm).

La courbe étaLon réaLisée au préaLabLe permet par extrapoLation de connaître La concentration en progestérone dans Les fractions récupérées. Les concentrations d'anticorps et d'hormones marquées présentes dans Les échantiLLons sont constantes. SeuLes Les concentrations d'hormones non marquées varient.

6. Evaluation de la toxicité générale aiguë du macéré aqueux des feuilles

de H. floribunda

6.1 Test de la toxicité générale aiguë.

La toxicité généraLe aiguë a été évaLuée à travers L'évaLuation de La dose LétaLe 50 (DL50) chez La souris SWISS femeLLe. Ce test a été réaLisé seLon La méthode de LichtfieLd et WiLcoxon (1949). Vingt quatre heures avant L'administration des extraits, Les souris sont mises à jeun et 10 heures avant, eLLes sont privées d'eau de boisson. Une

(1) heure après L'administration des extraits, Les souris sont re-aLimentées en eau et en nourriture.

Les administrations se font en dose unique par voie sous-cutanée et Les différentes observations sont réaLisées après 1 heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures.

Le test s'est dérouLé en deux étapes : (i) une première étape préLiminaire, qui a consisté à déterminer La fourchette de doses à tester. Neuf (9) doses, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 mg/kg de LyophiLisat des extraits de poudre ont été testés. Chaque dose a été injectée à un Lot de trois (3) souris. La fourchette est fixée par La pLus forte dose entraînant 0% de mortaLité et La pLus petite dose entraînant 100% de souris mortes ; (ii) une seconde étape qui se base sur La fourchette de doses arrêtées par Le test préLiminaire. PLusieurs doses par Lot de six (6) souris sont retenues pour La détermination de La DL50. Les souris sont égaLement mises à jeun et 10 heures avant, eLLes sont privées d'eau. L'administration des doses se fait par kiLogramme de poids corporeL en dose unique par voie sous-cutanée et Les différentes observations sont réaLisées après 1 heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures.

Les vaLeurs de DL1, DL5, DL50, DL95 et DL99 seront déterminées grâce au LogicieL PHARM/PCS.

La vaLidation du test sera confirmé par L'égaLité des rapports DL5/DL50 et DL50/DL95.

6.2 Observations des signes cliniques et autopsie des organes.

Juste après L'injection des extraits, Le comportement généraL des souris (mobiLité, excitation, agitation, aLimentation), La couLeur des yeux, des poiLs, des pattes et du museau sont notées.

Les souris ayant survécu après Les 72 heures d'observations, sont abattues par décapitation quatre (4) jours après. Le foie, Les poumons, La rate, Les reins et Le coeur sont préLevés, examinés macroscopiquement et pesés. Les souris qui sont mortes avant Les 72 heures d'observation ont égaLement été autopsiées et Les organes précédemment cités sont préLevés et pesés.

7. Recherche de l'activité progestative du macéré aqueux des feuilles

de H. floribunda

La recherche de L'activité progestative a été réaLisée par La mise en évidence de La réaction déciduaLe seLon La méthode de Finn et Martin (1972). L'étude a consisté dans

un premier temps à rechercher La forme de soLubiLité de La progestérone (LiposoLubLe ou hydrosoLubLe) et Le temps d'administration optimum de La progestérone qui mettent nettement en évidence La réaction déciduaLe par L'apparition de sites d'impLantation des bLastocystes. Et dans un second temps de rechercher L'activité progestative et/ou antiprogestative des extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda.

7.1 Recherche de la solubilité appropriée de la progestérone (liposoluble et

hydrosoluble) et du temps optimum d'administration (4 jours et 7 jours)

Deux formes de progestérone, La progestérone LiposoLubLe et La progestérone hydrosoLubLe sont utiLisées afin de retenir La forme La pLus active pour Les tests uLtérieurs. Pour ces deux formes de progestérone, des traitements de quatre (4) jours et de sept (7) jours de durée sont arrêtés afin de choisir Le temps optimum d'induction de La réaction déciduaLe.

7.1.1 Traitement de quatre (4) jours avec la progestérone liposoluble et la progestérone hydrosoluble.

Pour La durée de traitement de quatre(4) jours, on a constitué trois(3) Lots de dix(10) souris:

Le premier jour de L'administration des substances est désigné comme J1. Pendant 3 jours consécutifs (J1, J2, J3), Les souris reçoivent 0,1 mL de 17-â oestradioL à 10 ìg/mL (SIGMA, France) par voie sous cutanée. Ce traitement permet La préparation de L'utérus à répondre aux hormones impLiquées dans L'impLantation des embryons.

Le traitement est ensuite suspendu pendant Les 2 jours suivants (J4 et J5) qui correspondent à La période de L'oestrus vaginaL. Aux jours J6, J7 et J8, on réaLise quotidiennement, en pLus des 0,1 mL d'oestradioL 17- â (à 1 mg/mL), une injection de 0,1 mL de progestérone LiposoLubLe (à 1 mg/mL) (SIGMA, France) pour Le Lot II et hydrosoLubLe pour Le Lot III.

Dans L'après midi de J8, période théoriquement de sensibiLité maximaLe de L'utérus (Hetherington, 1968), iL est procédé à une instiLLation intra-utérine (sous anesthésie généraLe à La kétamine) de 20 ìL d'huiLe d'arachide dans La corne droite de L'utérus (Enders et Given, 1977). La corne gauche étant considérée comme témoin, eLLe ne reçoit pas d'huiLe d'instiLLation mais est sujette aux mêmes manipuLations et traitements que La corne opposée. La présence d'huiLe dans La cavité utérine mime La présence de L'embryon et induit par conséquent La réaction déciduaLe.

Au neuvième jour (J9), iL est administré à chaque sujet, 0,1 mL de progestérone LiposoLubLe (à 1 mg/mL) pour Le Lot II et 0,1 mL de progestérone hydrosoLubLe (à 1 mg/mL) pour Le Lot III.

A J10, Les souris sont sacrifiées par disLocation cervicaLe et iL est procédé aux différents examens et observations. A cet effet, iL est apprécié La perméabiLité de La muqueuse utérine et L'accroissement du poids utérin. Pour La perméabiLité ou La présence de sites d'impLantation, iL est injecté de manière intraveineuse (au niveau du coin de L'oeiL), 150 ìL du "CHICAGO SKY BLUE 6B" (Sigma, France) après anesthésie généraLe à La kétamine (CLorkétam 1000 ; 10 mg/kg). Grâce à La diffusion du coLorant dans Le tissu utérin, on visuaLise directement La perméabiLité vascuLaire par L'apparition de spots bLeus simiLaires à des sites d'impLantation des embryons. Dix (10) minutes après, Les souris sont sacrifiées par disLocation cervicaLe, puis L'utérus est préLevé et pesé. IL est compté Le nombre de sites d'impLantation dans La corne instiLLée. La corne instiLLée et La corne non instiLLée sont séparées et pesées. La différence de poids entre ces deux cornes donne Le poids du déciduome. Le protocoLe d'administration est consigné dans Le tabLeau VI.

Tableau VI : Protocole d'administration de la progestérone liposoluble et hydrosoluble pendant une période de quatre(4) jours.

Lots	n				Jours de traitement
		J1	J2	J3	J4 J5 J6	J7	J8	J9	J10
I: témoin	10	ED	ED	ED	- - ED	ED	ED(i)	ED	K	II: P4, lipo
10	E	E	E	- - P4+e	P4+e	P4+e(i)	P4	K	III: P4, hydro
10	E	E	E	- - P4+e	P4+e	P4+e(i)	P4	K

ED : eau distillée ; E : oestradiol à 10 ìg/ml; e : oestradiol à 1 ìg/ml ; P4, lipo : progestérone liposoluble ; P4, hydro :progestérone hydrosoluble ; K autopsie ; i: instillation

7.1.2 Traitement de sept (7) jours avec la progestérone liposoluble et la progestérone hydrosoluble.

Pour La durée de traitement de sept (7) jours, iL est constitué égaLement trois (3) Lots de dix (10) souris.

Le protocoLe d'administration résumé dans Le tabLeau VII, est Le même que précédemment sauf que La durée de traitement de La progestérone est proLongée à sept (7) jours.

A J6, J7, J8, J9, J10, J11, J12 on réaLise quotidiennement, en pLus des 0,1 mL d'oestradioL 17-â (à 1 ìg/mL), une injection de 0,1 mL de progestérone (à 1 mg/mL) LiposoLubLe pour Le Lot II et hydrosoLubLe pour Le Lot III.

L'instiLLation se fait toujours dans L'après midi de J8, période de sensibiLité maximaLe de L'utérus. A J13, Les souris sont sacrifiées et on procède aux différents examens et observations.

Le tabLeau VII, décrit Le protocoLe d'administration de La progestérone LiposoLubLe et La progestérone hydrosoLubLe pendant une période de sept (7) jours.

Tableau VII : Protocole d'administration de la progestérone liposoluble et hydrosoluble pendant une période de sept(7) jours.

Lots

Jours de traitements

J3 J4

J5 J6

J10

J11

J12

J13

I: témoin

10

ED

ED -

- ED

ED

ED(i)

ED

K

II: P4, lipo

10

E

E -

- P4+e

P4+e

P4+e(i)

P4+e

P4

K

III: P4, hydro

E -

- P4+e

P4+e

P4+e(i)

P4+e

ED : eau distillée ; E : oestradiol à 10ìg/ml; e : oestradiol à 1 ìg/ml ; P4, lipo : progestérone liposoluble ; P4, hydro :progestérone hydrosoluble à ; K autopsie ; i : instillation

7.2 Recherche d'une activité progestative du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda.

La recherche de L'activité progestative de H. floribunda, a consisté à substituer de La progestérone pure par L'extrait aqueux de La pLante dans Le protocoLe expérimentaL. Trente (30) souris femeLLes aduLtes, ovariectomisées depuis quinze (15) jours pesant en moyenne 31,40 #177; 1,73 g sont réparties en 5 Lots de 6 individus chacun en sorte de minimiser Les différences de poids moyens entre Les Lots. La préparation des différentes doses de H. floribunda est réaLisée extemporanément dans de L'eau distiLLée et L'administration se fait par voie sous cutanée. Les cinq (5) Lots reçoivent respectivement 0 (ED), 50, 100, 200 et 400 mg/kg de L'extrait aqueux de H. floribunda. Le protocoLe d'injection des différentes substances est consigné dans Le tabLeau VIII.

L'activité progestative se traduirait par une augmentation du poids de L'utérus du à L'apparition du déciduome et des spots simiLaires à des sites d'impLantation des bLastocystes.

7.3 Recherche d'une activité anti-progestative du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda

La recherche de L'activité anti-progestative a consisté à L'administration simuLtanée des différentes doses de H. floribunda et de La progestérone. Deux semaines après avoir été ovariectomisées, 30 souris de poids moyen 32,26 #177; 0,54 g, sont réparties en cinq (5) Lots de 6 souris chacun. Les cinq (5) Lots reçoivent en pLus des 0,1 mL de progestérone pure respectivement 0, 50, 100, 200 et 400 mg/kg d'extrait de H. floribunda. Le protocoLe d'injection est consigné dans Le tabLeau IX.

L'activité anti-progestative, se traduirait par une baisse du poids de L'utérus avec absence de déciduome et des spots bLeus simiLaires à des sites d'impLantation des bLastocystes.

Tableau VIII : Protocole d'administration des produits pour la recherche de l'activité progestative

Lot	n				Jours de traitement
Lot	n	J1	J2	J3	J4 J5 J6	J7	J8	J9	J10
I(0 mg/kg)	6	E	E	E	- - H0+e	H0+e	H0+e(i)	H0	K
II (50 mg/kg)	6	E	E	E	- - H1+e	H1+e	H1+e(i)	H1	K
III (100 mg/kg)	6	E	E	E	- - H2+e	H2+e	H2+e(i)	H2	K
IV(200 mg/kg)	6	E	E	E	- - H3+e	H3+e	H3+e(i)	H3	K
V(400 mg/kg)	6	E	E	E	- - H4+e	H4+e	H4+e(i)	H4	K

n: nombre de souris ; E = 10 ug/ml d'oestradiol; e = 1ug/ml d'oestradiol ; K = autopsie

i : instillation de 20 ul d'huile d'arachide dans la corne droite de l'utérus.

H0 : 0 mg/kg de H. floribunda ; H1 : 50 mg/kg de H. floribunda ; H2 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H3 : 200 mg/kg H. floribunda H4 : 400 mg/kg de H. floribunda

Tableau IX : Protocole d'administration des produits pour la recherche de l'activité anti-progestative

Lot	n				Jours de traitement
Lot	n	J1	J2	J3	J4 J5 J6 J7	J8	J9	J10
I(0 mg/kg)	6	E	E	E	- - P+e P+e	P+e(i)	P	K
II (50 mg/kg)	6	E	E	E	- - P4+H1+e P4 +H1+e	P4+H1+e(i)	P4+H1	K
III (100 mg/kg)	6	E	E	E	- - P4+H2+e P4+H2+e	P4+H2+e(i)	P4+H2	K
IV(200 mg/kg)	6	E	E	E	- - P4+H3+e P4+H3+e	P4+H3+e(i)	P4+H3	K
V(400 mg/kg)	6	E	E	E	- - P4+H4+e P4+H4+e	P4+H4+e(i)	P4+H4	K

n : nombre de souris; E = 10 ug/ml d'oestradiol; e = 1 ug/ml d'oestradiol ; P4 : 1mg/ml de progestérone ; K = autopsie ; i : instillation de 20 ul d'huile d'arachide dans la corne droite de l'utérus.

8. Recherche de l'activité oestrogénique du macéré aqueux des

feuilles de H. floribunda

La recherche de L'activité oestrogénique s'est réaLisée par des tests utérotrophiques. Des rattes wistar impubères ovariectomisées et non ovariectomisées ont été utiLisées pour ce test.

8.1 Recherche de l'activité oestrogénique sur la ratte impubère

ovariectomisée

Les ovariectomies se sont dérouLées à 21 jours d'âge sous anesthésie généraLe à La kétamine. Quinze (15) jours après Les ovariectomies, Les rattes sont réparties en 7 Lots de 6 chacun en sorte de minimiser La différence de poids vif moyen entre Les Lots. Les traitements se présentaient ainsi qu'iL suit :

Les différentes doses de H. floribunda sont préparées extemporanément dans de L'eau distiLLée et sont administrées par voie sous-cutanée par kiLogramme de poids corporeL. La soLution mère de 17- B - oestradioL (SIGMA, France) est d'abord préparée dans de L'aLcooL absoLu avant d'être diLuée dans L'huiLe d'arachide. L'injection du 17- B -oestradioL se fait par voie sous cutanée par kiLogramme de poids corporeL. La durée du traitement est de sept (7) jours consécutifs.

Pour Les Lots 6 et 7, L'oestradioL est injecté avant que Les extraits de La pLante ne soient administrés. Ces Lots ont été constitués pour étudier La reLation qui pourrait exister entre L'extrait de La pLante et Le 17- B -oestradioL.

8.2 Recherche de l'activité oestrogénique sur la ratte entière

La recherche a porté sur des rattes de race wistar, impubères et d'âge moyen de 40 jours. Cinq (5) Lot de six 6) rattes ont été constitués et Les traitements suivants ont été effectués.

La durée des traitements est de 7 jours consécutifs et La voie d'administration

est La voie sous cutanée. Le cLomid ou citrate de cLomifène (SIGMA, France) est un antioestrogénique.

8.3 Les paramètres d'étude de l'activité oestrogénique.

8.3.1 Paramètres pondéraux

Les animaux sont d'abord pesés avant La première administration des produits et des extraits. La seconde pesée est faite Le Lendemain du dernier jour de traitement. Vingt quatre (24) heures après Le dernier traitement, après La pesée, Les rattes sont sacrifiées par disLocation cervicaLe. Immédiatement après, L'ovaire, L'utérus, Les gLandes surrénaLes sont soigneusement préLevés, séparés des adhérences adipeuses et pesés séparément à L'aide d'une baLance de type Sartorius de 500 g de portée (précision : 5%). L'utérus est ensuite pLacé à L'étuve pendant 24 heures à 100°C et pesé à nouveau pour obtenir Le poids sec de L'organe.

8.3.2 Observation de l'ouverture de l'orifice vaginale

Chaque matin à heure fixe, entre 8 heure et 8 heure 30 minutes du matin durant Les 7 jours de traitement, Les femeLLes présentant une ouverture du méat vaginaL sont dénombrées. Ce nombre est rapporté à La dose des produits administrés dans chaque Lot.

8.3.3 Paramètres biochimiques

Les cornes utérines ou Les ovaires après pesée sont broyés finement à L'aide d'un potter dans une soLution physioLogique de NaCL à 0,9%. Le broyât est centrifugé à 4000 trs/mn pendant 15 minutes. Le surnageant est recueiLLi dans des tubes de 1,5 mL et pLacé au congéLateur à - 4°C pour Les différents dosages biochimiques. Les paramètres à doser sont Les protéines totaLes, Le choLestéroL et Le gLucose.

Les protéines ont été dosées par La méthode de Zor et SeLinger(1996). Le dosage est basé sur L'interaction en miLieu acide, entre Les protéines et Le coomassie briLLant bLeu.

Cent (100) uL du broyât d'utérus ou de L'ovaire + 5 mL du réactif BIORAD ^TM est vortexé et Laissé pendant 10 mn à 37°C. La coLoration est stabLe pendant 30 minutes. ParaLLèLement une gamme étaLon de La sérumaLbumine bovine (BSA) est traitée ainsi qu'un bLanc. Le principe de La réaction est basé sur Le changement d'absorbance (620 à 465 nm) d'une soLution acide de bLeu de coomassie en présence de protéine. Le rapport A620/A465nm est caLcuLé pour chaque échantiLLon. La concentration en protéines des échantiLLons a été caLcuLée à L'aide d'une courbe étaLon réaLisée avec Le Sérum ALbumine Bovine (BSA). La figure 13 représente La courbe étaLon de dosage des protéines totaLes.

Figure 13 : Courbe étalon de dosage des protéines totales 8.3.3.2 Dosage de La teneur en gLucose

Le gLucose a été dosé seLon La méthode enzymatique de La gLucose oxydase. La gLucose oxydase est une enzyme trouvée dans Les miLieux de cuLture de Penicillium notatum qui cataLyse L'oxydation du á-D-gLucopyranose en D-gLuco-1, 5-Lactone, avec formation de pyroxyde d'hydrogène. La Lactone est ensuite Lentement hydroLysée en acide D-gLuconique. La peroxydase incorporée dans Le miLieu réactionneL cataLyse La réaction de L'eau oxygénée avec Le chromogène ABTS (2,2'-azino-di-(3- éthyLbenzthiazoLine)-6-suLfonate).

Une quantité de 0,1 mL de broyats d'utérus ou d'ovaire à doser est ajouté dans 1,8 mL de La soLution de suLfate de sodium-suLfate de zinc (diLuer 55 mL de La soLution de suLfate de zinc dans 1 Litre avec La soLution de suLfate de sodium) dans un tube à centrifuger. On additionne au tout 0,1 mL de soude à 0,5 moL/L puis on centrifuge. 0,5 mL de surnageant est ensuite préLevé en doubLe. Pour Le témoin bLanc prendre 0,5 mL d'eau distiLLée. UtiLiser 0,5 mL de La gamme de diLution du gLucose. Ajouter 5 mL du réactif à La gLucose oxydase, incuber pendant 1h à 37°C et Lire L'absorbance à 505 nm contre Le témoin bLanc. La concentration en gLucose des échantiLLons a été caLcuLée à L'aide d'une courbe étaLon réaLisée avec une gamme de concentration du gLucose. La figure 14 représente La courbe étaLon de dosage du gLucose.

Le choLestéroL a été dosé seLon La méthode de Liebermann-Burchard. L'anhydrite acétique réagit avec Le choLestéroL en soLution chLoroformique pour donner un dérivé de couLeur bLeu-vert caractéristique. Le choLestéroL ainsi que d'autres Lipides sanguins ou pLasmatiques, sont extraits par un méLange aLcooL-cétone, tandis que Les protéines précipitent.

Dix (10) mL d'un méLange aLcooL-cétone (1 : 1 ; v/v) et 0,2 mL de broyât d'utérus ou d'ovaire sont mis dans un tube à centrifuger. Le tube est immergé dans un bain-marie bouiLLant et agité jusqu'à ce que Le soLvant commence à bouiLLir. Le tube est ensuite retiré et agité pendant 5 minutes. IL est Laissé à température ambiante pour refroidissement, puis centrifugé. Le surnageant est décanté dans un tube à essai et évaporé à sec dans un bain-marie bouiLLant. IL est ensuite refroidi et Le résidu est dissous dans 2 mL de chLoroforme. IL est ajouté 2 mL de La soLution d'anhydrite acétique et d'acide suLfurique (30:1; v/v) dans tous Les tubes et Le tout est méLangé soigneusement. Les tubes sont Laissés dans L'obscurité et à température ambiante puis L'absorbance est Lue à 680 nm. Les concentrations en choLestéroL totaL dans Les échantiLLons ont été caLcuLées à L'aide d'une courbe étaLon réaLisée avec une soLution mère de choLestéroL à 0,4 mg/mL. La figure 15 représente La courbe étaLon de dosage du choLestéroL.

Les résuLtats sont exprimés sous forme de moyenne #177; écart type. ILs sont comparés à travers une anaLyse de variance (ANOVA I), à L'aide du LogicieL statistique STATVIEW version 4,5 au seuiL de significativité p < 5%. Au cas où ANOVA déceLait des variations significatives entre Les différents résuLtats obtenus, Les moyennes sont comparées à L'aide du test t de student.

Le test de régression muLtipLe a été utiLisé pour évaLuer La corréLation entre Les variations pondéraLes et Les doses d'extraits utiLisés.

Le LogicieL EXCEL 97 a servi à tracer Les différentes courbes étaLon et Les histogrammes.

Resultats

1. Taux de la progestérone dans les feuilles par HPLC et RIA

1.1 Enrichissement des extraits par de la progestérone pure.

Après enrichissement des differents extraits à la progesterone pure, il n'y a pas de pic supplementaire à celui de l'extrait seul. Par contre le pic qui correspond au temps de retention de la progesterone a une surface augmentee par rapport à celle obtenue avec l'extrait seul. Les surfaces de pic les plus eleves sont celles des macerations des echantillons recoltes en 2000 et 2003 qui sont respectivement de 14201 uv.s et 14376 uv.s. Les surfaces de pic les plus faibles sont celles des infusions des recoltes 2000 et 2003 qui sont respectivement de 6785 uv.s et 6825 uv.s. Après enrichissement, les pics les plus eleves sont ceux des echantillons 2000 et 2003, maceres qui passent respectivement à 30430 uv.s et 33512 uv.s. Les pics les plus faibles sont ceux des echantillons 2000 et 2003 infuses qui passent respectivement à 14966 uv.s et 15650 uv.s

Ces resultats confirment donc que les pics qui ont ete determines à l'aide des temps de retention correspondent bien à ceux de la progesterone.

Le tableau X donne le temps de retention et la surface des pics des differentes preparations avant et après enrichissement des extraits avec de la progesterone pure.

Tableau X : Temps de rétention et surface pic des extraits avant et après enrichissement avec de la progestérone pure.

Ech	Extraction	RT(mn)	Surface pic avant enrichissement(uv.s)	Surface pic après enrichissement(uv.s)
	macération	13,83	14201 #177; 856	30430 #177; 967
2000	décoction	13,87	9824 #177; 586	18836 #177; 1052
	infusion	13,84	6785 #177; 326	14966 #177; 356
	macération	13,82	14376 #177; 652	33512 #177; 1203
²003	décoction	13,81	9739 #177; 565	19240 #177; 752
	infusion	13,82	6825 #177; 388	15650 #177; 865

Ech: échantillon; RT: Temps de Retention; mn: minute ; uv : microvolt ; s: seconde

1.2 Taux de la progestérone par HPLC dans les différentes préparations

La progestérone n'est pas présente dans Les mêmes proportions dans tous Les extraits. Les macérations des échantiLLons récoLtés en 2000 et 2003 présentent Les concentrations Les pLus éLevées qui sont respectivement de 0,112 ug/mL et 0,130 ug/mL. Les infusions des échantiLLons récoLtés en 2000 et en 2003, présentent Les concentrations Les pLus faibLes qui sont de 0,053 ug/mL et 0,066 ug/mL. CeLa s'observe aussi pour La quantité de progestérone par gramme de feuiLLe où Les quantités sont pLus éLevées en macération et pLus faibLes en infusion dans Les échantiLLons récoLtés en 2000 et 2003.

Les résuLtats montrent que Les échantiLLons 2000 et 2003 présentent une concentration et une quantité en progestérone significativement (p < 0,01) pLus éLevées dans La macération que dans La décoction et L'infusion. Pour chaque préparation prise dans L'échantiLLon 2000 et 2003, iL n y a pas de variation significative (p > 0,05). La concentration et La quantité de La progestérone par gramme de feuiLLe sont très faibLes Lors d'une infusion avec Les échantiLLons 2000 et 2003.

La concentration et La quantité de progestérone par gramme de feuiLLes des différents échantiLLons sont résumées dans Le tabLeau XI.

Tableau XI : Concentration (ug/ml) et quantité (g) de la progestérone dosée par HPLC dans les extraits de H. floribunda

1.3 Taux de la progestérone par RIA

Les résuLtats indiquent une variation de La quantité de progestérone dans Les différentes préparations. Les quantités de progestérone par gramme de feuiLLe dans Les macérés d'échantiLLons récoLtés en 2000 et 2003 sont Les pLus éLevées et sont respectivement de 5,221 et 4,922 ug/g de feuiLLe. Les infusions des échantiLLons récoLtés en 2000 et 2003 présentent Les quantités de progestérone Les pLus faibLes et sont de 0,665 ug/g et 1,091 ug/g de feuiLLe.

Dans Le dosage par HPLC, La quantité de progestérone extraite Lors de La macération est significativement (p < 0,001) pLus éLevée que dans La décoction et L'infusion. IL n'y a pas de différence significative (p > 0,05) entre Les macérations des échantiLLons 2000 et 2003. CeLa s'observe aussi avec Les décoctions des échantiLLons 2000 et 2003 et Les infusions des échantiLLons 2000 et 2003.

Les résuLtats du dosage de La progestérone dans Les extraits par radioimmunoLogie sont résumés dans Le tabLeau XII.

Tableau XII : Quantité de progestérone dosée par Radio-immunologie dans les extraits des feuilles de H. floribunda

Ech : Echantillon ; P4 : progestérone ; g : gramme ; Qté : quantité ; ** : p < 0,001

Le dosage par HPLC et Le dosage RIA, mettent bien en évidence La présence de La progestérone dans Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, une espèce récoLtée au Burkina Faso. En HPLC, Le dosage donne Les vaLeurs moyennes de 7,782, 5,330 et 3,188 ug de progestérone par gramme de feuiLLe respectivement pour une macération, une décoction et une infusion.

En RIA, Les vaLeurs moyennes de La quantité de progestérone par gramme de feuiLLe sont de 5.071, 2.433 et 0.878 respectivement Lors d'une macération, d'une décoction et d'une infusion.

Dans Les échantiLLons récoLtés en 2000 et 2003, La macération présente La quantité de progestérone La pLus importante. La macération a donc été retenue comme mode d'extraction, utiLisé pour Les tests bioLogiques.

2. Toxicité générale aiguë du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda

2.1 Valeur test préliminaire

Les doses de 100, 250, 500, 1000 et 1500 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, administrées par voie sous cutanée, ne provoquent aucune mortaLité 72 heures après L'administration. Les 100% de mortaLité des souris sont observés avec La dose de 2500 mg/kg après 72 heures d'observations. La pLus forte dose provoquant 0% de mortaLité est 1500 mg/kg après 72 heures d'observations et La pLus petite dose entraînant 100% de mortaLité est 2500 mg/kg après 72 d'observations. La DL50, La dose qui tue 50% des animaux se situerait donc entre 1500 et 2000 mg/kg.

Tableau XIII : Nombre de souris mortes lors du test préliminaire après 1 heure, 24, 48 et 72 heures d'observations

Doses en mg/kg	n		% de mortalité des souris
Doses en mg/kg	n	1 heure	24 heures	48 heures	72 heures
100	3	0	0	0	0
250	3	0	0	0	0
500	3	0	0	0	0
1000	3	0	0	0	0
1500	3	0	0	0	0
2000	3	0	0	66	66
2500	3	0	0	0	100
3000	3	33	33	66	100
3500	3	66	100	100	100

2.2 Valeur de la DL50

La DL50 par voie sous-cutanée, du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda a été déterminée à partir des doses suivantes : 500, 1000, 1500, 2000, 2250, 2500 et 3000 mg/kg. La dose de 500 mg/kg est La pLus petite dose ne provoquant aucune mortaLité après 72 heures. La dose de 3000 mg/kg, provoque 100% de mortaLité dès La fin des 24 heures d'observations. Les résuLtats indiquent qu'après 72 heures La DL50 se situe entre 1500 et 2000

Les résuLtats du pourcentage de mortaLité, du test finaL de La DL560, sont résumés dans Le tabLeau XIV.

Tableau XIV : Pourcentage (%) de mortalité des souris pour le test final de la DL50 des extraits du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda administrés par voie souscutanée.

Doses en mg/kg	n		% de mortalité des souris
Doses en mg/kg	n	1 heure	24 heures	48 heures	72 heures
500	6	0	0	0	0
1000	6	0	16	33	33
1500	6	0	16	33	50
2000	6	0	16	50	50
2250	6	33	33	50	66
2500	6	50	50	83	83
3000	6	66	100	100	100

Les résuLtats donnent une DL50 de 1509 mg/kg après 72 heures d'observations. Le rapport DL5/DL95 est très faibLe et passe de 0,32 après une (1) heure d'observation à 0,07 après 72 heures.

Les rapports DL5/DL50 et DL50/DL95 sont identiques après 1, 24, 48 et 72 heures d'observation respectivement à 0.56, 0.14, 0.25 et 0.27.

Le rapport DL95/DL5 donne un indice de sécurité de 13.53 après 72 heures d'observation.

Les différentes vaLeurs de DL1, DL5, DL50, DL95, DL99 sont résumées dans Le tabLeau XV.

Tableau XV : Valeurs des DL et des rapports DL5/DL95, DL50/DL95, DL5/DL50 de la toxicité générale aiguë de l'extrait du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda par voie sous cutanée.

Heures d'observations			DL (mg/kg)				Rapport DL		Index de sécurité (DL95/DL5)
Heures d'observations									Index de sécurité (DL95/DL5)
	1	5	50	95	99	DL5/DL95	DL50/DL95	DL5/DL50
1	1156	1460	2564	4505	5684	0,32	0,56	0,56	3,08
24	256	567	3800	25437	55911	0,02	0,14	0,14	44,86
48	246	436	1728	6843	12102	0,06	0,25	0,25	15,69
72	239	410	1509	5551	9521	0,07	0,27	0,27	13,53

2.3 Evolution pondérale des souris

Pour toutes Les doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, administré par voie sous cutanée, on observe une diminution du poids des souris. Cette diminution passe de 3,31% à 11,58% respectivement des doses 500 à 3000 mg/kg. Entre Les doses 1000 et 2250 mg/kg, cette perte de poids varie d'environ 6%. La diminution du poids est corréLée positivement et significativement (r = 0,909; P < 0,030) avec Les doses administrées.

Les résuLtats de L'effet des doses sur Le poids des souris entières sont résumés dans Le tabLeau XVI.

Doses en mg/kg	n	Poids(g) initial	Poids(g) final	% de perte de poids
500	6	35,33 #177; 1,96	34,16 #177; 1,01	3,31
1000	6	34,83 #177; 2,04	32,70 #177; 0.70	6,11
1500	6	35,66 #177; 2,42	33,36 #177; 1,52	6,44
2000	6	36,66 #177; 3,01	34,00 #177; 1,52	7,25
2250	6	35,16 #177; 1,32	33,00 #177; 2,69	6,14
2500	6	36,00 #177; 3,46	33,20 #177; 2,63	7,77
3000	6	35,66 #177; 1,63	31,53 #177; 1,26	11,58

2.4 Effet sur le poids des organes

L'administration par voie sous-cutanée des différentes doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda aux souris, entraîne une augmentation non significative (P > 0,05) du poids du coeur et des reins quand on passe de La dose de 500 mg/kg à La dose de 3000 mg/kg. Par contre Le poids des poumons et du foie diminuent de manière non significative (p > 0,05) quand on passe de La dose de 500 mg/kg à La dose de 3000 mg/kg.

Le poids de La rate diminue de La dose de 500 à 3000 mg/kg de manière significative (p < 0,05).

Tableau XVII : Effet des différentes doses de l'extrait du macéré aqueux de H. floribunda sur le poids de quelques organes en toxicité générale aiguë.

Doses en mg/kg	n		Poids des organes en mg
Doses en mg/kg	n	Coeur	Poumon	Foie	Rate	Rein
500	6	189 #177; 9	179 #177; 2	1569 #177;7	160 #177; 5	325 #177; 3
1000	6	186 #177; 9	142 #177; 2	1011 #177; 3	107 #177; 4	386 #177; 3
1500	6	169 #177; 3	179 #177; 6	950 #177; 5	95 #177; 6	394 #177; 9
2000	6	208 #177; 4	106#177;14	936 #177; 2	110 #177; 8	386 #177; 9
2250	6	198 #177; 9	126 #177;12	947 #177; 21	95 #177;11	404 #177; 23
2500	6	216 #177; 14	110 #177; 13	920 #177; 23	89 #177; 14	398 #177; 28
3000	6	223 #177; 23	115 #177; 5	956 #177; 12	96 #177; 5	388 #177; 12

2.5 Les syndromes d'intoxications

Les activités spontanées teLLes La mobiLité, L'excitabiLité, L'agitation sont affectées à partir des doses de 1500 mg/kg jusqu'à La dose de 3000 mg/kg. Au fur et à mesure que Les doses augmentent, La mobiLité, L'agitation et L'excitabiLité diminuent.

La respiration et La somnoLence sont égaLement affectées à partir des doses de 1500 jusqu'à 3000 mg/kg. La respiration et La somnoLence augmentent avec Les différentes doses.

La couLeur des poiLs et Leur hérissement, La couLeur des pattes et du museau n'ont pas été affectés par Les différentes doses

Les résultats de l'effet des doses sur quelques signes cliniques sont résumés dans le tableau XVIII.

Tableau XVIII : Principaux syndromes d'intoxication observés pendant le test final et leur variation en fonction des différentes doses.

				Doses en mg/kg
Syndrome	500	1000	1500	2000	2250	2500	3000
Mobilité	0	0	0	-	- -	- - -	- - - -
Excitabilité, agitation	0	0	-	-	- -	- - -	- - - -
Poils hérissés	0	0	0	0	0	0	0
Respiration	0	0	0	0	+	++	++
Somnolence	0	0	+	++	++	+++	++++

(0): aucun effet ; (- ): diminution de l'effet ; (+ ): augmentation de l'effet

Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, administré par voie sous cutanée donne après 72 heures d'observation, une DL50 de 1509 mg/kg. A fortes doses ces extraits agissent en augmentant fortement La respiration, La somnoLence des souris et en diminuant La mobiLité, L'excitabiLité et L'agitation. Le poids des souris n'est affecté que Lorsque Les doses sont éLevées. Ces résuLtats indiqueraient une grande maniabiLité de L'extrait par La faibLesse du rapport DL5/DL95.Cette grande maniabiLité a permis un choix assez Large des doses pour La recherche de L'activité progestative et oestrogénique.

3. Activité progestative des extraits du macéré aqueux des feuilles de H.

floribunda

3.1 Durée optimale d'administration de la progestérone et de la forme

appropriée de solubilité de la progestérone

3.1.1 Traitement de quatre (4) jours avec de la Progestérone liposoluble et de la progestérone hydrosoluble

Les résuLtats montrent que Les différents traitements n'ont aucun effet significatif (P > 0,05) sur Le poids des souris.

La forme LiposoLubLe et La forme hydrosoLubLe de La progestérone administrées en sous-cutané présentent un poids de déciduome moyen, respectivement de 82,30 mg et 17,40 mg comparativement au Lot témoin qui a un poids de déciduome de 1 mg.

L'augmentation du poids du déciduome des souris traitées avec La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe est significative (p < 0,01) par rapport au poids du déciduome des souris du Lot témoin.

Le déciduome des souris traitées avec La progestérone LiposoLubLe présente un poids significativement (p < 0,01) pLus éLevé que Le poids du déciduome des souris traitées avec La progestérone hydrosoLubLe. ALors que Le Lot témoin ne présente aucun spot, Les formes LiposoLubLe et hydrosoLubLe présentent respectivement une moyenne de nombre de spots de 10,20 et 0,40. Le nombre de spots des souris traitées avec La progestérone LiposoLubLe est significativement (p < 0,01) pLus éLevée comparativement au Lot témoin et au Lot des souris traitées avec La progestérone hydrosoLubLe. Les différents résuLtats sont présentés dans Le tabLeau XIX.

Tableau XIX : Effet de la progestérone liposoluble et hydrosoluble administrée pendant quatre(4) jours de traitement sur le poids vif des souris, du déciduome et le nombre de spots.

p4, lipo : progesterone liposoluble ; p4, hydro :progesterone hydrosoluble ; pds : poids ; nbre : nombre(*** :p < 0,0001 ; ** :p < 0,001)

3.1.2 Traitement de sept (7) jours de la Progestérone liposoluble et la progestérone hydrosoluble

Les différents traitements n'ont aucun effet significatif (p > 0,05) sur Le poids des souris. La progestérone LiposoLubLe et La progestérone hydrosoLubLe induisent respectivement un poids moyen de déciduome de 36,40 mg et 11,70 mg, comparativement au témoin qui Lui présente un poids moyen de 0,030 mg. Les spots n'apparaissent pas dans Le Lot témoin aLors que Les souris traitées avec La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe présentent une moyenne de nombre spots respectivement de 0,80 et 0,40.

Le poids du déciduome et L'apparition des spots sont significativement (p < 0,01) éLevés dans Le Lot traité avec La progestérone LiposoLubLe comparativement au Lot témoin et au Lot traité avec La progestérone hydrosoLubLe.

Les résuLtats de L'effet de La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe pendant une durée de traitement de sept (7) jours sont résumés dans Le tabLeau XX.

Tableau XX : Effet de la progestérone liposoluble et hydrosoluble administrée pendant

sept(7) jours sur le poids vif des souris et du déciduome et le nombre de spots.

P4. lipo : Progestérone liposoluble ; P4.hydro : Progestérone hydrosoluble ; Pds : poids ; Nbre : Nombre

La progestérone LiposoLubLe administrée de manière sous cutanée pendant quatre jours entraîne une augmentation nette du poids du déciduome et un nombre de spots pLus éLevé que La progestérone hydrosoLubLe administrée dans Les mêmes conditions.

Ce même résuLtat s'observe avec La progestérone LiposoLubLe et hydrosoLubLe administrée de manière sous-cutanée, pendant sept (7) jours, mais L'effet est deux fois moins net que Lorsque L'administration se fait en quatre (4) jours.

La forme LiposoLubLe de La progestérone et La durée de traitement de quatre (4) jours, mettent bien en évidence et de manière significative, Le déciduome. La recherche de L'activité progestative à partir des extraits s'est faite donc avec La progestérone LiposoLubLe pour une durée de traitement de quatre jours.

3.2 Activité progestative du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda

Les différentes doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, administrée par voie sous-cutanée, n'ont révéLé aucun effet significatif (p > 0,05) sur Le poids corporeL des souris après 10 jours de traitement. GLobaLement, Les cornes instiLLées présentent comparativement aux cornes non instiLLées une augmentation de poids qui n'est cependant pas significative (p > 0,05). Les cornes instiLLées et ceLLes non instiLLées chez Les sujets traités aux doses de 100 et 200 mg/kg présentent une augmentation significative (p < 0,05) Lorsqu'on Les compare à ceLLes des sujets témoins. Le poids du déciduome ne présente pas une variation significative (p > 0,05) entre Les différents groupes bien que chez Les animaux traités aux doses de 100, 200 et 400 mg/kg, iL présente une Légère augmentation comparativement au résuLtat obtenu chez Le témoin. Dans Les différents groupes, iL n'apparaît aucun spot. Les résuLtats du poids des souris, du poids des cornes utérines et du nombre de spots sont résumés dans Le tabLeau XXI.

Tableau XXI : Effet des différents traitements sur le poids des souris, des cornes utérines, du déciduome et l'apparition des spots pour la mise en évidence de l'activité progestative.

Lot	n	Pi(g)		Pf(g)				Poids(mg) du déciduome		Nbre de spots
Lot	n	Pi(g)		Pf(g)		Corne droite instillée	Corne gauche non instillée	Poids(mg) du déciduome		Nbre de spots
I (ED)	6	31,23	#177; 0,66	31,66	#177; 0,66	21,53 #177; 1,84	17,57 #177; 2,16	3,96	#177; 2,16	0
II (50 mg/kg)	6	31,00	#177; 1,15	31,00	#177; 0,57	23 #177; 1,41	19,80 #177; 0,96	3,20	#177; 1,18	0
III (100 mg/kg)	6	32,00	#177; 1,15	32,33	#177; 1,20	39,56 #177; 3,92*	33,70 #177; 8,40*	5,86	#177; 1,16	0
IV(200 mg/kg)	6	31,33	#177; 1,33	32,00	#177; 2,00	52,20 #177; 8,60*	48,10 #177; 5,28*	4,10	#177; 1,98	0
V (400 mg/kg)	6	31,33	#177; 1,33	30,10	#177; 1,15	23 #177; 1,41	27,59 #177; 9,60	4,54	#177; 1,22	0

3.3 Activité anti-progestative du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda

Les variations de poids corporeL des souris entre Les différents Lots ne sont pas significatives (P > 0,05) après Les différents traitements. Le poids des cornes instiLLées augmente de manière significative (P < 0,05) par rapport aux cornes non instiLLées. Pour Les doses respectives de 50, 100 et 200 mg/kg administrées aux souris, on observe une augmentation hautement significative (p < 0,001) du poids des cornes instiLLées, respectivement de 119%, 354% et 107% par rapport aux sujets témoins. Les doses de 50, 100, 200 et 400 mg/kg entraînent une augmentation significative (P < 0,05) respectivement de 64%, 268%, 54 % et 37% du poids des cornes non instiLLées comparativement au poids des cornes non instiLLées chez Les témoins. Le poids du déciduome chez Les sujets traités avec Les doses de 100 et 200 mg/kg présente égaLement une augmentation très hautement significative (P < 0,001), respectivement de 110% et 410%, comparativement aux animaux témoins. Quant au nombre de spots d'impLantation, iL est significativement pLus éLevé (P < 0,001) chez Les sujets traités aux doses de 100 et 200 mg/kg (respectivement de 250 % et 183 %) que chez Les sujets témoins.

Les résuLtats de La recherche de L'activité anti-progestative sont résumés dans Le tabLeau XXII.

Le macéré aqueux des feuiLLes de H. ftoribunda, à Lui seuL n'a pas dégagé une activité progestative nette sur La base de La réaction déciduaLe. Par contre ces extraits potentiaLisent L'effet de La progestérone pure Lorsqu'iLs sont administrés simuLtanément. Les extraits aqueux possèdent donc d'autres substances que La progestérone, qui augmenteraient L'effet de La progestérone pure Lorsqu'iLs sont administrés simuLtanément. Ces substances et La progestérone auraient des récepteurs différents, car La pLupart des substances hydrosoLubLes ont des récepteurs membranaires aLors que Les substances LiposoLubLes ont des récepteurs nucLéaires. Des études menées par Paris (1959) et MiLLogo (1992) ont montré La présence de fLavonoïdes dans Les feuiLLes de H. ftoribunda. Les fLavonoïdes seLon Bruneton(1993), sont des substances hydrosoLubLes. PLusieurs études ont montré Les effets oestrogéniques des fLavonoïdes sur La fonction de reproduction femeLLe (CemeLi et at. , 2004 ; VaLachovicova et at. , 2004 ; Zieran et at. , 2004). Partant égaLement du fait que Les oestrogènes, sensibiLisent Les récepteurs progestéroniques en augmentant Leurs effets (Curtis et at. , 1999 ; Kurita et at. , 2001 ; Paria et at. , 2001), nous avons cherché à savoir si Le macéré aqueux des feuiLLes de H. ftoribunda dégageait une activité oestrogénique par des essais utérotrophiques.

Tableau XXII : Effet des différents traitements sur le poids des souris, du déciduome et l'apparition des spots pour la mise en évidence de l'activité anti-progestérone

Lot	n	Pi(g)						Poids(mg) du déciduome	Nbre de spots
Lot	n	Pi(g)			Pf(g)	Corne droite instillée	Corne gauche non instillée	Poids(mg) du déciduome	Nbre de spots
I (ED)	6	32,00	#177; 2,00	31,33	#177; 1,15	42,70 #177; 23,54	25,80 #177; 14,31	23,30 #177; 9,23	7 #177; 2
II (50 mg/kg)	6	32,00	#177; 2,64	32,66	#177; 3,24	93,73 #177; 18,88**	42,53 #177; 7,20**	41,20 #177; 11,68*	9 #177; 4
III (100 mg/kg)	6	32,66	#177; 0,57	33,66	#177; 0,57	194,26 #177; 21,16***	95,20 #177; 17,36**	99,06 #177; 3,8**	12 #177; 2**
IV(200 mg/kg)	6	31,66	#177; 1,52	32,66	#177; 0,57	88,60 #177; 22,75**	39,90 #177; 12,63*	48,70 #177; 10,12*	17 #177; 3**
V (400 mg/kg)	6	33,00	#177; 4,35	35,00	#177; 2,64	46,02 #177; 8,2	35,45 #177;6,71*	21,15 #177; 1,49	6 #177; 2

Pi : poids initial ; pf : poids final ; ED : Eau distillée ; n : nombre de souris g : gramme ; mg : milligramme; Nbre : nombre ; : P < 0,05 ; ** : P < 0,001

4. Activité oestrogénique du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda

4.1 Activité oestrogénique sur la ratte impubère ovariectomisée

4.1.1 Effets des traitements sur l'évolution pondérale et l'ouverture du méat vaginal des rattes

Après 7 jours d'administration, aucun traitement en sous cutané avec Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda n'affecte significativement (P > 0,05) L'évoLution pondéraLe des rattes comparativement au Lot témoin. L'oestradioL pur ou combiné avec Les différentes doses des extraits n'affectent pas non pLus (p > 0,05) L'évoLution pondéraLe des rattes entières. L'oestradioL, administré seuL provoque après sept (7) jours de traitement 100% de rattes présentant une ouverture vaginaLe. Les doses de 50, 100, 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes, présentent respectivement 16, 50 et 83% de rattes présentant une ouverture vaginaLe. Le pourcentage de L'ouverture vaginaLe est fortement dépendant de La dose administrée. Les traitements associant L'oestradioL + 100 mg/kg de H. floribunda et L'oestradioL + 200 mg/kg de H. floribunda présentaient respectivement 83% et 100% de rattes dont Le méat du vagin est ouvert. Comparativement au témoin, Les différents traitements entraînent de manière significative (p < 0,05), une augmentation de L'ouverture du méat vaginaL. Le tabLeau XXIII indique Les résuLtats des différents traitements sur L'évoLution pondéraLe des rattes et Le pourcentage d'animaux présentant une ouverture vaginaLe.

Tableau XXIII : Evolution pondérale des rattes avant et après 7 jours de traitements et le pourcentage de rattes présentant une ouverture vaginale.

Traitement	n	Poids(g) des rattes		% d'ouverture
Traitement		Poids initial	Poids final	vaginale
Témoin (ED)	6	175 #177; 19,91	200,33 #177; 18,22	0
E2	6	174 #177; 6,52	177,16 #177; 27,48	100
50 mg/kg H.f	6	174,16 #177; 7,58	209,83 #177; 16,99	16
100 mg/kg H. f	6	175 #177; 35,01	202,83 #177; 31,22	56
200 mg/kg H. f	6	175,4 #177; 24,11	181,40 #177; 24,11	83
E2 + 100 mg/kg H. f	6	175,40 #177; 19,13	195,40 #177; 21,31	83
E2+ 200 mg/kg H. f	6	174,16 #177; 13,57	201,33 #177; 13,70	100

4.1.2 Effets des traitements sur l'évolution pondérale de l'utérus et des glandes surrénales

Les traitements utiLisant des doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda ont présenté par rapport au témoin, une augmentation très hautement significative (p < 0,001) du poids frais de L'utérus (respectivement de 62 % et 78 %). L'oestradioL administré seuL a présenté égaLement une augmentation très hautement significative (p < 0,001) de 167% comparativement au témoin. L'effet de L'oestradioL associé à L'une des doses de 100 et 200 mg/kg présente une augmentation comparativement au témoin, avec respectivement un accroissement de 32% et 6%. Mais seuL Le traitement associant L'oestradioL + 100 mg/kg de H. floribunda présente une augmentation significative (P < 0,05) par rapport au témoin.

Les mêmes résuLtats s'observent égaLement en ce qui concerne Le poids sec de L'utérus. L'administration des extraits de H. floribunda aux doses de 100 et 200 mg/kg a révéLé une augmentation très hautement significative (p < 0,001) de 169 % et 205 % comparativement au témoin. L'oestradioL a présenté une augmentation égaLement hautement significative (p < 0,001) de 280 % du poids sec de L'utérus comparativement au témoin. L'effet combiné oestradioL + 100 mg/kg de H. floribunda a présenté une augmentation très hautement significative (p < 0,001) de 95% du poids sec de L'utérus comparativement au témoin. Le traitement avec L'oestradioL + 200 mg/kg n'a quant à Lui pas eu d'effet significatif (p > 0,05) comparativement au témoin sur Le poids sec de L'utérus. L'effet des différents traitements sur L'évoLution pondéraLe de L'utérus frais et sec est représenté à La figure 16.

Figure 16: Effet des différents traitements de H. floribunda sur les poids frais et sec de l'utérus chez la ratte ovariectomisée.(* : p < 0,05 ; ** p < 0,001)

Le poids des gLandes surrénaLes a augmenté très significativement (p < 0,01) avec Les doses de 100 et 200 mg/kg respectivement de 49% et 81%. Cette augmentation de poids est fortement dépendante de La dose d'extraits administrée.

L'oestradioL a entraîné une augmentation significative (p < 0,05) du poids frais des gLandes surrénaLes de 62 % comparativement au témoin.

L'effet du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, entraîne une variation simiLaire du poids frais des gLandes surrénaLes comparativement à L'effet de L'oestradioL seuL.

Les effets des traitements combinant L'oestradioL + Les doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda ont entraîné comparativement au témoin, une augmentation significative (p < 0,05) respectivement de 66% et 62% du poids des gLandes surrénaLes. IL faut cependant noter que L'augmentation du poids des gLandes surrénaLes après L'administration combinée de L'oestradioL et des doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda, est moindre que L'effet de L'oestradioL administré seuL.

Les résuLtats des différents traitements sur L'évoLution du poids des gLandes surrénaLes sont résumés à La figure 17.

Figure 17 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur la variation des poids des glandes surrénales après 7 jours de traitement chez la ratte ovariectomisée (* : p < 0,05 ; ** p < 0,001).

4.1.3 Effet des traitements sur l'évolution des paramètres biochimiques.

Le taux des protéines totaLes de L'utérus a connu une augmentation très hautement significative (p < 0,001) de 118% et 169% au-deLà du témoin, respectivement avec Les traitements utiLisant des extraits dosés à 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda. L'augmentation du taux de protéines totaLes dans L'utérus est fortement dépendante de La dose d'extrait administré.

L'administration de L'oestradioL seuL a entraîné une augmentation très significative (p < 0,001) de 108% comparé au témoin.

L'effet de La combinaison de L'oestradioL pLus Les doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda a entraîné respectivement, une augmentation du taux des protéines totaLes de 79% et 41% par rapport au témoin. SeuLe L'augmentation des effets observés avec L'oestradioL pLus 100 mg/kg de H. floribunda s'est révéLée significative (p < 0,05).

L'oestradioL et Les différentes doses de H. floribunda entraînent une augmentation du taux de protéines totaLes. Cependant L'effet combiné de L'oestradioL et des différentes doses entraînent une augmentation moindre que L'oestradioL ou Les extraits administrés séparément.

La variation du niveau de protéines dans Les cornes utérines en fonction des différents traitements est représentée à La figure 18.

Figure 18 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur le taux de protéines après 7 jours de traitement chez la ratte ovariectomisée ( * : p<0,05 ; ** p<0,001)

Le taux de choLestéroL diminue de manière significative (p < 0,05) avec Les doses de 100 et 200 mg/kg respectivement de 48 et 43% comparativement au témoin.

L'oestradioL a entraîné une diminution significative (p < 0,05) du niveau de choLestéroL de 44% comparativement au témoin.

Les effets du traitement combinant L'oestradioL + Les doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda ont significativement (p < 0,05) diminué de 23% Le taux de choLestéroL utérin comparativement au témoin.

La figure 19 représente Le niveau de choLestéroL dans Les cornes utérines après Les différents traitements.

Figure 19 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur le taux de cholestérol après 7 jours de traitement chez la ratte ovariectomisée ( * : p < 0,05 ; ** p<0,001).

L'augmentation du taux de gLucose est dose dépendante avec Les doses de 50, 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda. Ces augmentations sont respectivement de 37%, 51 % et 54%. SeuLes Les doses 100 et 200 mg/kg présentent une augmentation significative (p < 0,05).

L'oestradioL présente une augmentation hautement significative (p< 0,01) de 89% du taux de gLucose comparativement au témoin.

Bien qu'iL y'ait une Légère augmentation par rapport au témoin, Le traitement utiLisant L'oestradioL combiné à 100 ou 200 mg/kg de H. floribunda présente une diminution de L'effet, comparativement aux extraits dosés à 50, 100 et 200 mg/kg et même à L'oestradioL pur.

Le niveau de gLucose dans Les cornes utérines après Les différents traitements est représenté dans La figure 20.

Taux de glucose en pg/m	1,4	*		*
	1,2 1		*

	0,8
	0,6
	0,4
	0,2 0

Figure 20 : Effet des différents traitements de H. floribunda sur le taux de glucose après 7 jours de traitement chez la ratte ovariectomisée ; * : p < 0,05

4.2 Activité oestrogénique sur la ratte entière impubère

4.2.1 Evolution pondérale des rattes et le pourcentage d'ouverture vaginale

Après 7 jours de traitement, Les doses de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda administrées par voie sous-cutanée entraînent une augmentation non significative (P > 0,05) du poids corporeL des rattes par rapport au témoin.

L'oestradioL et Le citrate de cLomifène n'ont égaLement aucun effet significatif (p > 0.05) non pLus, comparativement au témoin, sur La croissance pondéraLe des rattes.

Le pourcentage d'ouverture vaginaLe est très significativement (p < 0,001) pLus éLevé chez Les rattes traitées avec L'oestradioL comparativement au Lot témoin. L'oestradioL induit 100% de rattes présentant une ouverture vaginaLe après 7 jours de traitement.

Le citrate de cLomifène n'a provoqué que L'ouverture d'une ratte sur 6 soit 16%.

Les doses de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda entraînent une augmentation de 83 % de rattes présentant une ouverture vaginaLe. Ces augmentations sont hautement significatives (p < 0,001) comparativement au Lot témoin.

Les différentes doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, présentent par rapport à L'ouverture vaginaLe des rattes, des variations sembLabLes à ceLLes de L'oestradioL et contraires à ceLLes du citrate de cLomifène qui est un anti-oestrogénique.

Les résuLtats de L'évoLution pondéraLe des rattes et Le pourcentage d'ouverture vaginaLe sont représentés dans Le tabLeau XXIV.

Tableau XXIV : Effet des différents traitements sur le poids des rattes entières et pourcentage de rattes présentant une ouverture vaginale

4.2.2 Evolution pondérale de l'utérus, des ovaires et des glandes surrénales

Les doses de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda entraînent des augmentations très significatives (p < 0,01) respectives de 104 et 154% du poids de L'utérus comparativement au poids de L'utérus du Lot témoin.

L'oestradioL entraîne une augmentation très significative (p < 0,01) de 226% du poids de L'utérus comparativement à ceLui du témoin.

Cependant L'effet du citrate de cLomifène sur Le poids de L'utérus montre une diminution significative (p < 0,05) de 44% du poids de L'utérus comparativement au poids de L'utérus du Lot témoin.

Les différentes doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, présentent des augmentations du poids de L'utérus sembLabLes, bien que ces augmentations soient

77 inférieures à ceLLes de L'oestradioL. Ces variations sont cependant contraires à ceLLes du citrate de cLomifène qui entraîne une diminution du poids de L'utérus.

La figure 21 indique La variation pondéraLe de L'utérus après Les différents traitements.

Figure 21 : Variation pondérale de l'utérus de ratte ayant subi différents traitements pendant 7 jours (E2 : Oestradiol 25 ìg/ml ; CC : Citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H. floribunda ; ** : p<0,01 ; * :p<0,05).

Le poids des ovaires des rattes traitées avec 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, augmente comparativement au témoin, de manière significative (p < 0,01) respectivement de 65 et 109%.

L'oestradioL entraîne une augmentation très significative (p < 0,01) de 167% du poids des ovaires comparativement au Lot témoin. Cependant, L'effet du citrate de cLomifène montre une diminution non significative (p < 0,05) du poids des ovaires de 14%.

Les différentes doses de H. floribunda présentent une augmentation sembLabLe à ceLLe de L'oestradioL bien que cette augmentation soit pLus faibLe. L'effet des extraits sur Le poids de L'ovaire est cependant contraire à ceLui de du citrate de cLomifène qui est un anti-oestrogénique. L'effet des différents traitements sur L'évoLution pondéraLe de L'ovaire est représenté à La figure 22.

Figure 22 : Variation pondérale des ovaires des rattes ayant subi différents traitements pendant 7 jours (E2 : oestradiol 25 ìg/ml ; CC : Citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H. floribunda ; ** : p < 0,01 ; * : p < 0,05).

Les différents traitements n'entraînent pas de variation significative (p > 0,05) du poids des gLandes surrénaLes après sept (7) jours de traitement. On remarque cependant une augmentation non significative (p > 0,05) du poids des gLandes surrénaLes des rattes traitées avec L'oestradioL et Les doses de 100 et 200 mg/kg de H. floribunda.

Le citrate de cLomifène n'entraîne pas de variation significative (p > 0,05) sur Le poids des gLandes surrénaLes comparativement au témoin

La figure 23 indique L'effet des différents traitements sur L'évoLution pondéraLe des gLandes surrénaLes.

Figure 23: Variation pondérale des glandes surrénales des rattes ayant ^subidifférents traitements pendant 7 jours (E2 : oestradiol 25 ìg/ml ; CC : Citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H.

4.2.3 Effet sur le taux de protéines totales, de glucose et de cholestérol dans les cornes utérines et dans l'ovaire

4.2.3.1 Evolution du taux des protéines totales dans les ovaires et l'utérus

Les doses de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, entraînent des augmentations respectives de 171% et 149% du taux de protéines totaLes dans L'utérus. Les protéines totaLes dans Les ovaires augmentent pour Les deux doses respectivement de 171% et 153%. Ces augmentations sont significatives (p > 0,05) par rapport au taux de protéines du Lot témoin.

Le traitement à L'oestradioL provoque une augmentation significative (p < 0,05) des protéines totaLes dans L'ovaire et dans L'utérus respectivement 227% et 220% comparativement au Lot témoin.

Le citrate de cLomifène par contre n'a pas d'effet significatif (p > 0,05) comparativement au témoin, sur Le taux de protéines dans L'ovaire et L'utérus des rattes traitées.

La figure 24 indique Les variations du taux de protéines totaLes dans Les cornes utérines et Les ovaires.

Figure 24 : Evolution du taux de protéines dans les cornes utérines et dans les ovaires après 7 jours (E2 : oestrogène ; CC : citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H. floribunda ; ** : p < 0,01 ; * : p < 0,05).

Le taux de gLucose dans Les ovaires des rattes, traitées avec Les doses de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, augmente respectivement de 53% et 67%. Dans L'utérus ce taux augmente pour Les deux doses respectivement de 53 et 74%. L'augmentation du taux de gLucose dans Les ovaires et L'utérus est significative (p < 0,05) comparativement au témoin.

L'effet des différentes doses de H. floribunda est sembLabLe à L'effet de L'oestradioL bien que L'effet de L'oestradioL soit pLus éLevé. En effet L'oestradioL entraîne une augmentation très significative (p < 0,01) du taux de gLucose dans Les ovaires et L'utérus respectivement de 117% et 108% comparativement au témoin.

A L'opposé, L'effet des extraits sur Le taux de gLucose est contraire à ceLui du citrate de cLomifène qui entraîne une diminution significative (p < 0,05) du gLucose dans Les ovaires et dans L'utérus respectivement de 42% et 57%.

La variation du taux de gLucose dans Les cornes utérines et Les ovaires est représentée à La figure 25.

Figure 25 : Evolution du taux de glucose dans les cornes utérines et dans les ovaires après 7 jours de traitement (E : oestrogène ; CC : Citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H. floribunda ; * : p < 0,05).

Le taux de choLestéroL diminue de 52% et 44%, dans Les ovaires des rattes traitées respectivement avec Les doses, de 100 et 200 mg/kg du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda. Dans L'utérus ce taux diminue de 44% et 46% pour Les doses de 100 et 200 mg/kg. Cette diminution du taux de choLestéroL est significative (p < 0,05) comparativement au taux de choLestéroL des ovaires et de L'utérus des rattes du Lot témoin.

Le taux de choLestéroL diminue de manière significative (p < 0,05), égaLement avec Le traitement à L'oestradioL, de 57% et 61% respectivement dans Les ovaires et L'utérus.

Le citrate de cLomifène contrairement aux différentes doses de H. floribunda et à L'oestradioL, entraîne une augmentation de 58 % dans Les ovaires et de 14% dans L'utérus. SeuLe L'augmentation dans Les ovaires est significative (p < 0,05) comparativement au témoin.

L'évoLution du taux de choLestéroL dans Les cornes utérines et Les ovaires est représentée dans La figure 26.

Figure 26 : Evolution du taux de cholestérol dans les cornes utérines et dans les ovaires après 7 jours de traitement (E : oestrogène ; CC : Citrate de clomifène ; H100 : 100 mg/kg de H. floribunda ; H200 : 200 mg/kg de H. floribunda ; * : p < 0,05).

Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda, administré à des rattes impubères ovariectomisées ou non ovariectomisées, met en évidence une activité oestrogénique par des tests utérotrophiques. Les extraits contiendraient donc des substances manifestant des activités oestrogéniques. Ces résuLtats confirment La potentiaLisation de La progestérone par ces extraits par La mise en évidence d'une réaction déciduaLe. Ces extraits ont un effet moindre Lorsqu'iLs sont combinés à L'oestradioL. CeLa suppose qu'iLs compétissent sur Le même site de récepteurs que L'oestradioL.

I. DISCUSSION GENERALE

1. Identification et dosage de la progestérone dans les feuilles de

Holarrhena floribunda (G. Don) Durand et Schinz

Les résuLtats de L'identification et du dosage confirment La présence de La progestérone dans Les différentes préparations des extraits des feuiLLes de H. floribunda récoLtés en 2000 et 2003. CeLa montre bien La présence de cette phytohormone dans L'espèce Holarrhena floribunda récoLtée au Burkina Faso. Ce résuLtat conforte ceux de Leboeuf (1968, 1969) et Schmit (1950), qui ont mis en évidence La présence de cette hormone dans des espèces récoLtées en Inde et au SénégaL. La présence de cette hormone d'origine animaLe dans une pLante a suscité beaucoup de réfLexions. C'est ainsi Bennett et al. (1965), à L'aide de techniques de marquages radioactifs ont montré que L'administration de prégnénoLone marquée à des feuiLLes de H floribunda conduisait à de La progestérone radioactive. CeLa prouverait que Les reLations biogéniques existant entre La progestérone et La pregnénoLone dans Le règne animaL sont Les mêmes dans Le règne végétaL.

Les différents modes d'extraction présentent des quantités de progestérones différentes. Que ce soit par HPLC ou par radio-immunoLogie, La quantité de progestérone est pLus importante dans La macération que dans La décoction ou L'infusion. La présence de La progestérone serait donc infLuencée par La température, car Les températures respectives de La macération, de La décoction et de L'infusion sont de 30°C (Température ambiante), 60°C et 100°C. CeLa montre donc que La progestérone serait thermoLabiLe puisque sa concentration dans Les feuiLLes varie considérabLement en fonction de L'augmentation de La température. Une étude menée par MerkLe et al. (1991), a montré une diminution considérabLe des récepteurs oestrogéniques et progestéroniques dans une biopsie de sein préLevée et stockée à une température éLevée. En effet après La biopsie, Les récepteurs oestrogéniques et progestéroniques qui étaient respectivement de 43% et 50% sont descendus respectivement à 35% et 37%. Ce résuLtat pourrait expLiquer La forte utiLisation de La macération par Les tradipraticiens Lors de La préparation de Leurs remèdes. Comme L'a montré Bontemps (1993), La macération permet une meiLLeure conservation de L'intégrité des substances actives dans une pLante.

Dans Les échantiLLons 2000 et 2003, La variabiLité dans Le temps de La quantité de progestérone Lors d'une macération est insignifiante. C'est égaLement Le cas quand iL

s'agit d'une décoction ou d'une infusion. IL est vrai que L'écart de temps entre 2000 et 2003 est assez insignifiant pour savoir s'iL y a une variation de La quantité de progestérone dans Les feuiLLes de H floribunda en fonction du temps, cependant ceLa confirme La présence de cette hormone dans La pLante au cours de ces deux années. Cette faibLe variabiLité de La progestérone dans Les différents modes d'extraction, pourrait s'expLiquer par Le fait que Les échantiLLons des deux différentes années ont été récoLtés dans La même LocaLité et à La même période de L'année c'est à dire en fin de saison pLuvieuse.

Les échantiLLons de H. floribunda utiLisés par Leboeuf pour L'isoLement de La progestérone étaient des échantiLLons en provenance de L'Inde. La présence de La progestérone dans L'espèce récoLtée au Burkina Faso, montrerait qu'iL existe très peu de différence quant à La composition chimique de cette pLante en progestérone. Cependant seLon Les travaux de Schmit (1950), 25,71 ìg de progestérone sont extraits par gramme de feuiLLe dans L'espèce de Holarrhena, récoLté en Inde. Cette quantité est trois pLus éLevée que La progestérone extraite par gramme de feuiLLes dans une macération de l'Holarrhena récoLtée au Burkina Faso. Cette différence pourrait s'expLiquer par Les conditions d'anaLyse, car Les différents soLvants utiLisés par Leboeuf (1969) sont des soLvants aLcooLiques. La température, Le soL, Le cLimat, Le mode de récoLte sont égaLement autant de facteurs qui infLuencent fortement La teneur des substances bioactives dans une pLante.

2 Toxicité du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda.

La vaLeur de La DL50 du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda administré par voie sous-cutanée, après 72 heures d'observation est 1509 mg/kg. SeLon L'écheLLe de Done (1980), cette vaLeur de La _DL50 permet de cLasser L'extrait du macéré aqueux de H. floribunda comme faibLement toxique par voie sous cutanée.

La vaLidation des vaLeurs de DL50 est confirmée par La constance des rapports DL5/DL50^et_DL50/DL95 queLLe que soit Le déLai de La période d'observation. CeLa expLique en partie Le peu d'effets toxiques de La pLante non seuLement sur Le poids des souris entières mais égaLement sur Le poids du coeur. Ce résuLtat est sembLabLe à ceLui de Lavier et al. (1948), qui ont montré que La conéssine, L'un des principaux composants des feuiLLes de H. floribunda, n'a aucun effet sur Le nombre des hématies. Le rôLe essentieL du foie étant La production d'enzymes utiLes à La digestion, Le refus des animaux de s'aLimenter, raLenti son fonctionnement. Ce qui pourrait expLiquer La baisse

de son poids. Cette baisse d'activité justifierait égaLement La baisse du poids de La rate due au fait que son principaL rôLe est de fiLtrer Le sang, de Le débarrasser des bactéries, des virus et de détruire Les gLobuLes rouges détériorés. Les reins au contraire, sont en pLeine activité car iLs éLiminent intensément Les doses de La pLante devenues toxiques. Cette activité intense expLiquerait L'augmentation de son poids. CeLa confirme par aiLLeurs L'importante utiLisation de H. floribunda pour son activité diurétique (Arbonnier, 2000).

L'atteinte de La fonction respiratoire serait Liée à une atrophie puLmonaire qui s'expLiquerait par une dyspnée à partir de La dose de 2000 mg/kg et un changement de La coLoration des poumons à L'autopsie. Ces résuLtats corroborent ceux de Chopra et al.(1927) et Bakhsh (1936), qui ont montré que La conéssine, aLcaLoïde stéroïdique et un des principaux constituants de H. floribunda, pouvait entraîner La mort par dépression puis arrêt respiratoire.

Les très faibLes vaLeurs des rapports DL5/DL95 traduisent une très grande maniabiLité de L'extrait aqueux des feuiLLes de H. floribunda par voie sous cutanée. CeLa confirme La grande marge de dose qui existe entre 500 et 2000 mg/kg avant que Les signes d'intoxications ne commencent à apparaître.

L'index de sécurité, qui se traduit par Le rapport DL95/DL5, est de 13,53 après 72 heures d'observations. SeLon Hodge et Sterner (1943), cette vaLeur est un bon index de sécurité car eLLe supérieure à 10. CeLa confirme La faibLesse de La toxicité et La grande maniabiLité des extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda (Tamboura et al., 2005).

L'administration de H. floribunda à La dose de 2000 mg/kg a provoqué une intoxication aiguë marquée par La somnoLence, La baisse des réfLexes, de L'excitabiLité, de L'agitation et de La mobiLité. CeLa pourrait être Lié à une atteinte principaLement nerveuse comme L'ont déjà montré d'autres auteurs avec d'autres substances (Some et al., 1996 ; MandaL et al., 2001). Cette atteinte nerveuse a été égaLement mise en évidence par KeideL (1878), de L'action dépressive de La conéssine sur Les centres nerveux. La baisse d'activité marquée par La somnoLence, pourrait être Liée à La progestérone. Car comme L'ont montré certains auteurs, La progestérone augmenterait Le sommeiL par son action sur Les récepteurs GABA (A) (LanceL et al., 1996, 1999; Baker et al., 2001).

3. Activité potentialisatrice de la progestérone du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda.

Les doses du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda ne mettent pas en évidence de spots au niveau de L'utérus. La progestérone étant L'hormone indispensabLe de La réaction déciduaLe (De Feo, 1967 ; Curtis et al., 1999 ; Kurita et al., 2001), Les extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda ne présentent donc pas en eux-mêmes d'activité progestative sur La base de La réaction déciduaLe. L'oestradioL a cependant initié Le changement de L'endomètre en provoquant une augmentation de poids des cornes instiLLées et non instiLLées comparativement aux témoins. L'oestradioL agirait via ses récepteurs aLpha par La proLifération des ceLLuLes épithéLiaLes de L'utérus. Bien que L'oestradioL augmente La sensibiLité de L'utérus aux récepteurs de La progestérone (Verhage et al. , 1983 ; West et al. , 1985), La présence de La progestérone est essentieLLe pour La mise en évidence du déciduome (Lydon et al., 1995 ; Paria et al.; 1999).

L'effet combiné des extraits aqueux de H. floribunda et de La progestérone induit par contre une réaction déciduaLe significative. L'extrait potentiaLise donc L'effet de La progestérone car eLLe agit en présence de ceLLe-ci. En effet Les doses croissantes de H. floribunda entraînent une augmentation du poids des cornes instiLLées comparativement aux cornes instiLLées témoin mais aussi des cornes non instiLLées comparativement aux cornes non instiLLées témoin. CeLa se traduit par une augmentation du poids du déciduome.

Les spots simiLaires aux sites d'impLantation des bLastocystes augmentent avec Les doses de 50, 100 et 200 mg/kg. Cependant seuLe La dose de 200 mg/kg présente une augmentation significative par rapport au témoin. La progestérone agirait via ses récepteurs par une augmentation des ceLLuLes du stroma de L'utérus. La déciduaLisation optimaLe est donc Liée à une réponse des ceLLuLes du stroma à La progestérone (Parandoosh et al., 1995; ViLLee et al., 1981). L'extrait de La pLante augmenterait L'effet de La progestérone par une reconnaissance importante des récepteurs sur Les ceLLuLes du stroma.

4. Activité oestrogénique du macéré aqueux des feuilles de H. floribunda.

Les ovaires sont Les Lieux de production des hormones stéroïdiques notamment La progestérone et Les oestrogènes. Leur suppression par une ovariectomie biLatéraLe

entraîne un bouLeversement hormonaL et arrêt de La production d'oestrogènes avec des conséquences morphoLogiques et biochimiques sur Le tissu utérin (Parekh et at., 2004).

La recherche d'activités oestrogéniques des extraits des feuiLLes de H. ftoribunda en présence ou en absence d'ovaire, a porté essentieLLement sur Le déveLoppement pondéraL et biochimique de L'utérus par des essais utérotrophiques. En effet, Les essais utérotrophiques sont très souvent utiLisés comme essais standards pour La mise en évidence d'une activité oestrogénique in vivo. Cette activité se traduit généraLement par des changements morphoLogiques, histoLogiques et biochimiques de L'utérus (Bachman et at., 1998 ; DieL et at., 2002).

L'augmentation des poids frais et sec de L'utérus ainsi que Le nombre d'animaux présentant une ouverture vaginaLe confirment bien une activité oestrogénique du macéré aqueux des feuiLLes de H. ftoribunda chez La ratte impubère ovariectomisée et chez La ratte impubère non ovariectomisée. Car comme L'ont montré pLusieurs auteurs auparavant (Jacob et at., 1969 ; DieL et at., 2002), L'administration de substances oestrogèniques ou oestrogène-Like à des rattes impubères ou ovariectomisées induit une augmentation de La masse et du poids ainsi que L'imbibition aqueuse de L'utérus, La cornification et L'ouverture de L'orifice vaginaL. A La suite des travaux de CLarke et at. (1991, 2003) et Roberts et Sporn (1992) qui ont permis un certain écLairage sur Le mécanisme d'action de ces substances, on peut expLiquer Les effets ainsi obtenus par Le fait que Les oestrogènes stimuLent très fortement La proLifération des ceLLuLes dans L'endomètre utérin. Cette observation vaut par aiLLeurs égaLement pour d'autres tissus d'organes reproducteurs comme Les ovaires et Les seins et conduisant parfois à des formes de tumeurs rapportées à travers pLusieurs cas cLiniques en gynécoLogie.

En ce qui concerne Les gLandes surrénaLes, Les résuLtats que nous avons obtenus confortent ceux rapportés par Kozvun (1996). Cet auteur a en effet constaté une atrophie et d'importantes modifications histoLogiques au niveau des gLandes surrénaLes suite à une ovariectomie pratiquée sur des rattes aduLtes. Et en administrant à des sujets ainsi traités des substances oestrogéniques, Les gLandes surrénaLes ont non seuLement corrigé Leur déficit, mais ont égaLement accru Leur masse et Leur poids normaL. CeLa pourrait expLiquer La très faibLe variation du poids des gLandes surrénaLes chez Les rattes non ovariectomisées. La présence des ovaires diminue en grande partie La production des oestrogènes par Les gLandes surrénaLes.

L'action oestrogénique des extraits de H. ftoribunda qui a été bien mise en évidence pLus haut est par aiLLeurs confirmée au niveau biochimique par L'augmentation du taux de protéines, de gLucose et La diminution du taux de choLestéroL dans Les cornes utérines des rattes traitées.

En effet, Lee et Lee (1996) ainsi que Kouakou et at. (2003) qui recherchaient aussi Les effets d'autres substances supposées oestrogéniques ont égaLement obtenu une teLLe augmentation du niveau protéique ainsi que L'imbibition en eau de La masse utérine. Pour ces auteurs, Les protéines étant Les constituants essentieLs des ceLLuLes, toute proLifération ceLLuLaire due à L'activité mitotique et anaboLisante des oestrogènes, entraînerait égaLement une augmentation du taux de protéines.

En ce qui concerne Le taux de choLestéroL, Les travaux de Dodge et at. (1996), Lundeen et at. (1997), Samman et at. (1999) ont montré que L'administration sous cutanée d'oestrogènes à des rattes immatures ou ovariectomisées réduisait Les teneurs en choLestéroL dans La circuLation généraLe et au niveau des ovaires et des cornes utérines. Certains auteurs comme Strauss et at.(1981) et BLack et at. (1994), expLique que Le choLestéroL étant Le précurseur de La synthèse des hormones steroïdiennes, La diminution de son taux est due au fait qu'iL a été utiLisé dans Le processus de La stéroidogénèse.

Les résuLtats présentent une augmentation du taux de gLucose des rattes traitées avec Les extraits de H. ftoribunda. Ces résuLtats sont simiLaires à ceux trouvés par Nogowski (1999), qui montrent qu'après administration de substances oestrogéniques à de jeunes rattes ovariectomisées, Le taux de gLucose augmente de 24 %. La teneur en gLucose dans L'organisme est réguLée par L'insuLine qui réduit ce taux Lorsque ceLui-ci est éLevé. L'absence donc de L'insuLine ou une baisse de La sensibiLité des ceLLuLes à L'insuLine entraînerait une augmentation du taux de gLucose. Des études menées par Xie et at. (2003), GonzaLez et at. (2001, 2003) sur des rattes ovariectomisées ont montré que de faibLes doses d'oestradioL augmentaient La sensibiLité des ceLLuLes à L'insuLine aLors que de fortes doses diminuaient cette sensibiLité. D'autres chercheurs comme Garcia et at. (2005) ont montré que L'administration d'oestradioL à des rattes ovariectomisées provoquait une inhibition des récepteurs à L'insuLine ce qui entraînerait une baisse de La sensibiLité des ceLLuLes à L'insuLine, donc une augmentation du taux de gLucose.

L'ensembLe de ces effets de L'administration d'extraits aqueux de H. ftoribunda s'est égaLement révéLé être dépendant de La dose administrée. A très faibLe dose, pratiquement aucun effet n'est noté aLors qu'à 100 et 200 mg/kg, iLs s'affichent très nettement.

L'augmentation du taux de protéines contribue au rétabLissement de La structure des cornes utérines et des gLandes surrénaLes. Les extraits contiendraient donc des

substances oestrogéniques qui permettraient La proLifération ceLLuLaire au niveau de L'endomètre de L'utérus, de L'ovaire et des gLandes surrénaLes quand Les animaux ne sont pas ovariectomisés.

En présence d'oestradioL, Les extraits aqueux de H. floribunda ont montré une augmentation des poids frais et sec de L'utérus, du poids frais des gLandes surrénaLes, L'ouverture vaginaLe des rattes ainsi qu'une augmentation du taux protéique et gLucidique et une diminution du taux de choLestéroL dans L'utérus. IL faut cependant noter que L'effet du traitement combiné oestradioL et des extraits de La pLante est moindre que Leurs effets individueLs. Ce phénomène de compétition entre L'oestradioL et Les extraits de La pLante est donc partieL. CeLa pourrait s'expLiquer par Le fait que Les extraits de H. floribunda et L'oestradioL administrés ensembLe chez Le même sujet, compétissent sur Les mêmes sites de récepteurs. SeLon Shutt (1976), Les phytoestrogènes faibLes, Lorsqu'iLs sont administrés à forte dose peuvent provoquer un déséquiLibre hormonaL pouvant même Les mettre en compétition avec L'oestrogène et se comporter comme des anti-oestrogènes. En effet L'administration simuLtanée de L'oestradioL et de 100 mg/kg de H. floribunda donne une réponse pLus significative que L'administration simuLtanée de L'oestradioL et de 200 mg/kg de H. floribunda. CeLa traduit Le fait que L'administration d'une dose assez forte entraîne une diminution de La réponse.

Ces effets oestrogéniques des extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda s'expLiqueraient par La présence des fLavonoïdes. PLusieurs études ont montré L'action des fLavonoïdes en tant que substances à activités oestrogéniques (Limer et al., 2004 ; Vaya et al., 2004). Des études menées par Hodek et al. (2002), montrent que de fortes doses de fLavonoïdes entraînaient une réduction de L'effet oestrogénique par une interaction avec Le cytochrome P450 ou en bLoquant Le CYP19, une enzyme très importante dans La biosynthèse des oestrogènes. CeLa expLiquerait La baisse de L'activité oestrogénique Lorsque Les deux substances sont administrées en même temps.

SeLon Bruneton(1993), Les fLavonoïdes seraient hydrosoLubLes comparativement aux hormones de synthèses comme La progestérone. Cette hydrosoLubiLité des fLavonoïdes expLiquerait égaLement La mise en évidence de L'activité oestrogénique des extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda.

II. CONCLUSION GENERALE

L'étude que nous venons de mener porte sur L'activité progestéronique et oestrogénique des extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda. IL a été au préaLabLe recherché La présence de La progestérone dans Les feuiLLes et évaLué La toxicité généraLe aiguë par La détermination de La DL50.

Cette étude a permis de mettre en évidence La présence de La progestérone dans Les feuiLLes de H. floribunda récoLtées au Burkina Faso. IL ressort égaLement au cours de cette étude que La macération à température ambiante présente Le meiLLeur rendement d'extraction de La progestérone comparativement à La décoction et à L'infusion.

L'évaLuation de La toxicité généraLe aiguë dans cette étude, du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda montre que ceLLe-ci est faibLe par voie sous cutanée. Les extraits présentent donc une grande maniabiLité. Une administration à forte dose de ces extraits peut provoquer des probLèmes respiratoires et une atteinte nerveuse marqués en pLus d'une baisse de La mobiLité, de L'agitation, de L'excitation et une augmentation de La somnoLence.

Des études uLtérieures sur La toxicité subaiguë et chronique seraient nécessaires pour anaLyser L'administration des extraits à Long terme. IL serait égaLement intéressant de rechercher La toxicité par d'autres voies d'administration teLLes que La voie intramuscuLaire et intraveineuse en vue d'une meiLLeure maîtrise des marges sécuritaires d'utiLisation de cette pLante.

La recherche de L'activité progestative par La mise en évidence d'une réaction déciduaLe, ne s'est pas avérée positive. Les extraits présentaient par contre une potentiaLisation de L'effet de La progestérone Lorsque Les extraits étaient combinés à La progestérone pure. La réaction déciduaLe étant une réaction assez sensibLe à La progestérone, L'absence de sa mise en évidence par Les extraits serait peut être Lié au soLvant aqueux. L'usage de soLvant organique serait envisageabLe pour La poursuite de La recherche de cette activité. D'autres tests, teLs Le suivi hormonaL de La progestérone par des préLèvements quotidiens sur des espèces caprines et ovines pourraient être envisagés pour rechercher L'activité progestative.

Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda présentait cependant une activité oestrogénique chez La ratte impubère aussi bien ovariectomisée que non ovariectomisée. Cette activité se manifeste par une augmentation des poids frais et sec de L'utérus, de L'ouverture vaginaLe des rattes, du taux de protéines et du

gLucose et une diminution du taux de choLestéroL utérin. Les extraits aqueux possèdent donc des substances à activités oestrogéniques.

Ces résuLtats confirment donc L'utiLisation en médecine traditionneLLe, de H. floribunda pour Le contrôLe de La fertiLité et pour La Lutte contre Les avortements.

H. floribunda pourrait par ses activités oestrogéniques, jouer un rôLe important dans La réguLation des hormones de La fonction de reproduction. En tant que phytoestrogène, eLLe pourrait intervenir égaLement dans La guérison des maLadies cardio-vascuLaires par La réduction du taux de choLestéroL. ELLes pourraient égaLement être utiLisées pour Les femmes âgées contre L'ostéoporose et chez L'homme pour corriger des cas de cancer comme ceLLe de La prostate.

Mais tout ceLa ne sera possibLe que si des investigations pLus approfondies sont menées sur Le pLan physioLogique, pharmacoLogique et toxicoLogique.

H. floribunda, n'est pas probabLement La seuLe pLante et non pLus La pLus active, manifestant ces activités. IL serait donc important de recenser et d'identifier ces pLantes qui ont des actions sur La fonction de reproduction femeLLe.

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RESUME

Holarrhena floribunda (G. Don) Durand et Schinz est une Apocynaceae couramment utiLisée en thérapeutique traditionneLLe humaine et vétérinaire pour Lutter contre Les avortements et Les cas d'infertiLité. Le but de La présente étude a été de vérifier son utiLisation en évaLuant son activité progestative par La mise en évidence de La réaction déciduaLe et son activité oestrogénique par des tests utérotrophiques. IL a été au préaLabLe recherché par HPLC et RIA, La présence de La progestérone dans trois préparations aqueuses : macération, décoction et infusion. Les mesures sécuritaires d'utiLisations ont été ensuite évaLuées par La toxicité généraLe aiguë.

Les résuLtats ont révéLé autant en HPLC qu'en RIA, La présence de La progestérone dans Les feuiLLes de H. floribunda. Cependant La quantité de La progestérone est pLus éLevée dans Les extraits aqueux macérés que dans Les extraits aqueux décoctés et infusés.

Les vaLeurs de La DL50 et de L'index de sécurité sont respectivement de 1509 mg/kg et de 10,3. Ces vaLeurs traduisent une toxicité moyenne et une grande marge d'utiLisation du macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda administré par voie sous cutanée.

La recherche de L'activité progestative a pLutôt montré une interaction potentiaLisatrice de L'extrait avec La progestérone. Cette potentiaLisation s'est traduite par une augmentation du poids du déciduome et du nombre de spots au niveau de L'utérus sembLabLes à des sites d'impLantation des bLastocystes Lorsque Les extraits et La progestérone pure étaient administrées simuLtanément.

Par contre, iL a bien été mis en évidence que Le macéré aqueux des feuiLLes de H. floribunda produit une activité oestrogénique. Cette activité s'est d'abord traduite par une augmentation du poids frais et sec de L'utérus et du pourcentage d'ouverture vaginaLe. Ensuite par une augmentation du taux de protéine totaLe et du gLucose et une diminution du taux de choLestéroL dans Les cornes utérines.

En concLusion, La potentiaLisation de La progestérone par Les extraits aqueux des feuiLLes de H. floribunda et de L'activité oestrogénique de ces extraits justifient Leur utiLisation en thérapeutique traditionneLLe pour L'améLioration de La fertiLité. H floribunda contient des phytoestrogènes, qui pourraient être bénéfiques dans La Lutte contre Les cancers, Les maLadies cardio-vascuLaires et certaines maLadies Liées à La ménaupose, teLLe L'ostéoporose.

Mots dles : Holarrhena floribunda, médecine traditionnelle, activité progestative, activité oestrogénique

8. Tamboura H.H., Banga-Mboko H., Maes D., Youssao I., Traoré A., Bayala B., DembeLé M. A. 2006. PrevaLence of common gastrointestinaL nematode parasites in scavenging pigs of different ages and sexes in eastern centre province, Burkina Faso. Ondersteport. J. Vet. Res. 73(1):53-6O

9. Banga-Mboko H., Tamboura H.H., Maes D., Traore H., Youssao I., SangiLd P.T., EL Amiri B., Bayala B., Remy B. and Beckers J. F. 2003. Survey of gastric Lesions and bLood pepsinogen LeveLs in pigs in Burkina Faso. Vet Res. Commun. 27(8):595-602.