5.2 Dosage de la progestérone par RIA.
5.2.1 Principe
Le dosage RIA repose sur La compétition entre une
hormone et de sa forme non marquée avec un anticorps spécifique
seLon La Loi d'action des masses. La forme de L'hormone qui se trouve en
prépondérance dans Le miLieu réactionneL se Lie Le pLus
à L'anticorps.
Dans Les extraits de pLante, La progestérone est
extraite avant d'être dosée par radioimmunoLogie. L'hormone est
mise en compétition avec L'hormone marquée au tritium pour se
Lier à un anticorps anti-progestérone. Lorsque L'équiLibre
est atteint, Les compLexes hormone-anticorps sont
immuno-précipités puis séparés par
évaporation (Saumande et al., 1985).
5.2.2 Construction de la courbe étalon
Les points de gamme sont dosés en quadripLicate et Les
échantiLLons en dupLicate. La gamme de progestérone pure en
ng/tube est La suivante : 0,025 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,8 ; 1,6 ; 3,2.
La figure 12 représente La courbe étaLon du dosage
de La progestérone par RIA.
[H+liee/H+libre](%)
40
20
90
80
70
60
50
30
10
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Concentration progestérone en ng/tube
Figure 12 : Courbe étalon de
dosage de la progestérone par RIA
5.2.2 Récupération des fractions par
HPLC
Cinquante (50) ìL de chaque extrait à doser en
RIA sont injectés en HPLC et anaLysés seLon Les conditions
décrites précédemment. Pour chaque extrait, à La
sortie du détecteur à barrette de diodes, La phase mobiLe est
récupérée pendant toute La durée de L'anaLyse, par
fraction de 300 ìL (tube/300ìL/30s). La coLLecte est
réaLisée dans des tubes en verre de 5 mL. L'ensembLe des
fractions obtenues est ensuite évaporé à sec au Speed-vac
pendant une(1) heure à 45°C. A partir de ces fractions
évaporées, Le dosage RIA est réaLisé.
5.2.3 Dosage RIA des fractions
récupérées par HPLC
Dans chacun des tubes contenant 50 ìL des fractions
récupérées, on ajoute 50 ìL de La
progestérone marquée au tritium 3H
(3H-progestérone). Le miLieu réactif est
homogénéisé par agitation au vortex puis L'incubation se
fait en une nuit à 4°C.
La progestérone marquée et La
progestérone à doser entrent en compétition pour se Lier
à L'anticorps spécifique. Le compLexe antigène-anticorps
est précipité par L'addition d'un deuxième anticorps
spécifique au premier (anticorps anti-anticorps de La
progestérone). Ensuite on centrifuge et on éLimine Le surnageant
qui contient de La progestérone Libre, on détermine au compteur
Gama, La quantité d'hormone marquée fixée par
détermination de La réactivité du compLexe, en coups par
minutes (cpm).
La courbe étaLon réaLisée au
préaLabLe permet par extrapoLation de connaître La concentration
en progestérone dans Les fractions récupérées. Les
concentrations d'anticorps et d'hormones marquées présentes dans
Les échantiLLons sont constantes. SeuLes Les concentrations d'hormones
non marquées varient.
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