8.3.2 Observation de l'ouverture de l'orifice
vaginale
Chaque matin à heure fixe, entre 8 heure et 8 heure 30
minutes du matin durant Les 7 jours de traitement, Les femeLLes
présentant une ouverture du méat vaginaL sont
dénombrées. Ce nombre est rapporté à La dose des
produits administrés dans chaque Lot.
8.3.3 Paramètres biochimiques
Les cornes utérines ou Les ovaires après
pesée sont broyés finement à L'aide d'un potter dans une
soLution physioLogique de NaCL à 0,9%. Le broyât est
centrifugé à 4000 trs/mn pendant 15 minutes. Le surnageant est
recueiLLi dans des tubes de 1,5 mL et pLacé au congéLateur
à - 4°C pour Les différents dosages biochimiques. Les
paramètres à doser sont Les protéines totaLes, Le
choLestéroL et Le gLucose.
8.3.3.1 Dosage de la teneur en protéines
totales
Principe
Les protéines ont été dosées par
La méthode de Zor et SeLinger(1996). Le dosage est basé sur
L'interaction en miLieu acide, entre Les protéines et Le coomassie
briLLant bLeu.
Technique
Cent (100) uL du broyât d'utérus ou de L'ovaire +
5 mL du réactif BIORAD TM est vortexé et Laissé
pendant 10 mn à 37°C. La coLoration est stabLe pendant 30 minutes.
ParaLLèLement une gamme étaLon de La sérumaLbumine bovine
(BSA) est traitée ainsi qu'un bLanc. Le principe de La réaction
est basé sur Le changement d'absorbance (620 à 465 nm) d'une
soLution acide de bLeu de coomassie en présence de protéine. Le
rapport A620/A465nm est caLcuLé pour chaque échantiLLon. La
concentration en protéines des échantiLLons a été
caLcuLée à L'aide d'une courbe étaLon
réaLisée avec Le Sérum ALbumine Bovine (BSA). La figure 13
représente La courbe étaLon de dosage des protéines
totaLes.
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,0102x R2 = 0,9819
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentration protéine en ug/ml
DO (A620/A465)
Figure 13 : Courbe étalon de
dosage des protéines totales 8.3.3.2 Dosage de La teneur en
gLucose
Principe
Le gLucose a été dosé seLon La
méthode enzymatique de La gLucose oxydase. La gLucose oxydase est une
enzyme trouvée dans Les miLieux de cuLture de Penicillium
notatum qui cataLyse L'oxydation du á-D-gLucopyranose en D-gLuco-1,
5-Lactone, avec formation de pyroxyde d'hydrogène. La Lactone est
ensuite Lentement hydroLysée en acide D-gLuconique. La peroxydase
incorporée dans Le miLieu réactionneL cataLyse La réaction
de L'eau oxygénée avec Le chromogène ABTS
(2,2'-azino-di-(3- éthyLbenzthiazoLine)-6-suLfonate).
Technique
Une quantité de 0,1 mL de broyats d'utérus ou
d'ovaire à doser est ajouté dans 1,8 mL de La soLution de suLfate
de sodium-suLfate de zinc (diLuer 55 mL de La soLution de suLfate de zinc dans
1 Litre avec La soLution de suLfate de sodium) dans un tube à
centrifuger. On additionne au tout 0,1 mL de soude à 0,5 moL/L puis on
centrifuge. 0,5 mL de surnageant est ensuite préLevé en doubLe.
Pour Le témoin bLanc prendre 0,5 mL d'eau distiLLée. UtiLiser 0,5
mL de La gamme de diLution du gLucose. Ajouter 5 mL du réactif à
La gLucose oxydase, incuber pendant 1h à 37°C et Lire L'absorbance
à 505 nm contre Le témoin bLanc. La concentration en gLucose des
échantiLLons a été caLcuLée à L'aide d'une
courbe étaLon réaLisée avec une gamme de concentration du
gLucose. La figure 14 représente La courbe étaLon de dosage du
gLucose.
4,5
4
3,5
y = 4,0535x
R2 = 0,996
0,5
0
3
2,5
2
DO a 505 nm
1,5
1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentration glucose en ug/ml
Figure 14: Courbe étalon de
dosage du glucose
8.3.3.3 Dosage de La teneur en choLestéroL
Principe
Le choLestéroL a été dosé seLon La
méthode de Liebermann-Burchard. L'anhydrite acétique
réagit avec Le choLestéroL en soLution chLoroformique pour donner
un dérivé de couLeur bLeu-vert caractéristique. Le
choLestéroL ainsi que d'autres Lipides sanguins ou pLasmatiques, sont
extraits par un méLange aLcooL-cétone, tandis que Les
protéines précipitent.
Technique
Dix (10) mL d'un méLange aLcooL-cétone (1 : 1 ;
v/v) et 0,2 mL de broyât d'utérus ou d'ovaire sont mis dans un
tube à centrifuger. Le tube est immergé dans un bain-marie
bouiLLant et agité jusqu'à ce que Le soLvant commence à
bouiLLir. Le tube est ensuite retiré et agité pendant 5 minutes.
IL est Laissé à température ambiante pour refroidissement,
puis centrifugé. Le surnageant est décanté dans un tube
à essai et évaporé à sec dans un bain-marie
bouiLLant. IL est ensuite refroidi et Le résidu est dissous dans 2 mL de
chLoroforme. IL est ajouté 2 mL de La soLution d'anhydrite
acétique et d'acide suLfurique (30:1; v/v) dans tous Les tubes et Le
tout est méLangé soigneusement. Les tubes sont Laissés
dans L'obscurité et à température ambiante puis
L'absorbance est Lue à 680 nm. Les concentrations en choLestéroL
totaL dans Les échantiLLons ont été caLcuLées
à L'aide d'une courbe étaLon réaLisée avec une
soLution mère de choLestéroL à 0,4 mg/mL. La figure 15
représente La courbe étaLon de dosage du choLestéroL.
1 8
1 6
1 4
y = 1 5 ,8 8 6 x R 2 = 0 ,9 9 2 4
2
0
1 2
1 0
8
6
DO a 680 nm
4
0 0 ,2 0 ,4 0 ,6 0 ,8 1 1 ,2
Concentration Cholestérol e n ug /m l
Figure 15 : Courbe étalon de
dosage du cholestérol
9. AnaLyses statistiques des résuLtats
Les résuLtats sont exprimés sous forme de
moyenne #177; écart type. ILs sont comparés à travers une
anaLyse de variance (ANOVA I), à L'aide du LogicieL statistique STATVIEW
version 4,5 au seuiL de significativité p < 5%. Au cas où
ANOVA déceLait des variations significatives entre Les différents
résuLtats obtenus, Les moyennes sont comparées à L'aide du
test t de student.
Le test de régression muLtipLe a été
utiLisé pour évaLuer La corréLation entre Les variations
pondéraLes et Les doses d'extraits utiLisés.
La détermination de La DL50 s'est effectuée
à L'aide du LogicieL PHARMS/PC.
Le LogicieL EXCEL 97 a servi à tracer Les
différentes courbes étaLon et Les histogrammes.
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