4.1. Pesée
La manipulation des échantillons s'effectue sous une
haute à flux laminaire pour éviter toutes contaminations
extérieures.
Dans une première étape, en utilisant une pince
et un scalpel stériles, on coupe chaque échantillon en 2 portions
ayant le même poids, dont une portion va être congelée et
l'autre va être analysée à l'état frais.
Ensuite on prélève environ 26 g de
l'échantillon dans un sac stérile de polyéthylène
préalablement taré. Il est important de prélever à
4 ou 5 endroits dans l'échantillon afin d'obtenir un
échantillonnage représentatif, et on ajoute 234 ml d'eau
peptonée tamponnée, Puis, l'homogénéisation est
réalisée à l'aide d'un appareil
d'homogénéisation de type «stomacher» pendant une
minute (Figure 16).
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Figure 16 : homogénéisateur de
type « Stomacher »
4.2. Dilutions décimales
Un volume de 1 ml de la solution mère est
inoculé à l'aide d'une micropipette dans des tubes à
essai, préalablement remplis avec 9 ml de tryptone sel
stérilisé. À l'aide d'un agitateur vortex, on fait agiter
le contenu pendant 5 à 10 secondes afin d'obtenir la dilution
10-2. Cette opération sera répétée de la
même manière pour obtenir les dilutions suivantes
10-3et 10-4 (Figure 17).
Figure 17 : Préparation de la
suspension mère et des dilutions décimales
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5. Ensemencement
L'ensemencement est l'étape d'inoculation d'un volume
prédéterminé à partir du milieu contenant les
bactéries recherchées, dans le milieu de culture. L'ensemencement
est effectué à l'aide d'une « micropipette » dans une
zone stérile tout en désinfectant les paillasses.
5.1. Ensemencement en surface
Etalement de l'inoculum à la surface d'un milieu
gélosé à l'aide d'un étaleur. On dépose 0,1
ml de la suspension sur le milieu Baird Parker en cas de la recherche des
staphylococcus aureus par exemple, et avec un râteau, on
étale toute la suspension sur le milieu.
5.2. Ensemencement en profondeur
Souvent utilisé pour le dénombrement des
colonies, on dépose 1ml de la suspension dans une boîte de
pétri vide, et ensuite, on réalise un coulage du milieu de
culture tout en évitant de verser le milieu directement sur l'inoculum.
Mélanger immédiatement et soigneusement le milieu en surfusion et
l'inoculum, de façon à obtenir une répartition
homogène des microorganismes dans le milieu.
6. Protocoles de recherche et de dénombrement des
germes
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