Effets des types de cultures (tissulaire et spore) et d’antibiotiques (chloramphenicol, gentamicine et benomyl) sur le contrôle d’infections en culture in vitro du champignon comestible (pleurotus ostreatusp 969).

REPUBLIQUE DEMOCRATIQUE DU CONGO

ENSEIGNEMENT SUPERIEUR, UNIVERSITAIRE ET
RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE EVANGELIQUE EN AFRIQUE

U.E.A.

B.P : 3323

FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES ET ENVIRONNEMENT

Effets des types de cultures (tissulaire et sporée) et d'antibiotiques

(chloramphénicol, gentamicine et bénomyl) sur le contrôle d'infections en

culture in vitro du champignon comestible (PleurotusostreatusP 969).

Travail de fin de cycle pour l'obtention du diplôme de graduat :

Par : DIEUMERCI MASUMBUKO Roosevelt

Option : Agronomie générale

Encadreur : CT.MUKENGERE BAGULA Espoir Ass. MONDO MUBALAMA Jean

Année académique : 2014-2015.

~ I ~

Prélude.

«Aux âmes bien-nées, la valeur n'attend point le nombre d'années » dit-on.

Pierre Corneille.

~ II ~

Dédicace.

A ma mère Régina M'NTALINDWA.

A mon cher oncle BAGULA NTALINDWA et sa femme CHIREZI BUDUNDWA.

A mon grand et petit frère IMANI MASUMBUKO et MURHABAZI MASUMBUKO.

A mes chers cousins et cousines Espoir BAGULA, Esperance BAGULA, Olivier BAGULA, Willy BAGULA, Patience BAGULA, NYOTA BAGULA, Timothée BAGULA, Joël BAGULA, Christelle BAGULA, et MUKENGE NAMUBAMBA.

Aux familles NTALINDWA et LUMESHA.

A tous mes cousins, cousines, oncles et tantes. A tous mes amis et connaissances.

A celle qui portera la charge du coeur de ce grand homme que l'UEA vient de former pendant trois ans.

Roosevelt MASUMBUKO.

~ III ~

Sigles et abréviations.

UEA : Université Evangélique en Afrique.

PDA : Pomme de terre Dextrose Agar.

CO2 : Dioxyde de carbone.

O2 : Oxygène.

Tcm optimale : l'intervalle des températures optimales pour la fructification.

KV : Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco". MCK : MacConkey(une gélose).

SM2 : Milieu sélectif des bactéries à Gram négatif.

CAN2 : Candida Albicans: Acide désoxyribonucléique.

ARN : Acide ribonucléique. pH : Potentiel en hydrogène.

~ IV ~

Remerciements.

C'est par cet adage de Pierre Corneille, « Aux âmes bien-nées la valeur n'attend point le nombre d'années » que nous avions débuté ces quelques mots de remerciement pour toutes les personnes qui ont contribué à l'achèvement de ce travail.

Nos remerciements les plus sincères s'adressent au chef des travaux MUKENGERE BAGULA Espoir et à l'assistant MONDO MUBALAMA Jean qui ont accepté de diriger ce travail jusqu'à sa fin.

Notre profonde gratitude est exprimée à l'UEA, particulièrement la Faculté des sciences agronomiques et environnement qui, par le doyen KATCHO KARUME via le CEREA, nous a donné l'opportunité d'effectuer notre travail dans son projet « Champignon ».

A mon très cher oncle BAGULA NTALINDWA et sa femme CHIREZI BUDUNDWA, nous leur disons grand merci pour tous ce qu'ils ont fait pour nous, en nous offrant de bonnes conditions d'étude malgré le manque des moyens financiers.

Nos remerciements s'adressent aussi à ma très chère maman Régina M'NTALINDWA qui a supporté toutes nos caprices durant le moment passé ensemble.

Nous ne pouvons pas oublier de remercier les membres du corps scientifique et cadres de la Faculté des sciences agronomiques et environnement de l'UEA, pour l'effort consenti à nous assurer une formation de qualité. Les connaissances acquises auprès d'eux nous ont permis d'élaborer ce travail, particulièrement au Maitre en sciences Gaston AMZATI et le Maitre en sciences AYAGIRWE BASENGERE.

Nos remerciements les plus sincères s'adressent également à mes amis Arsène MUKOME, Charles BAGABO, AMZATI SAIDI, MAJALIWA MAITAPO et AGANZE MWEZE pour les conseils prodigués.

Nous tenons enfin, à remercier nos collègues et camarades de promotion pour leur soutien pendant des bons et mauvais moments passés ensemble.

A tous ceux qui ont contribué tant matériellement que moralement, de près ou de loin pour la réussite de ce travail, nous leur remercions infiniment.

Roosevelt MASUMBUKO.

~ V ~

Listes des tableaux et figures.

Tableau 1 : Quelques familles d'antibiotiques.

Tableau 2 : Taux de reprise des semences primaires.

Tableau 3 : Coloration de Gram. Tableau 4 : Identification du genre.

Tableau 5 : Longueurs des mycéliums et des substrats et présence d'infection pour les semences secondaires.

Figure 1 : A droite : Penicillium (bleu) et Cladosporium (vert foncé). A gauche : Aspergillus : inhalation de spores dangereuse.

Figure 2 : Dispositif expérimental pour les semences primaires.

Figure 3 : Analyse de la vitesse de reprise sur les différents types de cultures.

Figure 4 : Effets du type de culture et d'antibiotiques sur le diamètre total du mycélium.

Figure 5 : Effets de types de cultures et d'antibiotiques sur la vitesse de croissance mycélienne.

Figure 6 : Effets du type des cultures et d'antibiotiques sur le niveau d'infection. Figure 7 : Corrélation entre le niveau d'infection et le diamètre total du mycélium.

~ 1 ~

Introduction

Contexte, problématique et justification du sujet.

Notre province possède une faune et une flore sauvages très riches et encore insuffisamment mises en valeur. C'est entre autre le cas des champignons comestibles qui ; s'ils sont objet de cueillette saisonnière n'ont pas encore été mis en culture (Musibono et al., 1992).

Les champignons comestibles sont des aliments très nutritifs ; ils contiennent des quantités importantes des sels (minéraux, glucides et vitamines) et sont une source importante des protéines (Hexiang et al., 2002).Tout en permettant de varier l'alimentation, les champignons procurent un complément riche en minéraux, en vitamines et même en protéines, rivalisant ainsi avec les meilleurs légumes (Bart, 1994). Ils constituent des produits forestiers non ligneux d'une importance capitale et sont très recherchés pour leur valeur nutritive élevée, leur valeur marchande ainsi que pour les nombreux sels minéraux et vitamines qu'ils contiennent (Breene, 1990 ; Vetter, 1994 ; Mattila et al., 2001 ; Ndoye et al., 2007; Ndong, 2009). Les champignons, étant également pourvus de vertus médicinaux, sont considérés comme idéals pour les hypertendues, les effets rénaux et les diabétiques (Yip et al., 1987; Chandy, 1997) et sont souvent considérés comme aliments thérapeutiques ayant des propriétés anticholesterolémiques (Bobek et al., 1995, Galbavy et al., 1999, Mattila et al., 2000).

Cependant, la nourriture obtenue grâce à la cueillette et qui accompagne les produits de base est saisonnière (De Merode et al., 2004). La saisonnalité dans l'apparition des sporophores reste ainsi un facteur limitant pour leur disponibilité, souvent aléatoire et concentrée sur quelques semaines par an, principalement en saison des pluies (Dibaluku et al., 2010). Dès lors, la mise en culture des champignons se révèle être une activité rentable pour les paysans congolais.

Pour réaliser la culture de ces champignons ; il conviendrait de sélectionner les espèces qui se prêtent bien à la culture mycélienne à partir des spores ou des tissus sporifères. Cette recherche devrait permettre de réduire la dépendance des consommateurs kivutiens par rapport à la cueillette saisonnière qui est insuffisante (Cohen et al., 2002).

Bien que la culture des champignons soit une réalité prouvée ; dans des nombreux pays en voie de développement, la disponibilité du blanc (semences) de bonne qualité représente un facteur de limitation de la culture des champignons. L'importation est souvent entravée par la

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bureaucratie des services des douanes, les couts de transport élevés et la difficulté de garder le blanc à une température basse pendant le transport (Oei, 2005).

La difficulté de produire le blanc (semences des champignons) de manière synthétique est liée à des problèmes d'infections dues aux bactéries ou d'autres champignons en concurrence avec le champignon en culture. Ces bactéries ou autres champignons peuvent avoir une croissance rapide que le champignon en culture et occuper tout le milieu gélosé, d'où l'échec de la culture (Khaled et al., 2007). La température excessive et très basse du milieu de culture peut influencer les infections dans les milieux de culture en favorisant la croissance des pathogènes et l'inhibition de la croissance des champignons en culture (Blaizot, 2011).

La lutte contre les infections dans la culture in vitro des champignons comestibles demeure donc une préoccupation première des recherches sur les champignons. Ces infections peuvent être à l'origine d'une faible production du blanc (semences des champignons) ou presqu'inexistant lorsque les pathogènes prédominent dans les milieux de culture et que lorsqu'il y a d'autres champignons non cultivés qui s'y développent.

Le présent travail a tenté de faire la combinaison de différentes combinaisons d'antibiotiques et types de culture afin d'identifier laquelle assure le mieux le contrôle d'infections en culture in vitro.

Questions de recherche.

Pour notre travail, nous avions conçu les questions suivantes qui nous ont aidés à la réalisation de cette recherche :

? Quels seraient les effets de différents antibiotiques sur le contrôle d'infection en culture in vitro de Pleurotus ostreatus ?

? Quels seraient les effets de différents types de culture sur le contrôle d'infection en culture in vitro ?

? Quels seraient les différents pathogènes susceptibles d'attaquer le milieu de culture pour les différents types de culture utilisés

? Quels seraient les effets de ces différents facteurs (types de culture et antibiotiques) combinés sur la vitesse de croissance et le développement mycélien ?

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Hypothèses.

Nous nous sommes fixés les hypothèses ci-après :

· Les différents antibiotiques permettraient le contrôle efficace des pathogènes sur milieu de culture.

· Les types de cultures auraient une influence non négligeable dans le contrôle d'infections en culture in vitro. La culture sporée produirait mieux que la culture tissulaire sur PDA.

· Le nombre et genres de pathogènes varieraient d'un type de culture à l'autre en production in vitro du champignon.

· Les effets combinés des types de culture à des antibiotiques amélioraient la vitesse de croissance et le développement mycélien.

Objectifs.

Objectif global.

Contribuer au contrôle d'infections dues aux pathogènes en culture in vitro de champignon comestible (Pleurotus ostreatus).

Objectifs spécifiques.

· Evaluer l'efficacité de différents antibiotiques dans la lutte contre les infections en culture in vitro de Pleurotus ostreatus ;

· Evaluer l'efficacité de différents types cultures (tissulaire ou sporée) sur le contrôle d'infections en culture in vitro de Pleurotus ostreatus ;

· Identifier les différents pathogènes (bactéries et champignons compétiteurs) pouvant s'attaquer aux différents types de culture utilisés ;

· Evaluer les effets combinés des types de culture et d'antibiotiques sur la vitesse de croissance et le développement mycélien.

> Hyphe : filament microscopique formé des cellules tubulaires qui constituent la partie végétative (mycélium ou thalle) ou reproductrice (sporophore) d'un champignon.

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Chapitre 1 : Revue de la littérature.

1.1. Généralités sur les champignons : les pleurotes.

Les champignons comestibles font partis du règne de Fungi. Il existe des champignons micro

et des champignons macroscopiques, ils sont encore appelés des micromycètes et des macro-mycètes. Les champignons comestibles sont des macro-mycètes (Leconte, 2006).

1.1.1. Caractéristiques des champignons. Les champignons sont des :

> Eucaryotes ; ils peuvent être multinuclés (homo ou hétérocaryotique) ou uninuclé. Ils sont à l'état végétatif haploïde pour la plupart.

> Thallophytes ; ils ne possèdent pas de racines, ni de tige, ni de feuilles.

> Hétérotrophes ; incapables d'utiliser l'énergie solaire, ils utilisent des nombreuses molécules carbonées fabriquées d'autres êtres vivants. Ils sont non photosynthétiques. > Leur paroi contient de la chitine et de polysaccharides (glucane).

> Ils se reproduisent et se multiplient par l'intermédiaire de spores de nature diverses, issues d'une reproduction asexuée ou sexuée (Oei, 2005).

1.1.2. Biologie, écologie.

L'organisme vivant des Fungi est un mycélium constitué d'un fin réseau de filaments, hyphes.

Sous certaines conditions les hyphes sexuellement compatibles fusionnent et forment les spores. Les structures les plus grandes (supérieures à 1mm) produisant des spores sont appelées des champignons. C'est la partie qu'on remarque le plus dans la nature, mais elle ne constitue qu'une fructification. La partie la plus importante se trouve sous le sol ou à l'intérieur du bois (Oyster, 2004; Oei, 2005).

Les champignons sont un groupe distinct d'organismes plus étroitement liés aux animaux qu'aux plantes (FAO, 1998).

Un champignon est de deux grandes parties : le mycélium qui est l'organe végétatif et le Basidiome (ou carpophore ou encore sporophore) qui est la partie reproductrice.

Le mycélium et la baside sont formés des structures filamenteuses appelées hyphes. Le basidiome peut être porté par un stipe ou peut être sessile ; pour ce fait, on peut distinguer les champignons à chapeau et en croute.

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> Mycélium : masse d'hyphes continus ou cloisonnés par des segments ou des boucles qui constituent la structure d'un champignon.

> Hyménium : couche de cellules issues des hyphes générateurs de la trame, qui tapissent l'intérieur des tubes ou la surface des lames d'un sporophore.

> Baside : cellule fertile d'un champignon formé d'un hymenophore et d'un contexte (Bordas, 1970).

Le pleurote en huitre (Pleurotus ostreatus) pousse de l'automne à l'hiver selon les régions, en touffes sur les feuillus vivants ou tombés. C'est un parasite de blessure mais il est également saprophyte. La température optimale est de 24-26°C pendant la période d'incubation ; et 1012°C pendant la période de fructification. Un abaissement de température favorise l'entrée en fructification. Un taux d'humidité avoisinant la saturation (85-95°C) est meilleur pour le développement des champignons. L'apport d'air neuf est une donnée essentielle pour réduire la teneur en CO2 et réalimenter en O2 les processus de la lignine (Lushiku, 2012).

1.1.3. Nutrition des champignons.

En général, les champignons assurent leur alimentation à partir d'autres organismes, en absorbant les substances nutritives du matériau organique dans lequel ils vivent. Les champignons dépendent du matériel mort et vivant pour leur croissance. Ils obtiennent leurs substances nutritives de trois façons essentielles :

> Saprophytes : champignons florissant sur de la matière morte organique.

> Symbiotique : champignons florissant en collaboration étroite avec d'autres organismes c.à.d. qu'il ya des bénéfices pour chacun d'eux.

> Parasites ou Pathogènes : champignons causant du mal à un autre organisme (Oei, 2005).

La majorité de champignons comestibles sont symbiotiques et forment des mycorhizes avec des arbres. Les champignons comestibles saprophytes sont aussi sauvages, mais ils sont mieux connus mais plus estimées sous leurs formes cultivées. Les pleurotes font partis des champignons comestibles saprophytes (Prance, 1984 ; Oei, 2005).

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1.1.4. Classification.

Malgré des différences fondamentales, les champignons sont classifiés comme des plantes. La classification des champignons comme plantes a des conséquences pratiques faibles. L'ethnomycologie est le terme correct qui indique que des champignons sont impliqués .De façon similaire, la flore se réfère seulement aux plantes. Le terme équivalent pour les champignons est mycètes (mycota) (Ertrug, 2000).

Comme les plantes, les champignons sont des êtres vivants. Autrefois, on répartissait les êtres vivants en deux grands règnes : le règne animal et le règne végétal. Aujourd'hui on les classe en 6 règnes : le règne animal, végétal, champignon, protiste, bactéries et le règne archéobactérie.

Le règne Champignon renferme cinq embranchements : Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota et Champignons imparfaits. Les Pleurotes font parti de l'embranchement des Basidiomycota et la plupart de champignons comestibles font parti de cet embranchement (Sergeeva, 2000).

1.1.4.a) Caractéristiques de l'embranchement des Basidiomycètes (Pleurotes).

Les Basidiomycètes forment un de cinq embranchements de champignons. Ils renferment plus de 23.000 espèces différentes parmi lesquelles les champignons comestibles, les champignons vénéneux, les satures, les vesses de loup, les polypores ainsi que deux groupes importants d'agents pathogènes des plantes ; les rouilles et les charbons. Les polypores jouent un rôle essentiel dans la décomposition de la litière végétale : ils constituent souvent les deux tiers de la biomasse vivante du sol (les animaux non compris). Ils sont caractérisés par des spores formées à l'extrémité des cellules fertiles, les basides. Le mycélium des Basidiomycètes est toujours cloisonné, mais les cloisons sont perforées .Chez de nombreuses espèces, le pore de la cloison possède une marge renflée en forme d'anneau ou tonnelet appelé dolipore. Le pleurote appartient au règne de Fungi, à l'embranchement ou division des Basidiomycota, à la classe des Agaricomycetes, à la sous- clase des Agaricomycetidae, à l'ordre des Agaricales, à la famille des Pleurotaceae et au genre Pleurotus (Hexiang, 2002 ; Mikiashvili, 2006).

Le nom Pleurote s'applique à plus de 20souches de champignons différentes qui se distinguent par la température exigée, la couleur et le rythme de croissance (Oei, 2005). Le genre Pleurotus n'est pas considéré comme un champignon non resupiné, et la plupart de souches sont monomitiques, c'est-à-dire qu'elles ne possèdent qu'un seul type d'hyphes, ce qui leur confère une consistance molle. Seul Pleurotus dryinus peut parfois être dimitique, ce

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qui signifie qu'il a des hyphes squelettiques supplémentaires qui lui donnent une consistance plus ferme comme celles des polypores. Le genre Pleurotus comprend un groupe de champignons comestibles ligninolytiques ayant des propriétés médicinales et d'importantes applications biotechnologiques et environnementales (Cohen et al., 2002).

1.1.5. La culture des champignons.

1.1.5.a) Croissance mycélienne et blanc.

Dans la culture des champignons comestibles, on n'utilise pas les spores. Leur petite taille rend leur manipulation délicate et leurs caractéristiques génétiques risquent d'être différentes de celles de leurs parents. De plus, ils mettent un certain temps à germer alors que d'autres types de champignons, les moisissures vertes par exemple, germent et se propagent bien plus rapidement. Le champignon sélectionné doit pouvoir coloniser le substrat avant d'autres champignons ou bactéries. A cette fin, on mélange un mycélium cultivé préalablement (libre de tout contaminant) avec un substrat stérile, ce qui donne ce qu'on appelle le blanc. Cette technique donne au champignon cultivé une longueur d'avance sur les autres Fungi (Oei, 2005).

1.1.5.b) L'envahissement du blanc.

Comme dans la nature, le mycélium se propagera dans le substrat en utilisant les substances nutritives qui s'y trouvent. C'est ce qu'on appelle l'envahissement du blanc. Lorsque certaines d'entre elles sont épuisées ou si le temps change, le mycélium atteindra une phase différente, celle de la reproduction sexuelle. On met en culture du tissu prélevé sur un champignon et on le dépose dans un substrat approprié. Une fois que celui-ci est complètement envahi, on l'utilise pour cultiver des champignons.

Pour la plupart des espèces la température optimale pour l'envahissement du blanc est d'environ 25 °C. De plus, l'environnement peut stimuler la croissance du mycélium : une forte concentration de CO2 lui est favorable (mais pas à la culture).

Une fois qu'il a colonisé le substrat, le mycélium est en état de produire des fructifications dont le nombre et la qualité dépendront de l'environnement (Oei et al., 2005).

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1.1.5. Production de blanc de champignon.

La semence de champignon (matériau de propagation) est généralement désignée sous le nom de blanc.

Disponibilité du blanc.

Dans de nombreux pays en développement, la disponibilité de blanc de bonne qualité représente un facteur de limitation de la culture des champignons. L'importation est souvent entravée par la bureaucratie des services de douanes, les frais de transport élevés et la difficulté à garder le blanc à une basse température pendant le transport. C'est pourquoi le producteur sera peut-être contraint de produire son propre blanc. Si l'on peut obtenir du blanc de bonne qualité du champignon désiré à un prix raisonnable, il vaut mieux se concentrer sur les processus de croissance du champignon. Le processus complet de production de blanc consiste à préparer le milieu de culture, à remplir les éprouvettes ou les boîtes de Pétri et à les stériliser, puis à inoculer des récipients plus grands avec cette culture. La production de blanc nécessite un laboratoire désinfecté et des connaissances spécialisées. La production de blanc revient à mettre du mycélium du champignon désiré dans des substrats adéquats et stérilisés dans des conditions aseptiques. Mais, dans la pratique, ce processus n'est pas aussi simple qu'il en a l'air. Il faut maintenir dans des conditions strictes des souches appropriées du champignon désiré pour éviter leur dégénération. Lorsque c'est impossible ; la production de blanc devrait se faire à partir de cultures de tissu d'un champignon frais et sain. De plus, la chambre de production de blanc doit toujours être méticuleusement propre pour éviter toute contamination.

La culture de démarrage.

La culture de démarrage (ou culture mère) se fait à partir d'une fructification fraîche et saine ou provient d'un producteur de blanc ou d'un laboratoire. Elle permet de produire plusieurs cultures d'agar qui servent à inoculer du blanc dans des récipients plus volumineux (des flacons par exemple), puis à inoculer le substrat final de blanc. Une unité de production de blanc nécessite l'équipement minimum suivant :

? du matériel de stérilisation (autocuiseur, autoclave) ;

? un environnement stérile : boîte à inoculation ou à écoulement laminaire ;

? un équipement de laboratoire : boîtes de Pétri, des éprouvettes, une balance, de

l'alcool, une flamme ;

? une chambre à incubation.

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On trouve généralement ce genre d'équipement dans les hôpitaux, les centres de recherche et les universités. Les matières premières consistent en :

? des ingrédients pour la préparation du milieu ;

? du matériau du substrat (céréales, baguettes de bois, sciure de bois ou même fibre de

noix de palme) ;

? des champignons sains de culture ou frais, d'une souche de l'espèce désirée ;

? récipients à blanc (flacons ou sacs en plastique).

Dans les pays peu producteurs de champignons, on se procurera le blanc auprès d'une université ou d'un centre de recherche au début du projet. Vous trouverez des adresses de producteurs de blanc dans les Adresses Utiles (Oei, 2005).

La stérilisation.

Les céréales, la sciure ou le compost contiennent un grand nombre de Contaminants. Un seul grain de céréale peut héberger des milliers de bactéries, de moisissures et d'actinomycètes. Un seul grain de céréale peut héberger des milliers de bactéries, de moisissures et d'actinomycètes. Chacun de ses éléments, appelés contaminants, est capable d'infecter des substrats mal stérilisés ou inoculés dans des conditions d'hygiène insuffisantes. Un chauffage de 15 minutes à 121°C suffit généralement à tuer tous les organismes. Il faut un certain temps pour que la vapeur chauffe le coeur des substrats à cette température. Cela dépend de la façon dont le récipient de stérilisation ou de pasteurisation a été rempli et de la capacité du brûleur. La plupart du temps, les sacs de substrat doivent être chauffés à la vapeur pendant au moins 6 heures pour que leur centre soit suffisamment exposé à la chaleur. Stérilisez les sacs de 4 litres avec 2 kg de substrat de blanc pendant au moins 2 heures a une température de 121°C (Van et al., 2005).

De bonnes conditions de propreté sont indispensables à la production de blanc. En particulier, l'ouverture des récipients contenant le milieu stérilisé doit être effectuée dans des conditions aseptiques. L'air ambiant contient de nombreux contaminants susceptibles d'infecter facilement le milieu stérilisé. Il faut donc pratiquer les manipulations et la préparation des cultures (de tissu) dans des boîtes spéciales placées dans des chambres d'inoculation (Oei, 2005).

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1.2. Les milieux de culture.

Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactéries, de champignons, de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement, mais aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre bactérien ou une famille. Ainsi, selon le but de la culture, il est possible de placer les micro-organismes dans des conditions optimales, ou tout à fait défavorables. Il se compose d'une base (agar-agar, eau, minéraux,...) ainsi que d'un indicateur coloré de pH ou de réaction d'oxydoréduction pour permettre de formuler des hypothèses sur le genre.

Il existe aussi des bouillons de culture qui possèdent la même fonction, mais ces milieux ne contiennent pas d'agar-agar, ils sont donc totalement liquides (Galveston et al., 1996).

1.2.1. Les différents types de milieux.

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences nutritives des micro-organismes. Ainsi on distingue généralement :

? Milieu minimum.

Un milieu minimum ou milieu défini est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne, sous une forme utilisable par des bactéries n'ayant pas d'exigence particulière.

Composition d'un milieu minimum:

· Une source de carbone et d'énergie, généralement le glucose.

· Une source de potassium et de phosphore: K2HPO4.

· Une source d'azote et de soufre: (NH4)2SO4_.

· Une source de magnésium: MgCl2_.

· Une source de calcium: CaCl2_.

· Une source de fer: on emploie le citrate de fer (le citrate a pour rôle de maintenir le fer en solution).

· Une source d'oligo-éléments: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti.

· Une source d'eau, indispensable à toute forme de vie: on utilise l'eau distillée (stérile).

· Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: KH2PO4 par exemple.

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En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles ne peuvent synthétiser ces produits (Galveston et al., 1996).

? Milieu de culture empirique.

Un milieu de culture dit empirique est un milieu dont on ne connaît pas exactement la composition.

Ainsi, dans le milieu type coeur-cervelle, il y a de l'eau, de l'agar-agar, de l'hydrolysat de coeur et de cervelle sans que l'on en connaisse les aspects qualitatifs et quantitatifs. Il sera donc utilisé uniquement pour la croissance des bactéries. Il n'a pas d'effet sélectif.

? Milieu de culture sélectif.

Les milieux de culture dits sélectifs permettent uniquement la culture de certains genres de micro-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui inhibent la croissance des microorganismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte concentration, le thiosulfate de sodium, le cristal violet ou certains antibiotiques, etc.

Exemples de milieux sélectifs :

? Milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles (Shigella s'y développe moins vite : environ 48 à 72 heures avant d'obtenir une culture exploitable).

? Milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes.

? Gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la pousse des bactéries à Gram positif (action de la vancomycine) et de la plupart des entérobactéries (action de la Kanamycine). Sur ce milieu, poussent préférentiellement des bactéries anaérobies strictes.

? Milieu de culture enrichi.

Ils contiennent, outre les composants de base, des composants indispensables aux bactéries, que celles-ci ne peuvent pas synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des bactéries dites exigeantes et auxotrophes.

Par exemple : les milieux au sang frais (le sang est riche en nutriments divers): Gélose au sang frais ou cuit. Les milieux avec du sérum, du jaune d'oeuf : Gélose Baird Parker ou dite BP (CUQ, 2000).

CAN2 : milieu sélectif des levures qui permet la mise en évidence de Candida albicans par la mise en évidence de l'activité hexosaminidase (Baron's et al., 1996).

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? Milieu différentiel.

Le milieu de culture dit différentiel ou indicateur permet de distinguer deux types de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu met en évidence certaines caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l'aptitude à dégrader un substrat) en présence d'indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs colorés de pH ou d'oxydoréduction (tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le bleu de méthylène).

On retrouve parmi les milieux différentiels :

? La gélose MacConkey (MCK), qui différencie la fermentation du lactose. De plus, cette gélose est sélective dans la mesure où elle ne permet que la croissance des bacilles GRAM négatif. La gélose Drigalski possède les mêmes propriétés.

? La Gélose Chapman (MSA), milieu sélectif des staphylocoques qui différencie la fermentation du mannitol permettant une orientation entre autres vers Staphylococcus aureus.

? La gélose Hektoën, qui différencie la fermentation de 3 glucides (lactose, saccharose et salicine) ainsi que la production de sulfure d'hydrogène. Cette gélose est sélective des bacilles GRAM négatif, elle est particulièrement adaptée à la recherche d'entérobactéries pathogènes dans les selles.

? Milieu chromogène (ou discriminant).

Ce milieu peut être sélectif ou non. Son principe repose sur la présence d'un ou plusieurs substrat(s) couplé(s) à une molécule chromogène. Lorsque ce substrat est métabolisé par une enzyme bactérienne spécifique, le chromogène associé prend une couleur particulière (il devient un chromophore) directement lisible sur la colonie.

Parmi ces milieux, on trouve :

SM2 : milieu sélectif des bactéries à Gram négatif qui permet la mise en évidence de Salmonella dans les selles grâce à la révélation d'une activité estérase que spécifique des salmonelles.

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1.3. Les infections en bactériologie.

Une infection est une maladie provoquée par des agents pathogènes vivants ; c'est une multiplication et persistance d'un microorganisme pathogène dans un organisme.

1.3.1 Les infections primaires.

Par infections primaires, celles qui surviennent durant la phase stérile durant laquelle le mycélium envahit le milieu de culture ou la surface du agar.

1.3.2. Identification de l'infection.

Nous avons l'impression que quelque chose d'autre que du mycélium pousse dans votre boîte de Pétri ou votre bocal de seigle, un micro-organisme est entré d'une façon ou d'une autre dans le processus et est en train de prospérer à la place du mycélium. On a à faire à une contamination (Nzohabonimana, 1999).

Les contaminations prennent l'aspect de taches d'un peu toutes les couleurs (rouge, vert, noir,...) mais sauf le blanc. D'autres ressemblent à un liquide visqueux blanchâtre et émet une odeur de moisi (infection bactérienne).

Cette infection bactérienne est moins facile à détecter à l'oeil nu lorsqu'elle apparaît dans un bocal de seigle, mais si vous constater que le mycélium s'arrête de pousser sans raison, il peut s'agir de cette infection : si aucune autre infection de couleur louche est présente, ouvrer le pot et sentir prudemment; si ça sent le moisi : jetez ou nettoyez ce pot. De toute façon, si vous ouvrez le pot avant que le mycélium n'ait colonisé la majeure partie du seigle, vous devrez le jeter, car l'infection devient inévitable (Petignat et al., 2005).

En revanche sur les boîtes de Pétri, les infections sont facilement repérable, y compris les infections bactériennes. En général, les infections se développent plus vite que le mycélium: si de minuscules tâches apparaissent un jour, vous serez très vite fixé. Le mycélium devrait être blanc.

L'apparition de mycélium jaune, vert ou gris à d'autres endroits de la surface trahit la présence d'une contamination fongique. Une croissance crémeuse et brillante révèle souvent une contamination bactérienne (Aminetou et al., 2008).

Les vecteurs les plus fréquents des infections sont :

--' 14 --'

? L'air ;

? Le cultivateur, ses habits, ses mains, ses expirations, etc. ? Le milieu de culture, etc.

1.3.3. Les agents infectieux.

Il existe différents agents infectieux (microbes ou micro-organismes) classés dans différentes catégories (familles). Les principales catégories sont :

· les bactéries, les virus, les champignons et les parasites.

Tous les micro-organismes (germes) n'ont pas les mêmes capacités à provoquer les

infections, certains étant pratiquement toujours associés à des manifestations cliniques (maladies) alors que d'autres ne provoquent qu'exceptionnellement des maladies (Roussos, 1985).

Les prions bien que ne faisant pas partie des microbes (germes) sont responsables de maladies infectieuses transmissibles.

Figure 1 : A droite : Penicillium (bleu) et Cladosporium (vert foncé). A gauche : Aspergillus.

Pour ce qui concerne les bactéries, il existe deux grands groupes : les bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif. Les bactéries se repartissent en 3 formes : les sphères (cocci), les bâtonnets et les formes courbées. Les bactéries peuvent se retrouver dans deux états principaux : l'état végétatif (croissance) ou l'état de repos. C'est à l'état de repos que la bactérie est la plus résistante. Les bactéries du genre Bacillus et Clostridium sont des bactéries que l'on trouve sous forme de spores. La forme de spores est très résistante aux produits de désinfection et nécessite des températures élevées lors de la stérilisation pour leur destruction.

--' 15 --'

De plus la majorité des désinfectants sont inefficaces sur les bactéries sous forme sporulée (Petignat et al., 2006).

1.3.4. Mesures à prendre.

Il faut absolument empêcher que l'infection se repende : Evitez autant que possible d'ouvrir le récipient contaminé à proximité des autres récipients non contaminé. Dans le cas où on veut garder le récipient pour observation ou pour une tentative d'épuration, il ne faut pas les stocker avec les récipients sains. Evidemment, il faut se laver parfaitement les mains après avoir manipulé des récipients infectés.

Lorsque on constate la contamination d'une boîte de Pétri, on prend les mesures qui suivent :

? Si on estime qu'elle est utilisable dans le but d'épuration (découpe d'une partie de mycélium apparemment non contaminée), on la stocke et on l'utilise le plus vite possible. ? Sinon on la met dans un sac plastique et on la jette tout de suite (Aminetou et al., 2008).

1.4. Les antibiotiques.

Un antibiotique est une substance qui permet de traiter une infection bactérienne, soit en tuant les bactéries (bactéricides) ou en empêchant les bactéries de se multiplier (bactériostatiques). La découverte des antibiotiques a constitué une véritable révolution dans le domaine des maladies infectieuses. L'antibiothérapie a sauvé un très grand nombre de vies et l'on a cru que les maladies infectieuses seraient un jour toutes jugulées. Suite aux mécanismes de Resistance développés par les bactéries, les antibiotiques perdent leur efficacité et des maladies que l'on croyait maitrisaient réapparaissent. Les antibiotiques n'ont aucune efficacité envers les virus et les parasites (Bally et al., 2006).

1.4.1. Mode d'action des antibiotiques.

Les antibiotiques d'une même famille visent tous une même cible moléculaire chez la bactérie. Ainsi, les bêta-lactamines et les glycopeptides inhibent des enzymes responsables de la synthèse de la paroi bactérienne, ce qui provoque la destruction du micro-organisme. Les quinolones, quant à elles, bloquent les enzymes qui participent à la réplication de l'ADN de la bactérie. Cette dernière ne peut alors plus se diviser, ni proliférer. Enfin, les tétracyclines, les aminosides et les macrolides empêchent la synthèse des protéines en inactivant un des

-' 16 -'

éléments de la chaîne de fabrication de ces dernières : le ribosome. Là encore, le microorganisme est incapable de se diviser (Courvalin et al., 2008).

1.4.2. Effets secondaires des antibiotiques.

Les biologistes ont d'ailleurs coutume de dire qu'une molécule qui n'a pas d'effet secondaire n'a probablement pas d'action primaire ! Même si les antibiotiques agissent peu sur les cellules de mammifères, et donc sur celles de l'homme, ils induisent des effets secondaires, en particulier dans les traitements prolongés ou fortement dosés. Les plus fréquents touchent l'appareil digestif. La prise durable d'antibiotiques peut en effet provoquer la disparition d'une partie de la flore intestinale et déclencher des diarrhées (Lemarchand et al., 2008).

1.4.3. Fabrication des antibiotiques.

Pour les antibiotiques naturels, il faut sélectionner des souches de micro-organismes qui produisent le plus d'antibiotiques et déterminer les meilleures conditions de culture température, nature du support, etc. Par exemple, la pénicilline G est aujourd'hui produite non pas à partir du Penicillium notatum de Fleming mais du Penicillium chrysogenum. Concrètement, ces moisissures sont mises dans des cuves de fermentation, où elles se multiplient leur masse double toutes les six heures environ. Après deux jours, elles produisent la pénicilline. La quantité d'antibiotique fabriquée est variable d'une molécule à l'autre. Pour la pénicilline, elle est de l'ordre de quelques grammes par litre de culture contre seulement 0,1 gramme par litre du temps de Howard Florey et d'Ernest Chain. L'antibiotique est ensuite extrait, purifié par voie chimique et, enfin, conditionné. Dans le cas de la pénicilline, 10 litres de culture suffisent ainsi à produire 10 jours de traitement pour une personne. L'enchaînement des opérations est le même pour les antibiotiques semi-synthétiques à la différence que le composé naturel de départ est modifié chimiquement pour améliorer son activité, diminuer sa toxicité, etc. (Bally et al., 2006).

1.4.4. Resistance aux antibiotiques.

Il s'agit de la capacité de certaines bactéries à survivre malgré l'exposition à un antibiotique. Lorsque les bactéries de la même espèce sont insensibles à un antibiotique particulier, on parle de résistance « naturelle ». C'est le cas, par exemple, des streptocoques, insensibles aux aminosides. Ce type de résistance explique pourquoi les antibiotiques sont toujours prescrits contre des infections précises, selon un dosage et une durée déterminés. Les résistances peuvent également être « acquises », lorsque, dans une population bactérienne, apparaît une

~ 17 ~

bactérie insensible à l'antibiotique. Celle-ci peut avoir gagné cet avantage à la faveur d'une mutation spontanée au niveau d'un de ses gènes. Elle transmettra alors la capacité de résister à ses filles. Le cas s'est présenté pour le bacille tuberculeux, devenu résistant à la streptomycine et à la rifampicine à la faveur de mutations spontanées. Mais de telles mutations sont rares : elles concernent environ une bactérie sur dix millions, voire un milliard. En fait, 80 % des cas de résistance bactérienne connus sont apparus à la suite de la transmission d'un fragment d'ADN d'une bactérie résistante à une bactérie sensible, lequel fragment contenait un gène conférant la protection (Courvalin et al., 2008).

1.4.5. Mécanismes permettant à une bactérie de résister à un antibiotique.

La bactérie peut fabriquer une enzyme capable de neutraliser l'antibiotique : la pénicillinase, par exemple, inactive les pénicillines, l'acétylase inhibe le chloramphénicol, etc. Le microorganisme peut posséder une membrane imperméable à l'antibiotique ou être capable de rejeter cette substance dans le milieu extérieur, grâce à une pompe membranaire qui refoule les molécules hors de la cellule, les empêchant de se concentrer, et donc d'agir sur la cible. Le micro-organisme peut enfin présenter une modification au niveau de la cible de l'antibiotique : le site de fixation sur la cellule est modifié, ce qui empêche l'antibiotique de se lier, et par conséquent d'être efficace.

Les antibiotiques ne sont efficaces contre les virus simplement parce que les virus ne possèdent pas de métabolisme propre : pour se multiplier, ils détournent les outils de la cellule qu'ils colonisent. Ne présentant pas les cibles sur lesquelles les antibiotiques sont actifs, les virus leur échappent. Seuls les antiviraux permettent éventuellement d'en venir à bout.

L'utilisation massive des antibiotiques accentue l'apparition, chez les malades, de bactéries résistantes. Si le personnel soignant ne se désinfecte pas correctement les mains, il peut alors transporter ces micro-organismes d'un patient à un autre, augmentant le risque que les malades, déjà fragilisés, contractent une infection supplémentaire, plus difficile à soigner (Lemarchand et al., 2008).

-' 18 -'

1.4.6. Quelques familles d'antibiotiques.

Tableau 1 : quelques familles d'antibiotiques.

Antibiotiques/Fa Activités Mécanismes d'action, cibles Mécanismes de

milles résistance

â -lactames Gram+ Gram-

Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne

-Modification de la cible

-Production de â - lactamase

Glycopeptides Gram+ Inhibition de la synthèse de la

paroi bactérienne

Aminoglycosides Gram- Inhibition de la synthèse des

protéines, ribosomes

-Modification de la cible

-Modification de la cible

-Production d'un
inhibiteur

Tétracyclines Gram+ Inhibition de la synthèse des

Gram- protéines, ribosomes

-Modification de la cible

-Mécanisme de reflux

Quinolones Gram+

Gram-

Rifampin Gram+ Inhibition de la synthèse de

l'ARN, ARN polymérase

Macrolides et

Lincosamides

Trimethoprim et Sulfonamides

Gram+ Gram-

Gram+ Gram-

Inhibition de la synthèse des protéines, ribosomes

Inhibition de la réplication de l'ADN, ADN gyrase

Inhibition de la synthèse des acides nucléiques, enzymes

-Modification de la cible

-Imperméabilité de la paroi Gram-Modification de la cible

-Modification de la cible

-Modification de la cible

--' 19 --'

1.4.7. Quelques antibiotiques.

a) Chloramphénicol.

Le chloramphénicol est un antibiotique de la famille des phénicolés, commercialisé sous la marque Chloromycetin. Il n'est pratiquement plus utilisé que par voie locale en médecine humaine du fait de sa toxicité potentielle. Entre autres, il peut provoquer une aplasie médullaire due à l'inactivation des mitochondries des cellules de la moelle osseuse. Il a été isolé la première fois en 1947 de Streptomyces venezuelae, une bactérie du genre Streptomyces. Il est utilisé en association avec la gentamicine dans des milieux de culture en mycologie pour empêcher la croissance des bactéries et favoriser ainsi celle des champignons. Le chloramphénicol est un antibiotique bactériostatique (Anonyme, 2009).

b) Gentamicine.

La gentamicine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides utilisé pour traiter divers types d'infections bactériennes, en particulier celles provoquées par des bactéries à Gram-négatif. La gentamicine agit en se liant à l'ARN ribosomique au site A du ribosome bactérien, qui est le site de décodage des codons de l'ARN messager. La fixation de la gentamicine augmente fortement le taux d'erreur de lecture par le ribosome, ce qui provoque la synthèse de protéines anormales, dont l'accumulation est létale pour la cellule (Vidaver, 2002).

c) Bénomyl.

Le bénomyl quant à lui, est un produit phytosanitaire, un fongicide qui lutte contre les maladies fongiques. Il appartient à la famille chimique des carbamates. Le produit actif est le Benlate (Anonyme, 2009).

--' 20 --'

Chapitre 2 : Méthodes et matériels.

2.1. Milieu d'étude.

Notre milieu d'étude était l'Université Évangélique en Afrique (UEA) se situant en République Démocratique du Congo dans la province du Sud-Kivu, ville de Bukavu. Cette université se situe à 02°32'36,1» de latitude Sud et 028°51'32,9» de longitude Est et 1661m d'altitude.

Notre étude s'est déroulée dans le laboratoire de la biologie moléculaire à la faculté des sciences agronomiques et Environnement, où la température régnante est autour de 25°C. Dans ce laboratoire, la préparation de la semence primaire et secondaire s'y était effectuée dans des conditions aseptiques et les précautions usuelles de manipulation étaient réunies tout au long de la manipulation.

2 .2. Matériels utilisés.

a) Matériel biologique.

La souche P969 de l'espèce Pleurotus ostreatus a été utilisée comme matériel biologique. Elle a été choisie pour son adaptabilité dans la région tropicale et son appréciation par la population consommatrice. Elle présente les caractéristiques particulière dont : le diamètre chapeau (carpophore) convexe, charnu, bombé puis plat parfois un peu déprimé (en coquille). La marge est enroulée, gris ardoisé avec des reflets bleuâtres, parfois gris beige, gris brunâtre (colorations assez variables). Lames peu décurrentes et peu serrées, blanches. Stipe souvent court (parfois nul), excentrique à latéral, blanc. Chair blanche à odeur agréable.

b) Matériel chimique.

Les matériels chimiques utilisés dans la présente étude étaient les antibiotiques. Trois antibiotiques ont été utilisés. Il s'agit du chloramphénicol et de la gentamicine (bactéricides) et du bénomyl (fongicide). Les caractéristiques relatives à ces différents antibiotiques sont décrites dans la revue de la littérature.

c) Matériels du laboratoire.

Ces matériels sont ceux qui étaient utilisés pour l'exécution de nos expériences :

1°) La boite de pétri : servait à recevoir le milieu de culture, c'est un bocal de conservation de la gélose. La boite de pétri a un diamètre de 8,6cm et une surface de 58cm²soit 5,8.10-3m2.

Figure 2 : Dispositif Expérimental.

--' 21 --'

2°) Balance de précision : elle nous aidait à déterminer exactement la quantité de substances à utiliser dans le milieu de culture.

3°) Stérilisateur : c'est un instrument qui nous permettait de stériliser les outils pour éviter la contamination.

4°) Les éprouvettes, l'erlenmeyer (ballon à fond plat) : aidait pour le mélange des solutions.

5°) Autocuiseur et autoclave : pour stériliser les récipients destinés au blanc (Wageningen, 2005).

7°) Les écouvillons : nécessaires pour l'écouvillonnage consistant à faire rouler délicatement les écouvillons sur les milieux sélectifs.

10°) Le bec bunsen (à flamme), pour la stérilisation : travailler autour de 30cm à coté du bec bunsen pour assurer l'asepsie.

11°) Incubateur : pour l'incubation à 27°C pendant 7-10 jours.

2.3. Méthodes.

2.3.1. Dispositif expérimental.

V1	T1	T2	T3	T
V2
	T1	T2	T3	T

Notre essai a été conçu suivant un dispositif en split-plot. Deux facteurs étaient en étude : le facteur principal était le type de culture avec deux modalités (culture tissulaire et culture sporée) et le facteur secondaire, l'antibiotique avec quatre modalités (chloramphénicol, gentamicine et bénomyl et témoin). Les différents traitements sont repris dans le dispositif ci-dessous.

--' 22 --'

Légende.

V1= culture tissulaire , V2= culture sporée. T = témoin , T1=bénomyl.

T2= chloramphénicol , T3= gentamicine.

2.3.2. Conduite de l'essai.

a. Préparation du milieu de culture, PDA pour la semence primaire.

Pour la préparation de milieu de culture, PDA (pomme de terre, dextrose et agar) il fallait :

-Prendre 200g de pomme de terre dans un litre d'eau ;

-Ajouter 20g de dextrose ;

-18(20) g d'agar ;

-Faire la filtration sur papier -filtre ou sur tissu ;

-Ces milieux sont coulés dans des boites de pétri à raison d'au moins 20ml par boite de pétri ; les milieux et la verrerie doivent être stérilisés (Paulus, 1992).

b. Préparation des semences à utiliser dans la culture. Deux types de semences à utiliser pour évaluer l'effet de type de culture :

-Les tissus : prendre une partie de la souche Pleurotus ostreatus ; puis repiquer les fragments dans différentes boites de pétri sur PDA de façon aseptique.

Maintenir l'incubation à 27°C Pendant 7-9Jours.

-Les spores : après préparation du milieu de culture ; PDA (filtration de cuisson dans un litre d'eau déminéralisée de 200g pomme de terre+20g agar +20g dextrose, porté à 1l).Le milieu est chauffé pendant environ 15minutes jusqu'à dissolution des ingrédients et obtention d'un mélange homogène qui est réparti dans des tubes à essai. Ces derniers doivent être bouchés avec un tampon d'ouate coiffé d'un morceau de papier aluminium avant d'être stérilisés (120°C, 15-20minutes et une pression de 1 atmosphère). Après stérilisation, les tubes sont placés en position inclinée afin de maximiser la surface de contact du milieu de culture après refroidissement. La sporulation est obtenue en plaçant dans le goulot du tube à essai contenant le milieu de culture, un morceau de chapeau de Pleurotus ostreatus fixé à un ruban para film,

--' 23 --'

face hymeniale dirigée vers le milieu de culture. 12h après, le morceau de chapeau est enlevé et le tube à essai est rebouché en conditions aseptiques au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool. Le tube inoculé est placé dans un incubateur Millipore à 32°C pendant 48h (Dibaluka, 2005).

c. Contrôle d'infections.

Après que les conditions aseptiques soient réunies ; nous appliquerons les antibiotiques (chloramphénicol et gentamicine) et le fongicide (bénomyl). Les antibiotiques seront appliqués pour inhiber la colonisation bactérienne des milieux de culture et le fongicide sera utilisé pour anéantir d'autres colonisations fongiques autres que la souche en culture. La quantité d'antibiotiques qui sera utilisée est de 0,5g /l.

N.B. Les antibiotiques sont soit en injection ou des comprimés.

d. Paramètres à observer lors de la culture in vitro.

-Le taux de reprise ;

- Jour de reprise ;

- Abondance de la colonisation mycélienne en culture ;

-Homogénéité mycélienne c.à.d. présence ou non d'infections (bactériennes par exemple) ;

-Longueur et vitesse de croissance mycélienne était évaluée à l'aide d'une latte graduée. Ainsi la vitesse de croissance sera calculée en utilisant la formule suivante : Vn-Vn-1/Nbre de jour, ensuite la moyenne de variation sera calculée, V1+V2+Vn.../Nbre de jour.

e. Préparation de la semence secondaire.

Le substrat utilisé pour la préparation de la semence secondaire était constitué des grains de sorgho. Les grains de sorgho ont été cuits dans une casserole pendant 2 à 3h, puis essoré au soleil pour débarrasser le sorgho de l'eau, le son de maïs a ensuite était ajouté au sorgho mais en petite quantité en raison de 200g pour 2,5 kg de sorgho puis ont été répartis dans les bocaux(boites à mayonnaise. Les bocaux ont été ensuite hermétiquement fermés et un tampon d'ouate fut placé au milieu du couvercle vissé et enfin la stérilisation était faite à l'autoclave à une température de 121°C pendant 30 à 45 minutes.

Après la stérilisation, les bocaux furent refroidis pendant 45minutes. L'inoculation du mycélium (semence primaire « stater ») sur le substrat de semis secondaire a été réalisée à

--' 24 --'

côté d'un bec bunsen, dans des conditions de stricte asepsie. Le matériel de prélèvement et de transfert de l'inoculum a été stérilisé grâce à la flamme du bec bunsen. L'incubation des grains de sorgho a été réalisé dans les conditions de 27° pendant 21 à 30 jours dans une l'obscurité totale, dans un milieu fermé, et le produit obtenu à l'issue de cette opération est appelé « blanc-mère » ou « blanc de semis ».

f. Analyses des données.

L'analyse des données a été réalisée par l'utilisation du logiciel Excel version 2007. Ici, les données seront décrites par les moyennes de diamètre mycélien en fonction des milieux de cultures et d'antibiotiques; et le niveau d'infections dans chaque types de culture et d'antibiotiques. La régression linéaire était réalisée pour voir la corrélation existant entre le niveau d'infections et le diamètre mycélien en fonction de types de culture et d'antibiotiques.

--' 25 --'

Chapitre 3 : Présentation et discussion des résultats.

3.1. Présentation et interprétation des résultats.

Le tableau qui suit va nous montrer comment les semences de champignons Pleurotus

osteatus (P969) se sont comportées pendant la reprise dans la culture in vitro tissulaire et sporée en fonction d'antibiotiques.

Tableau 2 : Taux de reprise des semences primaires.

Types de culture	Antibiotiques	Taux de reprise(en %)	Jour de reprise(en jour)	Degré d'infection
Tissulaire	Sans	40	1.5	**
	Chloramphénicol	100	2.8	*
	Gentamicine	100	2	*
	Bénomyl	20	1	**
Sporée	Sans	20	2	***
	Chloramphénicol	60	6	*
	Gentamicine	80	6.7	*
	Bénomyl	60	5.3	**

Avec, *: moins sévère, **: sévère, ***: très sévère.

Du tableau 2, la culture tissulaire présente des meilleurs taux de reprise que la culture sporée. La culture tissulaire plus les antibiotiques (chloramphénicol et gentamicine) donne le meilleur taux de reprise (100%).La culture tissulaire sans antibiotique a un taux de reprise de 40% alors que le faible taux de reprise (20%) est enregistré pour la culture tissulaire en combinaison avec le bénomyl (un fongicide).

Pour la culture sporée, le taux de reprise élevé est enregistré à la gentamicine (80%) alors que le chloramphénicol et le bénomyl ne sont pas différents (60%) et enfin, la culture sporée sans antibiotique a donné le taux de reprise le plus faible (20%).

En culture sporée, la reprise la rapide est trouvée chez la culture sans antibiotique avec un temps moyen de 1,2 jour et la moins rapide est chez la gentamicine avec un temps de 5,4

--' 26 --'

Pour la précocité de reprise, la culture tissulaire est plus précoce que celle sporée. Les premières reprises chez la culture tissulaire interviennent un jour après ensemencement (chez bénomyl) et les plus tardives interviennent à 2,8 jours (chez chloramphénicol). La culture sporée est moins précoce, le traitement le plus précoce intervient 2 jours après ensemencement (chez la culture sporée sans antibiotique) alors que le plus tardif intervient 6,7 jours après ensemencement.

La synthèse des données sur le jour de reprise est reprise sur la figure 2 ci-dessus.

7

bénomyl chloramphenicol gentamicine sans

Effets d'antibiotiques selon la culture.

6

5

4,2

Jour de reprise.

4

3,2

2,6

3

2

1,2

1

0,4

0,4

0

5,4

2

spore Tissulaire

Figure 3 : Analyse de la vitesse de reprise sur les différents types des cultures et d'antibiotiques.

Le graphique ci-après montre comment les semences ont repris dans différents types de cultures (tissulaire et sporée) en fonction d'antibiotiques utilisés. Ainsi dit ; nous trouvons que dans les deux types de cultures, la reprise est lente là où les antibiotiques sont utilisés que là où ils ne sont pas utilisés, sauf chez le bénomyl dans la culture tissulaire et chez la culture tissulaire sans antibiotique où la reprise est la même et cette reprise est de 0,4 jour.

En culture tissulaire, la reprise la plus rapide se situe chez la culture sans antibiotique et chez le bénomyl avec une durée de reprise de 0,4 jour et la plus lente reprise se situe chez le chloramphénicol avec une durée moyenne de 2,6 jours.

--' 27 --'

jours. Pour les deux types de cultures, il ya un effet inhibiteur de ces antibiotiques sur la reprise des semences.

Les données relatives aux effets d'antibiotiques et de types de culture sur le diamètre mycélien sont représentées à la figure 3.

46,92

80

70

63,3

Effets d'antibiotiques par culture.

60

50

Diametre(mm)

40

30,02

30

17,2

20

40,3

23,04

3,7

10

0

spore Tissulaire

33,4

Figure 4 : Effets du type de culture et d'antibiotiques sur Diamètre total mycélien.

Le graphique explique la variation du diamètre total des mycéliums en fonction d'antibiotiques et de types de cultures.

En effet ; la culture tissulaire présente des meilleurs résultats tant pour les antibiotiques que pour la culture sans antibiotique. Le diamètre est plus élevé chez le chloramphénicol (63,3mm). Le bénomyl sur la culture sporée a donné de bons résultats (30,02mm de diamètre) que la culture tissulaire. Le plus petit diamètre chez la culture tissulaire se situe chez le bénomyl avec 17,2mm.

En culture sporée ; comme chez la culture tissulaire, le diamètre le plus élevé se situe chez le chloramphénicol avec un diamètre de 46,92mm et le plus petit se trouve chez la culture sans antibiotique avec 3,7mm.

-' 28 -'

Les données relatives aux effets d'antibiotiques et de types de culture sur la vitesse de croissance mycélienne sont représentées à la figure 4.

8

7

6

6,33

4,692

Vitesse (mm)

5

4,03

4

3,34

3,002

3

2,304

1,72

spore Tissulaire

2

1

0,37

0

Effets d'antibiotiques par culture.

Figure 5 : Effets du type de culture et d'antibiotiques sur la Vitesse de croissance mycélienne.

Dans le graphique ci-haut, la vitesse de croissance mycélienne varie selon les types de culture (tissulaire ou sporée) et d'antibiotiques. Mais la culture tissulaire présente encore une fois de plus des meilleurs résultats tant pour les types de cultures que pour les antibiotiques.

En culture tissulaire, l'antibiotique présentant une vitesse de croissance mycélienne plus rapide est le chloramphénicol avec une moyenne de 6,33mm par jour et la vitesse la plus petite se situe chez le bénomyl avec 1,72mm/jour en moyenne.

En culture sporée, la croissance mycélienne la plus rapide est chez le chloramphénicol comme chez la culture tissulaire avec une vitesse moyenne de 4,692mm/jour et la plus petite est chez la culture sporée sans antibiotique avec une vitesse de 0,37mm/jour.

Les données relatives aux effets d'antibiotiques et de types de culture sur le taux d'infections sont représentées à la figure 5.

--' 29 --'

3,5

3

2

1,6

1,6

1,4

1 1

0,8 0,8

spore Tissulaire

2,5

2

1,5

1

niveau infection

0,5

0

Effets d'antibiotiques par culture.

Figure 6 : Effets du type des cultures et d'antibiotiques sur le niveau d'infection.

Dans le graphique ci-après le niveau d'infection en fonction de culture et d'antibiotiques est exprimé en échelle ; et cette dernière va de 0 jusqu'à plus de 2.

De 0 à 1 : moins sévère. De 1 à 2 : sévère.

Supérieur à 2 : très sévère.

Pour les deux cultures ; il ya présence d'infection mais la culture sporée présente plus d'infections que la culture tissulaire. En culture tissulaire, les infections sont moins sévères chez le chloramphénicol et la gentamicine et sont sévères chez le bénomyl et chez la culture sans antibiotique. En culture sporée, les infections sont moins sévères chez le chloramphénicol et la gentamicine ; elles sont sévères chez le bénomyl et sont très sévères chez la culture sans antibiotique.

La corrélation entre le niveau d'infection et le diamètre total du mycélium est donnée à la figure 6.

-' 30 -'

0,5

0

0 20 40 60 80 100

N.infe

Linéaire (N.infe)

y = -0,0063x + 1,4779 R² = 0,0671

2,5

2

1,5

1

Figure 7 : Corrélation entre le niveau d'infection et le diamètre total du mycélium.

Le graphique montre la corrélation qui existe entre le niveau d'infection et le diamètre total du mycélium. Cette droite, appelé droite des moindres carrés ou droite de régression, nous montre qu'il existe une corrélation négative entre le niveau d'infection et le diamètre total de mycélium et cette corrélation est expliquée à 6,7%. Ceci explique que lorsque le niveau d'infection augmente, le diamètre total du mycélium diminue. Le R² veut dire le coefficient de détermination qui sert à expliquer la quantité d'information fournie par la droite de régression.

Le tableau ci-après ; présente les différents pathogènes après coloration Gram.

Tableau 3 : coloration de Gram.

TYPE DE CULTURE	Pathogènes
	Bactérie Gram+	Bactérie Gram-	Cocci positif	Levures	Filament mycélien
Tissulaire	+	+	-	+	-
Sporée	+	+	-	+	+

+ : indique la présence, - : absence.

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Les résultats du tableau 4, montrent les différents pathogènes après la détermination de la coloration Gram ; qui se sont développés dans les différentes boites infectées de différents types de cultures. La culture sporée a présenté un grand nombre des pathogènes, sur lequel s'est développé les Bactéries Gram-, les Bactéries Gram+, les levures, Levures, et le filament mycélien. La culture tissulaire a présenté moins de pathogènes avec la présence de bacteries Gram+ et - et des levures.

b) Identification du genre des pathogènes.

Le tableau qui vient après, présente le genre des Bactéries gram- et les Cocci trouvés sur les différents milieux.

Tableau 4 : Identification du genre.

Type des cultures	Bactéries Gram- Cocci

Tissulaire E. coli Staphycoques

Sporée Entérobacter Entérocoques

Chez la culture tissulaire, le genre identifié est Escherichia coli avec des cocci staphycoques tandis que la culture sporée présente des Entérobacters avec des cocci entérocoques.

Le tableau suivant, va montrer la façon dont il ya eu croissance mycélienne des semences secondaires en fonction d'antibiotiques et de substrat utilisé.

Le tableau 5 suivant, va montrer la façon dont il ya eu croissance mycélienne des semences secondaires en fonction d'antibiotiques et de substrat utilisé en semence.

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Tableau 5 : Longueurs des mycéliums, des substrats et présence d'infection pour les semences secondaires.

Type culture	de	Antibiotiques	Diamètre mycélium (mm)	Longueur substrat	Infections
				(mm)
		Sans	35.5	95	0
		Chloramphénicol	53.25	95	0
Tissulaire
		Gentamicine	58	95	0
		Bénomyl	89.75	95	0
		Sans	0	95	0
Sporée		Chloramphénicol	45.5	95	1
		Gentamicine	45.75	95	0
		Bénomyl	81.75	95	0

Pour la culture tissulaire, le meilleur résultat se trouve (la longueur la plus admirable du mycélium est de 89,75mm) chez le bénomyl et le résultat le moins favorable (la plus petite longueur mycélienne est de 35,5mm) chez la culture tissulaire sans antibiotique.

Pour la culture sporée, le mycélium s'est bien développé aussi chez le bénomyl et la longueur du mycélium est de 81,75mm et ce dernier s'est mal développé chez la culture sporée sans antibiotique où la longueur mycélienne est de 0mm c'est-à-dire qu'il n'y avait pas eu reprise de la semence secondaire.

Pour les infections, ces derniers sont observables uniquement chez la culture sporée, plus précisément chez la culture sporée avec le chloramphénicol.

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3.2. Discussion des résultats.

Eu égard aux différents résultats obtenus lors de notre étude dont l'objectif était d'évaluer l'effet de types de cultures tissulaire et sporée et d'antibiotiques sur le contrôle d'infections en culture in vitro du champignon Pleurotus ostreatus P969.

En effet ; selon certains auteurs, la culture sporée pour les semences primaires présenterait des meilleurs résultats, mais elle n'est pas souvent pratiquée à cause de sa délicatesse et de la connaissance qu'il existe ou pas des spores différemment à la culture tissulaire où on touche les tissus à inoculer (Dibaluka et al., 2010) . Contrairement à nos résultats, la culture tissulaire a présenté des bons résultats tant pour les diamètres des mycéliums que pour le niveau d'infections. Pour les diamètres mycéliens, la culture tissulaire a pour tous les traitements les diamètres supérieurs aux diamètres chez la culture sporée sauf chez le bénomyl dans la culture sporée où le diamètre mycélien est supérieur au diamètre mycélien chez le bénomyl dans la culture tissulaire. Pour le niveau d'infections, la culture sporée a présenté beaucoup d'infections que la culture tissulaire, sauf chez le bénomyl dans la culture sporée où le diamètre mycélien est le même. Les deux résultats nous ont permis de dire que le milieu de culture PDA n'est pas souvent contaminé par les champignons (utilisation du fongicide bénomyl), ce sont souvent des bactéries qui attaquent ce milieu.

L'effet d'antibiotiques particulièrement le chloramphénicol et la gentamicine sur le contrôle d'infections en culture in vitro ; selon certains auteurs (Anonyme, 2009), le chloramphénicol est utilisé en milieu de culture pour inhiber la croissance des bactéries (un bactériostatique) et favoriser celle des champignons. La gentamicine quant à lui, tue les bactéries en faveur des champignons en milieu de culture(bactéricide) ; ce qui a confirmé nos résultats ; car les diamètres mycéliens sont plus élevés chez le chloramphénicol (diamètre total du mycélium est de 63,3mm pour la culture tissulaire et de 46,92mm pour la culture sporée ) dans les deux types de cultures (tissulaire et sporée) suivi de gentamicine dans la culture tissulaire (40,3mm de diamètre), mais dans la culture sporée le chloramphénicol est suivi du bénomyl (30,02mm de diamètre) pour le diamètre mycélien.

Pour le niveau d'infections, les deux antibiotiques ont présenté les moins d'infections dans les deux types de cultures (tissulaire et sporée) que d'autres traitements dans notre dispositif expérimental des semences primaires. Le niveau d'infections est tel que, chez le chloramphénicol et la gentamicine est le même dans la culture sporée (même niveau d'infections) et dans la culture tissulaire, les deux antibiotiques présentent encore une fois le

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même niveau d'infections, mais c'est dans la culture sporée que le niveau d'infections est élevé que la culture tissulaire.

Nos résultats montrent que ; plus les infections augmentent dans les boites de pétri, les diamètres des mycéliums diminue ; ce que la figure 6 explique qu'il existe une corrélation négative entre le niveau d'infection et la croissance mycélienne. Ce qui est vrai que lorsque les infections sont nombreuses le développement mycélien doit nécessairement être entravé.

Mais aussi, plus les mycéliums durent longtemps dans les boites de pétrie, plus les infections augmentent.

Pour les semences secondaires, les meilleurs résultats sont obtenus chez le bénomyl dans les deux types de cultures (tissulaire et sporée). Le bénomyl étant un fongicide, tout champignon qui peut se développer autre que le Pleurotus ostreatus doit être tué (Anonyme, 2009), ceci expliquerait la croissance rapide du mycélium tandis que le chloramphénicol a présenté les infections ; la gentamicine n'a pas présenté les infections, mais sa croissance mycélienne est inferieure à celle de chloramphénicol.

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Conclusion et recommandation.

Le présent travail est centré sur l'effet de types de culture (tissulaire et sporée) et d'antibiotiques (chloramphénicol, gentamicine et bénomyl) sur le contrôle d'infections en culture in vitro du champignon Pleurotus ostreatus P969.

Ce travail, fait en expérimentation, a abouti à des résultats suivants :

? Pour les deux types de cultures, la culture tissulaire a donné de bons résultats sur le plan de précocité de reprise avec une reprise plus précoce chez le bénomyl (1 jour) suivi de la culture tissulaire sans antibiotique (1,5 jours). Pour la culture sporée la reprise la plus précoce étant chez la culture sans antibiotique (2jours) suivi du bénomyl (5,3 jours).

? Pour le niveau d'infections, la culture sporée a présenté plus d'infections avec plus d'infections dans la culture sporée sans antibiotique où les infections étaient très sévères et les moins d'infections chez le chloramphénicol et la gentamicine où les infections étaient moins sévères.

? Pour les diamètres mycéliens, la culture tissulaire a beaucoup plus présenté des bons résultats surtout chez le chloramphénicol avec 63,3mm de diamètre et la gentamicine avec 46,92mm de diamètre et le moins de diamètre était chez le bénomyl avec 17,2mm de diamètre.

? Pour les agents infectieux, ce sont plus les bactéries Gram-, Gram+ et les levures qui attaquaient tous les deux types de culture ; et les filaments mycéliens attaquaient uniquement la culture sporée.

Ceci étant ; nos recommandations sont adressées aux chercheurs surtout les étudiants de multiplier les efforts pour la continuité de ce travail.

Nos efforts doivent maintenant s'orienter dans la production de la semence des champignons, et à la mise au point des souches des champignons disponibles localement car elles intéressent plus une bonne partie de la population de la région du Kivu.

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21. Sergeeva, M.2000. Fungi.250 species of edible, poisonous and medicinal fungi. Moscow, Culture and Traditions. 263 pp.

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Table des matières

0.Introduction 1

Contexte, problématique et justification du sujet 1

Chapitre 1 : Revue de la littérature 4

1.1. Généralités sur les champignons : les pleurotes 4

1.1.1. Caractéristiques des champignons 4

1.1.2. Biologie, écologie 4

1.1.3. Nutrition des champignons 5

1.1.4. Classification 6

1.1.5. La culture des champignons 7

1.1.5. Production de blanc de champignon 8

1.2. Les milieux de culture 10

1.2.1. Les différents types de milieux 10

1.3. Les infections en bactériologie 13

1.3.1 Les infections primaires 13

1.3.2. Identification de l'infection 13

1.3.3. Les agents infectieux 14

1.3.4. Mesures à prendre 15

1.4. Les antibiotiques 15

1.4.1. Mode d'action des antibiotiques 15

1.4.2. Effets secondaires des antibiotiques 16

1.4.3. Fabrication des antibiotiques 16

1.4.4. Resistance aux antibiotiques 16

1.4.5. Mécanismes permettant à une bactérie de résister à un antibiotique 17

1.4.6. Quelques familles d'antibiotiques 18

1.4.7. Quelques antibiotiques 19

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Chapitre 2 : Méthodologie	20
2.1. Milieu d'étude	20
2 .2.Matériels utilisés	20
2.3. Méthodes	21
2.3.1. Dispositif expérimental	21
2.3.2. Conduite de l'essai	22
Chapitre 3 : Présentation et discussion des résultats	25
3.1. Présentation et interprétation des résultats	25
3.2. Discussion des résultats	33
Conclusion et recommandation	35
Références bibliographiques	.36