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Les éléments transposables: le cas du transposon mariner une approche expérimentale( Télécharger le fichier original )par R Ferhi Université de Tebessa - DES en Biochimie et Biologie moléculaire 2009 |
III.2.1.4. Analyse fonctionnelle d'un transposon de type mariner :L'étude fonctionnelle des différentes transposases mariner peut être réalisée selon deux stratégies : les tests de transposition in vitro, et les tests de transposition in vivo. III.2.1.4.1. Tests de transposition in vitro :Ces tests permettent l'analyse et l'interprétation des différentes étapes de la transposition indépendamment chacune de l'autre (voir figure 6.5 page 63). Pour réaliser cette approche il est obligatoire de produire la transposase, cette étape nécessite le clonage d'un transposon dans une bactérie. Il doit être véhiculé par un vecteur d'expression en se liant en aval d'un promoteur fort. Le vecteur et le gène codant la transposase seront clivés par la même enzyme de restriction pour assurer la complémentarité des bases. Le plasmide pMAL est largement utilisé, Il est caractérisé par la présence d'un gène de la résistance à l'ampicilline (Permettant une sélection) et permet la production de la transposase sous une forme fusionnée avec la MBP "Maltose Binding Protein" (Figure 12). L'expérience permettant la production des transposases est citée ci-dessous: 1' Préparation du gène codant la transposase en le fusionnant avec le gène de la MBP porté par le plasmide pMAL de sorte qu'il soit insérer en aval d'un promoteur inductible (Figure13). v' Transformation d'une bactérie par le plasmide pMAL recombinant. v' Sélection des bactéries transformées selon leur résistance à l'antibiotique. v' Culture des bactéries dans un milieu nutritif et l'induction de l'expression de la transposase par l'IPTG (l'IsoPropyl-B-D ThioGalactopyranoside). v' Récupération des bactéries par centrifugation. v' Extraction des protéines recombinantes par la lyse des parois bactériennes en utilisant les lysosymes, puis centrifugation pour l'élimination des débris cellulaires et enfin le dosage des protéines obtenues.
Figure 12 : Expression de la transposase
fusionnée à la MBP par le plasmide Amylose Site spécifique de clivage mal E MBP MBP MBP MBP Gène de la transposase MCS Chargement et lavage Elution avec le maltose Clonage et expression Clivage avec une Transposase Transposase Transposase Transposase v' La transposase fusionnée sera purifiée par la chromatographie d'affinité : la fixation des protéines s'effectue sur une résine amylose, l'élution sera réalisée par le maltose (Figure 12). v' La technique SDS-PAGE donne une estimation sur la taille des protéines fusionnées, par exemple la transposase fusionnée d'Alvcmar mesure 80KDa sachant que la MBP seule mesure 40KDa, alors la transposase d'Alvcmar peut mesurer 40KDa (Figure 14) (In Halaimia Toumi, 2006).
Plasmide pMAL Gène de la MBP Résistance à Le transposon mariner
Figure 14: Analyse de la production des
protéines sur gel SDS -PAGE (d'après 75 kDa 40 kDa M MBP Transposase A (A pour Alvcmar) 1 2 3 4 5 6 -Extrait protéique brut pMAL vide (puit1). pMAL-A (4) (A : pour Alvcmar). -La flèche noire indique La transposase A -M : marqueur de taille. - Surnageants récupérés après la purification de la MBP (2), Transposase A (5). - Protéines purifiées : MBP (3), Transposase A (6) Figure 13 : Le clonage du gène de la
transposase mariner ligué avec le plasmide La production de diverses transposases mariner a révélé l'existence de plusieurs versions tronquées, en effet, Erwan et al. (2005) ont montré pendant la production d'une transposase IS911 la présence de plusieurs formes tronquées. Une de ces formes s'est avérée un inhibiteur pour la transposition, alors le phénomène de la transposition est vraisemblablement limité si des transposases tronquées sont disponibles. (In Halaimia Toumi, 2006). |
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