Surveillance de la résistance aux antibiotiques de "streptococcus pneumoniae " et "haemophilus influenzae "

Promotion 2009

REPUBLIQUE GABONAISE

MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ET DE L'INNOVATION

UNIVERSITE DES SCIENCES DE LA SANTE

FACULTE DE MEDECINE

Année 2009 Mémo ire n° 259

scIE~TA ET

c

Surveillance de la résistance

aux antibiotiques de

Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

Mémoire pour l'obtention

Du Diplôme d'Etat de Technicien Supérieur de Biologie Médicale

Présenté par

Monsieur ONDENOT Yann Christian

Née le 31 Décembre 1984 à Port-Gentil

Directeur : Pr Ag Angélique NDJOYI MBIGUINO

Rapporteur : Dr Modeste MABIKA MANFOUMBI

ORGANIGRAMME

PERSONNEL

ADMINISTRATIF

DOYEN Pr. Edouard NGOU MILAMA

ASSESSEURS Pr. Jean-Baptiste MOUSSAVOU KOMBILA

Pr. Ag. Philomène NKOUNA

SECRETAIRE GENERAL Mr. Alphonse RAIVIRE

SECRETAIRE GENERAL ADJOINT Mr. Apollinaire ESSONO

PERSONNEL ENSEIGNANT

RESPONSABLE DE SECTION Pr. Maryvonne KOMBILA

CORDINATEURS Dr. Adaku SITTI LIAMIDI

Mr. Christophe NGUIRI

ANATOMO-PATHOLOGIE

Drs: Barthélemy MABIKA MABIKA

Sidonie NGUIZI OGOULA Pearl NSIE OBAME

Florence NZE NGUEMA

HEMATOLOGIE-IMMUNO HEMATOLOGIE

Pr. Alain ONDO

Drs. Vincent DITSAMBOU

Léonie Esther LETOMBO

Jean-François THARDIN Mr. André DOUKAGA

PARASITOLOGIE-MYCOLOGIE-MEDECINE TROPICALE

Pr. Maryvonne KOMBILA

Drs Marielle Karine BOUYOU AKOTET ép.

LOUEMBET

Jean-Bernard LEKANA DOUKI

Modeste MABIKA MANFOUMBI

Denise Patricia MAWILI MBOUMBA

Jean-Romain MOUROU MBINA

Marie-Noëlle MOUSSAVOU BOUSSOUGOU ép.

MABIKA

Edgar Brice NGOUNGOU

Joseph NZAMBA

Solange NZENZE AFENE

Anne WALKER DEEMIN

Mr. Mathieu OWONO MEDANG

BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE

Pr. Angélique NDOYI MBIGUINO

Drs. Delphine OMWANGA ép. IGONDJO

Pélagie MOUGOLA ép. SAPHOU DAMON

Mrs. Guy Francis NZENGUI NZENGUI

Hervé M'BOYIS KANDEM

Mme Agnès NNOH MBA

PHYSIQUE --BIOPHISIQUE-MATHMATIQUES-INFORMATIQUE

Drs Thaddée NTOUNTOUME

Boris ONDO

Mrs. Philippe ESSONO ONDO

Emmanuel ANYUNZOGHE

TOXICOLOGIE

Drs : Colette YENOT Casimir NZOUNGOU

CHIMIE-BIOCHIMIE-BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE

Pr. Edouard NGOU MILAMA

Drs. Madeleine BRIDON

Guy Joseph LEMAMY

Elisabeth LENDOYE

Yvette MBA OBAME

Marie-Claude MINKOUE

Jean-Claude MOUNDOUNGA BAKITA

Bénédicte NDEBOKO

Jean-Calvin NGUELE

Marie Andrée N'NEGUE

Félix OVONO ABESSOLO

Adaku SITTI LIAMIDI

PHARMACOLOGIE

Pr. Ag. Blandine AKENDEGUE Drs. Nadine AMBOUROUET Laurence GASSITA Pierre GOUERANGUE Serge ISSEMBE

Marie ONDO MBA

PHYSIOLOGIE

Pr. Berkman NSHIMIUMOUREMYI Drs. Apollinaire ESSONO

Serge BEKALE

SANTE PUBLIQUE ET MEDECINE DU TRAVAIL

Pr. Bernard OBIANG OSSOUBITA

Pr. Ag. Justine MOUECOUCOU

Drs. François EDOU OVONO

Médard TOUNG MVE

Mr. Jérôme MBA BITOME

Je dédie ce travail à : L'eternel Dieu

Maître et seigneur tout puissant, c'est lui qui permet toutes choses sur cette terre, notre créateur. OH SEIGNEUR !! Soit bénit et glorifié.

A ma mère AZIZET Jeanne Françoise et mon père RAKOMBA Arnaud

Pour votre soutient moral et financier, pour tous les sacrifices consentis pour mes études et mes multiples besoins, je vous dédie ce travail

A mon grand père ETENO Jean Bernard, mes oncles SYLONG Jean Richard et IKOUAKOUA Jules, à mes tantes NTCHANGO Félicité et Sylviane, NGUIZI OGOULA GERBEX Sidonie

Pour vos conseils, votre disponibilité, votre soutien sans faille à chaque que j'ai marqué le besoin, je vous dédie ce travail pour tous ces sacrifices consentis.

A mes frères et soeurs, cousins et amis, particulièrement à IGALLA Judicaël

Vous qui m'avez toujours remonté le moral lorsque je faiblissais, vous avez su m'apporter la joie, me donner du courage, je vous dédie ce travail

A mes condisciples de classe AVA Thierry, ANGOUO Ladislas, BATENI Julie, EMANE Alain-Georges, ETO'O Judicaël, IMOUNGA Audrey-Sylviane, KASSA Aubin, KEMDOUM.O Descartes, KOMBA.M Olive, LUMUMBA Clotilde, MABALA KABA Harry, MAPANGOU Nelly, MBEGA Auxence, MUSWAMI.B Laeticia, NDONG Jean-Charles, NZAOU Denise, NZIENGUI Eric

Pour tous les moments de joies et de peines passés ensemble et pour votre soutien qui a été sans faille, sincères remerciements.

A ma fiancée ONKANI Shirley Priscilla

Toi qui a cru en moi des le jour ou l'on s'est rencontré, pour ta présence, ton soutien, tes conseils et ta patience, reçoit toutes ma gratitude et mon amour pour toi, je te dédie ce travail

REMERCIEMENTS

A mon directeur de mémoire
Pr Angélique NDJOYI MBIGUINO
Pour avoir dirigé ce travail avec patience et rigueur,
Vous nous avez accordé votre précieux temps malgré vos multiples occupations

Au responsable de la section TSBM
Pr Maryvonne KOMBILA
Vous avez toujours été à l'écoute des étudiants,
Vous avez de grandes qualités humaines,
Vous ne cessez de nous soutenir et de vous montrer attentionné envers nous

telle une mère

A mon rapporteur
Dr Modeste MABIKA MAMFOUMBI
Vous avez voulu nous accorder de votre temps,
Pour juger ce travail avec toute la rigueur scientifique.
Sincère remerciement

Au Dr Pélagie SAPHOU DAMON
Pour votre apport, votre disponibilité et vos conseils
tout au long de ce travail, vous avez été telle une grande soeur.
Je vous adresse mes sincères remerciements

A messieurs NZENGUI NZENGUI GUY-FRANCIS,

MBOYIS KANDEM Hervé,

A Mesdames NNOH MBA Agnes,

TCHOUA Diane,

Makessi Adele,

NGOUANGA Leonie,

MASSOUNGA Jeannine,

Pour votre contribution technique au cours de ces mois passé ensemble,

Pour votre sens de la fraternité et de la famille envers nous,

Votre souci de travailler en équipe,

Profonds remerciements.

Liste des abréviations

ORL : Oto-rhino-laryngologie

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

VP : Voges Proskaeur (production d'acétone)

LCR : Liquide Céphalorachidien

PSDP : Pneumocoque de Sensibilité Diminuée à la Pénicilline.

USA: United States of America

NAD: Nicotinamide Adenine Dinucléotide

PLP : Protéine de Liaison à le Pénicilline

ADN : Acide Désoxyrinucléique

FQ : Fluoroquinolones

ARN : Acide Ribonucléique

CO2 : Dioxyde de carbone

APH : Aminoside-phosphotransférases

ANT : Aminoside-nucléotidyl- transférase

ACC : Aminoside-acetyltransferases

D-Ala-D-Ala : D-Alanine-D-Alanine

D-Ala-D-Ser : D-alanine-D-serine

MLS : Macrolides-lincosamides- synergistines

CASFM : Comité de l'antibiogramme de la société française de microbiologie.

Liste des tableaux pages

Tableau I: Répartition des cas dans la population générale 42

Tableau II: Répartition des cas selon les tranches d'âge 43

Tableau III: Antibiogramme et CMI de la souche de S. pneumoniae ONA 45

Tableau IV: Antibiogramme et CMI de la souche de S. pneumoniae AYO 46

Tableau V: Antibiogramme et CMI de la souche de S. pneumoniae MAH 46

Tableau VI: Antibiogramme et CMI de la souche de S. pneumoniae MAN 47

Tableau VII: Antibiogramme et CMI de la souche de S. pneumoniae BOU 47

Tableau VIII: Antibiogramme et CMI de H. influenzae 48

Liste des figures pages

Figure 1: Colonies de S. pneumoniae sur gélose au sang 7

Figure 2: Coloration de Gram de Streptococcus pneumoniae 8

Figure 3: Coloration de Gram de Haemophilus influenzae 14

Figure 4: Image d'un test de CMI 34

Figure 5: Répartition des cas positifs selon les espèces 44

MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

Introduction 4

Objectifs 5

Chapitre I:Généralités 6

I.1-Généralités sur Streptococcus pneumoniae 6

I.1.1-Historique 6

I.1.2-Définition et classification 6

I.1.3-Morphologie et caractères biochimiques 6

I.1.4-Caractère _génomi_que 9

I.1.5-Habitat 9

I.1.6-Pouvoir patho_gène 9

I.1.7-Facteurs de pathogénicité 10

I.1.7.1-La capsule 10

I.1.7.2-Autres facteurs 10

I.1.8-Manifestations clini_ques 10

I.1.9-Diagnostic bactériologique 10

I.1.9.1-Prélèvement 11

I.1.9.2-Transport 11

I.1.9.3-Dia_gnostic 11

I.1.10-Traitement et prévention 12

I.2-Généralités sur Haemophilus influenzae 13

I.2.1-Histori_que 13

I.2.2-Définition et classification 14

I.2.3-Morpholo_gie et caractères biochimi_que 14

I.2.4-Habitat 15

I.2.5-Pouvoir patho_gène 15

I.2.5.1-Infection des voies respiratoires 15

I.2.5.2-Ménin_gites 15

I.2.5.3-Autres localisations 16

I.2.6-Facteurs de patho_génicité 16

I.2.7-Manifestations cliniques 16

I.2.8-Dia_gnostic bactériolo_gi_que 17

I.2.8.1-Prélèvement 17

I.2.8.2-Transport au laboratoire 17

I.2.8.3-Diagnostic 17

I.2.9-Traitement et prévention 18

I.3-Généralités sur les antibiotiques 19

I.3.1-Historique 19

I.3.2-Définition 19

I.3.3-Classification 20

I.3.3.1-Classification selon les familles 20

I.3.3.2-Classification selon le site d'action 21

I.3.4-Mécanisme d'action des antibioti_ques 21

I.3.4.1-Action sur la paroi bactérienne 21

I.3.4.1.1-Beta-lactamines 22

I.3.4.1.2-Glycoprotéines 22

1

I.3.4.1.3-Fosfomycine 23

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.3.4.2-Antibiotiques actif sur la synthèse des protéines et des acides

nucléiques 23

I.3.4.2.1-Mécanisme d'action des aminosides 24

I.3.4.2.2-Mécanisme d'action des quinolones 24

I.3.4.2.3-Mécanisme d'action du groupe Macrolide-Lincosamide-

Synergistine-Kétolides 24

I.4-Epidémiologie de la résistance des bactéries aux antibiotiques 2 5

I.4.1-Epidémiologie de la résistance de Streptococcus pneumoniae aux

antibiotiques 26
I.4.2-Epidémiologie de la résistance de Haemophilus influenzae aux

antibiotiques 26

I. 5-La résistance des bactéries aux antibiotiques 27

I.5.1-Mécanisme de résistance acquise 27

I.5.2-Mécanisme de résistance par grande famille 29

I.5.2.1-Résistance aux beta-lactamines 29

I.5.2.2-Résistance aux aminosides 29

I.5.2.3-Résistance aux quinolones 29

I.5.2.4-Résistance aux glycopeptides 30

I.5.2.5-Résistance aux macrolides et kétolides 30

I.6-La sensibilité des bactéries aux antibiotiques 30

I.6.1-Sensibilité de Streptococcus pneumoniae aux antibiotiques 30

I.6.2-Sensibilité de Haemophilus influenzae aux antibiotiques 31

I.7-L'antibiogramme 31

I.7.1-Définition 31

I.7.2-Principe 31

I.8-La Concentration minimale inhibitrice 32

I.8.1-Définition 32

I.8.2-Principe 32

I.8.3-Interprétation 33

Chapitre II: Matériel et méthodes 3 5

II.1-Type d'étude 3 5

II.2-Lieu d'étude 3 5

II.3-Patients 3 5

II.3.1-Critères d'inclusions 35

II.3.2-Critères d'exclusions 35

II.4-Matériel 3 5

II. 5-Méthodes 36

II.5.1-Enregistrements 36

II.5.2-Prélèvements 36

II.5.3-Analyses bactériologiques des prélèvements 36

Chapitre III: Résultats 41

III.1-Aspect des colonies de Streptococcus pneumoniae et

Haemophilus influenzae 41

III.2-Résultats de la coloration de Gram 41

III.3-Lecture du test à l'optochine 41

2

III.4-Test d'agglutination 41

MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

III. 5-Répartition des cas dans la population générale 42

III.6-Répartition des cas selon les tranches d'âge 43

III.7-Répartition des cas positifs selon les espèces 44

III.8-Résultats de l'antibiogramme et de la CMI des souches de

S. pneumoniae 4 5
III.9-Résultats de l'antibiogramme et de la CMI de la souche de

Haemophilus influenzae 48

Chapitre IV: Discussion 49

IV.1-Aspect des colonies 49

IV.2-Coloration de Gram 49

IV.3-La sensibilité à l'optochine 50

IV.4-La réaction d'agglutination au latex 50

IV. 5-Antibiogramme et CMI 50

3

Conclusion 53

MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

La sphère ORL (nez, _gor_ge, oreilles) est constituée d'une flore polymorphe. Parmi cette flore on note la présence de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae qui sont des bactéries retrouvées à l'état commensal au niveau des muqueuses des voies respiratoires.

Ces formes commensales n'ont généralement pas de capsules, contrairement aux formes virulentes dont la présence de la capsule permet la résistance à la phagocytose.

Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae sont responsables d'affections graves (otites, sinusites, méningites) avec des conséquences non négligeables.

L'isolement et l'identification du germe est nécessaire pour une prise en charge efficace.

Devant ces pathologies, surtout les cas de méningites, une antibiothérapie probabiliste est toujours prescrite en attendant les résultats du laboratoire.

Face à cette démarche, et compte tenu de l'évolution imprévisible des résistances, particulièrement dans nos régions où l'automédication est très importante, une surveillance régulière de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae s'impose [1].

Aucune étude sur le profil de résistance de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae n'a été faite au Gabon, De plus, notre étude apparait comme une étude préliminaire car la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) n'est pas pratique courante dans nos laboratoires de bactériolo_gie.

Le but de notre étude est :

- de déterminer le profil de résistance des souches susmentionnées ;

- d'effectuer les CMI des souches résistantes aux antibiotiques.

Ceci permettra au Gabon de disposer d'un profil de résistance de S.pneumoniae et H.influenzae aux antibiotiques, et par la même occasion, la possibilité aux médecins de pouvoir prescrire une antibiothérapie probabiliste (en tenant

compte des antibiotiques demeurés sensibles aux souches).

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

Objectif général

> Déterminer le profil de résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.

Objectifs spécifiques

> Identifier Streptococcus pneumoniae

> Identifier Haemophilus influenzae

> Déterminer la sensibilité de Streptococcus pneumoniae aux antibiotiques

> Déterminer la sensibilité de Haemophilus influenzae aux antibiotiques

> Déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de Streptococcus pneumoniae aux antibiotiques

> Déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de Haemophilus influenzae aux antibiotiques

MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.1- Généralités sur Streptococcus pneumoniae I.1.1- Historique

En 1874, Billoroth décrit des coccies en chaînette dans des blessures. En 1884, Rosenbach introduit le terme de Streptococcus pour décrire des bactéries isolées de lésions suppuratives.

Le terme de « pneumocoques » est utilisé pour la première fois par Klein et Pasteur en 1884. La première description de Streptococcus pneumoniae est rapportée par Chester en 1901. Initialement appelé Diplococcus pneumoniae en 1926, il a été rebaptisé Streptococcus pneumoniae en 1974, vu sa croissance en chaînes dans les milieux liquides. Il est aussi appelé pneumocoque à cause de son implication dans les pneumonies [2].

I.1.2- Définition et classification

Streptococcus pneumoniae est un micro-organisme appartenant au règne Bacteria, à l'embranchement Firmicutes, à la classe des Bacilli, à l'ordre des Lactobacillales, à la famille des Streptococcaceae, et au genre Streptococcus [3].

I.1.3-Morphologie et caractères biochimiques

Les souches de Streptococcus pneumoniae se présentent sous forme de coques ou de coccobacilles, à Gram positif. La coloration de Gram se perd dans les vieilles cultures et les bactéries peuvent alors apparaître comme des coques à Gram négatif. On les retrouve groupés par deux ou par huit, isolés ou en courtes chaînes. Les repiquages favorisent la formation de chaînes [2].

Il possède une capsule, il est aéro-anaérobie, à métabolisme fermentatif, catalase né_gative, Vo_gues Proskaeur (VP) né_gatif, hydrolysant l'esculine, acidifiant l'inuline, le fructose, le galactose, le glycogène, le glucose, le lactose, le maltose, le saccharose, le tréhalose et le raffinose. Il acidifie lentement l'arabinose, l'érythritol, le glycérol et le xylose. Il n'acidifie ni le cellobiose, ni le dulcitol, ni l'inuline, ni le mannitol, ni le ribose, ni la salicine, ni le sorbitol [2].

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

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MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Figure 1 : Colonies de Streptococcus pneumoniae sur gélose au sang [18]

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

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Figure 2: Coloration de Gram de Streptococcus pneumoniae [18]

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.1.4-Caractères génomiques

Son génome est composé de 2160837 paires de bases avec 2236 régions codantes et une fonction biologique a été identifiée. Cela laisse présager des perspectives pour la compréhension des mécanismes de virulence et pour la mise au point de nouveaux vaccins [2].

I.1. 5- Habitat

S. pneumoniae est une bactérie commensale des voies aériennes supérieures. La colonisation du rhinopharynx apparaît très précocement au cours des premiers mois de la vie : tous les enfants ont été en contact avant l'âge de deux ans et 50% des enfants de cet â_ge sont colonisés [2].

I.1.6-Pouvoir pathogène

C'est l'agent pathogène le plus fréquent des pneumonies bactériennes communautaires. Les bronchites et broncho-pneumopathies sont observées surtout chez les patients insuffisants respiratoires chroni_ques et au décours des viroses (grippe). La capacité de la bactérie à pouvoir adhérer aux cellules ciliées de l'arbre bronchique est liée à la présence de diverses protéines de surface enchâssées dans le peptidoglycane et les polyosides capsulaires [2].

Les abcès du poumon et les pleurésies sont plus rares et souvent secondaires à une atteinte du parenchyme sous jacent. En revanche, il semble le plus fréquent dans la flore nasopharyngée des enfants présentant une otite moyenne ai_guë.

C'est aussi l'une des bactéries les plus fré_quemment rencontrées dans des mastoïdites, des sinusites ainsi que dans des conjonctivites [2].

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.1.7-Facteurs de pathogénicité

I.1.7.1- La capsule

Les pneumocoques possèdent une capsule, polysaccharidique qui exerce une action anti phagocytaire. Cette capsule est la couche la plus externe et constitue le facteur majeur de virulence de la bactérie. La perte de la capsule entraîne la perte de la virulence. On connait plus de 80 variétés immunologiques différentes de capsules, ce qui a permis de caractériser autant de sérotypes. Certains sérotypes semblent plus pathogènes que d'autres.

Les anticorps dirigés contre la capsule permettent la phagocytose (ils sont opsonisant). Ces anticorps sont protecteurs, mais leur action est spécifique de sérotype [4].

I.1.7.2-Autres facteurs

Diverses adhésines permettent la colonisation. L'hémolysine du pneumocoque (la pneumolysine) joue aussi un rôle dans le pouvoir pathogène. Rappelons que la protéine C-réactive (CRP) est une protéine de la réponse inflammatoire qui réagit avec des constituants de la paroi du pneumocoque (un complexe fait d'acide teichoï_ques et de peptido_glycane) et _qui peut activer ensuite le complément [4].

I.1.8- Manifestations cliniques

Les manifestations cliniques pulmonaires sont dominées par la pneumonie franche lobaire aiguë, caractérisée par la brutalité et l'intensité des signes généraux et fonctionnels et par la pneumopathie de surinfection post virale [5].

Les infections de la sphère ORL à type d'otite et de sinusite sont potentiellement _graves par leurs complications : septicémies et ménin_gites.

La ménin_gite à pneumoco_que est la première étiolo_gie des ménin_gites purulentes de l'adulte et du nourrisson. Elle est primitive ou secondaire à un foyer ORL ou à un traumatisme crânien. Elle est caractérisée par un début

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MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

brutal, des troubles neurové_gétatifs sévères et un syndrome ménin_gé franc. La _gravité est liée au ris_que de cloisonnement en cas de retard d'un traitement adapté [5].

I.1.9- Diagnostic bactériologique I.1.9.1-Prélèvements

Les prélèvements provenant de sites normalement stériles : liquide céphalorachidien (LCR), hémocultures, liquides de ponctions pleurales ou de péritonite, pus de paracentèse, ne présentent pas de particularité.

Pour le diagnostic des infections respiratoires hautes, on peut pratiquer un prélèvement nasopharyngé.

Pour le dia_gnostic des infections respiratoires basses, plusieurs techni_ques sont possibles [6].

Les méthodes invasives par fibroscopie (lavage broncho-alvéolaire, prélèvement distal protégé ou brossage bronchique) ou ponction transtrachéale sont préférables ; elles sont toutefois réservées aux malades hospitalisés présentant des signes de gravité [2].

I.1.9.2-Transport

S. pneumoniae est une bactérie fragile, les prélèvements doivent parvenir au laboratoire dans un délai d'une heure. Cependant, les délais d'acheminement peuvent être différés pour les prélèvements effectués sur écouvillon à condition d'utiliser des dispositifs commercialisés contenant un milieu de conservation ou des _glacières [2].

I.1.9.3-Diagnostic

Le diagnostic bactériologique repose sur l'examen direct, la culture et l'identification du germe.

L'examen à l'état frais sur les prélèvements li_quidiens présente peu d'intérêt en dehors de la recherche d'une capsule par le test à l'encre de chine.

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

La coloration de Gram permet de mettre en évidence l'aspect caractéristi_que du pneumoco_que.

La culture de S. pneumoniae nécessite l'adjonction de facteurs de croissance. Les milieux les plus couramment utilisés sont la gélose trypticase soja ou gélose Columbia enrichies à 5% de sang défibriné de mouton ou de cheval. On peut utiliser également la gélose chocolat supplémentée en facteurs de croissance dont la composition est proche de celle du milieu de Mueller-Hinton.

L'ensemencement des produits se fait suivant les techni_ques habituelles de bactériologie.

L'identification est faite d'abord sur l'aspect des colonies. Elles sont opaques ou grisâtres, bombées à bord régulier. Devant une colonie suspecte sur milieu gélosé ou dans une culture, la confirmation rapide de cette identification se fait grâce à des tests complémentaires [2].

I.1.10- Traitement et prévention

> Traitement

L'antibiothérapie repose essentiellement sur l'administration d'amoxicilline par voie orale et voie intraveineuse, en fonction de la _gravité du tableau clini_que. Cependant, l'émer_gence de souches de pneumoco_que de sensibilité diminuée à la pénicilline (PSDP) doit inciter à la détermination de la CMI du germe aux béta-lactamines lorsque celui-ci est isolé en culture [4].

Dans les traitements des infections à PSDP les béta-lactamines restent les antibiotiques de premier choix tant que le niveau de résistance restera compatible avec une efficacité thérapeutique. En raison de l'échec du traitement de méningites par le céfotaxime l'association avec la vancomycine est recommandée [4].

Malgré une bonne activité in vitro, la pristinamycine n'est pas toujours efficace en thérapeutique.

Les dernières fluoroquinolones, en particulier le levroxacine, sont une alternative thérapeutique intéressante, néanmoins le risque d'émergence de souches résistantes est réel si leur utilisation est mal contrôlée, cette molécule

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

doit être réservée plutôt en deuxième intention et lors de facteurs de ris_que de complications [4].

> Prévention

L'émergence de souches résistantes aux antibiotiques accentue l'importance de la vaccination, en particulier chez les sujets à risque (splénectomisés, drépanocytaires, sujets présentant une insuffisance respiratoire ou cardiaque...). Cependant, le vaccin polysaccharidique existant est peu immuno_gène chez l'enfant de moins de 2 ans [4].

Récemment est apparu un vaccin heptavalent, capable d'induire une immunité chez l'enfant de moins de 2 ans. Son efficacité a été démontrée dans la prévention des infections systémi_ques à pneumoco_que (septicémies, ménin_gites) et, dans une moindre mesure, dans la prévention des pneumonies et des otites de l'enfant.

Le calendrier vaccinal est de trois injections à 1 mois d'intervalle chez l'enfant de moins de 6 mois, de deux injections chez l'enfant de 6 à 12 mois et d'une injection suivie d'un rappel si la vaccination à débuté après 1 an [4].

I.2- Généralités sur Haemophilus influenzae I.2.1- Historique

La bactérie a été découverte par Pfeiffer lors de l'épidémie de _grippe des années 1890, dans les crachats de _grippés. Pfeiffer la nomme à l'épo_que Bacillus influenzae sous l'influence de la présence de l'agent de la grippe (influenza) [7].

Quelques années auparavant la même espèce avait été observée dans les sécrétions purulentes de sujets atteints de conjonctivite, en Egypte par Koch et aux USA par Weeks et nommée alors Bacillus aegyptus ou Bacille de Koch et Weeks [7].

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MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59 présenté par ONDENOT Yann Christian

Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.2.2- Définition et classification

Haemophilus influenzae est un micro-organisme appartenant au règne Bacteria, à l'embranchement des Proteobacteria, à la classe des Gamma proteobacteria, à l'ordre des Pasteurellales, à la famille de Pasteurellaceae et au genre Haemophilus [8].

I.2.3-Morphologie et caractères biochimiques

Haemophilus influenzae se présente sous forme de coccobacilles ou de petits bâtonnets immobiles à Gram né_gatif. Il existe aussi des formes lon_gues, traduisant un polymorphisme qui peut être observé dans certains produits biologiques. La culture se caractérise par l'exigence en facteurs de croissance intervenant dans les enzymes de la chaîne respiratoire, le facteur X ou hémine et le facteur V ou NAD présent dans le sang. Des milieux de cultures particuliers, dits enrichis sont nécessaires comme la gélose « chocolat» [7].

Figure 3: Coloration de Gram de Haemophilus influenzae [7]

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Surveillance de la résistance aux antibiotiques de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae

I.2.4- Habitat

L'habitat naturel de Haemophilus est constitué par les mu_queuses des animaux à san_g chaud avec une certaine spécificité d'hôte. Chez l'homme, ces bactéries sont présentes dans le rhino-pharynx, l'oropharynx, l'appareil génital, et le rectum. La colonisation des voies respiratoires débute très tôt après la naissance et va se poursuivre tout au long de la vie.

La majorité des sujets sont des porteurs sains. Lorsque la bactérie a été isolée pour la première fois, chez des sujets décédés de grippe (influenza), on a cru _qu'elle était responsable de la maladie, d'où le nom _qui lui a été attribué [2].

I.2.5-Pouvoir pathogène

I.2.5.1-Infections des voies respiratoires

H. influenzae est une bactérie opportuniste, ou de surinfection. Cependant, elle peut provoquer une infection localisée.

La bactérie est responsable d'otites, de sinusites et rarement, chez l'enfant, d'une affection _grave, de l'épi_glottite.

H. influenzae est souvent impliqué aussi dans les surinfections survenant au cours des broncho-pneumopathies chroniques. Il est également responsable de pneumonies chez l'enfant et chez l'adulte (en particulier sur terrains fragiles) [4].

I.2.5.2-Méningites

Avant la vaccination, H. influenzae était la principale cause de méningites bactériennes chez le jeune enfant. La plupart des cas surviennent entre 3 mois et 3 ans et la mortalité est de l'ordre de 5 % [4].

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I.2.5.3-Autres localisations

Les infections des voies respiratoires s'accompagnent parfois des bactériémies et de localisations secondaires (en particulier ostéo-articulaires). Des infections sévères s'observent parfois chez le nouveau-né.

H. influenzae est aussi responsable de conjonctivites purulentes. Un biotype particulier, aegyptus, est habituellement responsable de conjonctivites. Il peut aussi provo_quer, dans certaines ré_gions, une infection systémi_que sévère, la fièvre purpuri_que brésilienne [4].

I.2.6-Facteurs de pathogénicité

Les infections les plus sévères (ménin_gites, épi_glottites) sont dues au sérotype b. Ce sérotype possède une capsule faite de la répétition de ribose et de ribitol-phosphate. La capsule exerce une action anti phagocytaire.

Les anticorps anti capsulaires ont un effet opsonisant, protecteur. Ils apparaissent progressivement au cours de l'enfance.

Ce sont les jeunes enfants, n'ayant pas encore acquis d'immunité qui risquent d'être atteints de méningite.

La vaccination permet maintenant de faire apparaître l'immunité dès les premiers mois. Les infections plus courantes sont souvent dues à des souches non-typables [4].

I.2.7- Manifestations cliniques

Les manifestations respiratoires dominent le tableau clini_que dans la plupart des cas et conditionnent le pronostic vital. La symptomatolo_gie est non spécifique, dominée par une toux chronique et la répétition de bronchites infectieuses et/ou asthmatiformes au cours de la première enfance. La toux est productive et l'expectoration est purulente et visqueuse. Une dyspnée d'effort est recherchée systématiquement [9].

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I.2.8- Diagnostic bactériologique I.2.8.1-Prélèvements

Pour le diagnostic des infections respiratoires, on peut pratiquer un prélèvement nasopharyngée.

Les prélèvements généralement non contaminés par les flores commensales sont les li_quides céphalorachidiens (LCR), les hémocultures, les liquides d'épanchement (pleural, articulaires, péritonéaux) et pus de ponction ou de drainage (ostéomyélites, abcès du cerveau, liquide amniotique, otites) [2].

I.2.8.2-Transport au laboratoire

Il est classique de dire que Haemophilus est sensible au froid et à la dessiccation. L'expérience montre qu'il s'agit d'une bactérie relativement résistante qui supporte un délai de mise en culture de 2 heures avec conservation au froid ou sur un écouvillon.

Par contre, si le transport et le délai de culture doivent être supérieurs à 3 heures, il est nécessaire d'utiliser des milieux de transport [2].

I.2.8.3-Diagnostic

Il repose sur l'isolement de la bactérie. La culture nécessite des milieux adaptés, apportant les facteurs de croissance comme le facteur V ou la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et le facteur X ou l'hémine _qui entrent dans la composition des enzymes respiratoires, contenant du fer (cytochromes, cytochrome oxydase, catalase, peroxydase).

La gélose au sang cuit, dite gélose chocolat, à cause de son aspect, apporte suffisamment d'hémine mais doit être supplémentée en NAD qui peut être partiellement détruit par la cuisson [2].

L'interprétation des résultats, est facile lorsque le prélèvement provient d'un site normalement stérile.

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L'examen direct du LCR, apporte un élément d'orientation de _grande valeur lors_qu'il montre un petit bacille à Gram né_gatif polymorphe. Pour les prélèvements d'origine respiratoire (bronchiques), on tiendra compte du contexte et de la quantité de bactéries. La recherche d'antigènes solubles (capsule du groupe b) peut se pratiquer sur le LCR [2].

I.2.9-Traitement et prévention

> Traitement

La bactérie est sensible à de nombreux antibiotiques, mais un pourcentage important de souches, a acquis une (3-lactamase qui les rend résistantes aux aminopénicillines. C'est pourquoi, le traitement de première intention des ménin_gites bactériennes de l'enfant, repose sur les céphalosporines de 3ème _génération.

En ce qui concerne les infections des voies respiratoires, l'association d'une aminopénicilline et d'un inhibiteur de (3-lactamases peut-être active sur les souches productrices de (3-lactamases [4].

> Prévention

La prévention des méningites repose sur la vaccination qui doit être précoce.

Le vaccin actuel est constitué par l'antigène capsulaire du type b, couplé à une protéine, dans le but de renforcer son immunogénicité. Le vaccin est très efficace pour la prévention des ménin_gites et d'une fa_çon _générale des infections invasives dues au sérotype b. Il ne protè_ge pas contre les autres types d'infections, souvent dus à des souches non typables [4].

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I.3- Généralités sur les antibiotiques

I.3.1- Historique

Les antibiotiques existent en fait dans la nature. Ils sont utilisés depuis des millénaires par certaines espèces de fourmis, mais cela n'a été constaté que très récemment.

En effet le premier antibiotique, identifié dès la fin du XIX^e siècle par Ernest Duchesne, fut la pénicilline. Ses propriétés furent redécouvertes par hasard en 1928 par Sir Alexander Flemin_{g q}ui s'aper_çut _que certaines de ses cultures bactériennes dans des boîtes de Pétri oubliées avaient été contaminées par les expériences de son voisin de paillasse étudiant un champignon : le Penicillium notatum. Mais l'importance de cette découverte, ses implications et ses utilisations médicales ne furent comprises et élaborées qu'après sa redécouverte, entre les deux grandes guerres [10].

Depuis lors, d'autres antibiotiques ont été découverts. En dehors des antibioti_ques naturels comme ceux précitées, il existe des antibioti_ques de synthèse. Le premier antibiotique (de synthèse) a ouvert une voie nouvelle dans la lutte contre de nombreuses maladies qui étaient considérées comme incurables auparavant. Les antibiotiques ont augmenté l'espérance de vie d'environ 15 ans, à ceux qui y ont accès [10].

I.3.2- Définition

On a longtemps appelé antibiotique toute substance chimique produite par un micro-organisme (bactérie ou champignon) et capable d'inhiber la croissance ou de détruire d'autres micro-organismes. A l'heure actuelle, cette définition trop restrictive doit être abandonnée, car des substances obtenues par synthèse chimi_que possèdent les mêmes propriétés.

Ainsi, on appelle antibioti_que toute substance chimi_que, _quelle _que soit son origine, agissant spécifiquement sur une étape essentielle du métabolisme des bactéries (antibiotique antibactériens) ou des champignons (antibiotiques antifongiques) [11].

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I.3.3- Classification

Les antibiotiques sont classés soit selon les familles, ou soit selon leurs sites d'action. Une famille rassemble les molécules ayant la même structure chimique de base. Les familles peuvent être divisées en groupes et sous-groupes en fonction des modifications de la structure chimique, qui apportent des chan_gements du spectre d'activité ou des propriétés pharmacolo_gi_ques [12].

I.3.3.1- Classification selon les familles

Il existe 12 _grandes familles d'antibioti_ques :

· Les bêta-lactamines telles que la pénicilline,

l'amoxicilline, les céphalosporines.

· Les aminoglycosides tels que la streptomycine, la gentamicine, la kanamycine.

· Les macrolides tels _que l'érythromycine, les kétolides, la josamycine.

· Les fluoroquinolones telles que la ciprofloxacine, l'ofloxacine.

· Les antibioti_ques peptidi_ques tels _que les lipo_glycopeptides, les _glycopeptides.

· Les ansamycines tels que les rifamycines.

· Les tétracyclines telles que la tétracycline et la doxycycline.

· Les lincosamides telles la lincomycine, la clindamycine.

· Le chloramphénicol.

· Les benzylpyrimidines telles _que le méthotrexate, le pro_guanil.

· Les sulfamides tels que la sulfaméthoxydiazine.

· Les 5-nitroimidazoles [13].

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I.3.3.2-Classification des antibiotiques selon le site d'action

L'usage, vraisemblablement en raison de l'intérêt bactériologique qui en découle, a consacré une classification des antibiotiques basée sur le site d'action dans la bactérie ou sur le processus visé [12].

Ainsi, distingue-t-on sommairement :

· Les antibiotiques actifs sur la paroi bactérienne : -Les béta-lactamines,

- Les glycopeptides,

- Les phosphopeptides,

· Les antibiotiques actifs sur la membrane cytoplasmique :

- Les gramicidines,

-Les Polymyxines.

· Les antibiotiques actifs sur des processus localisés dans le cytoplasme bactérien : synthèse protéique, réplication de l'ADN ou les deux :

-Les aminosides, les cyclines, les macrolides, les lincosamides, les kétolides, les streptogramines, la rifampicinine, le chloramphénicol, l'acide fusidi_que, la triméthoprime+sulfaméthoxazole,

-Les fluoroquinolones [12].

I.3.4-Mécanisme d'action des antibiotiques I.3.4.1-Action sur la paroi bactérienne

La principale fonction de ces antibioti_ques s'exerce sur le peptido_glycane de la bactérie. Le peptido_glycane est un polymère réticulé fait de chaînes polysaccharidiques reliées par des peptides. Ce constituant confère à la bactérie sa forme et sa rigidité qui lui permet de résister à la forte pression osmotique intra-cytoplasmique [12].

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I.3.4.1.1- Les beta-lactamines

Les bêta-lactamines sont des acides organiques relativement forts, et possèdent toutes un noyau (3-lactame qui est la structure chimique indispensable à l'activité antibactérienne. Cependant, comme elles agissent sur la partie externe de la membrane cytoplasmi_que, la paroi est le seul obstacle entre les bêta-lactamines et les cibles [12].

De ce fait, la composition de la paroi variable selon la nature de la bactérie (Gram positif ou Gram né_gatif), déterminera la sensibilité de la bactérie aux bêta-lactamines.

Chez les bactéries à Gram positif, la pénétration est en général aisée car le peptidoglycane est perméable aux petites molécules comme les (3-lactamines.

Chez les bactéries à Gram-négatif, la pénétration des bêta-lactamines peut se faire par voie lipophile, ou en empruntant la voie des porines pour celles qui sont hydrophiles. Les bêta-lactamines inhibent la dernière étape de la synthèse du peptido_glycane, se fixent sur les protéines de liaison à la pénicilline(PLP) par une liaison covalente. L'inhibition des PLP conduit à l'arrêt de la croissance bactérienne (bactériostase), ce qui correspond à un effet bactériostatique, suivi de phénomènes complexes comme l'activation des autolysines aboutissant à la mort des bactéries (bactériolyse) [12].

I.3.4.1.2-Les glycoprotéines

Les glycopeptides agissent comme les (3-lactamines à la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane. Ces molécules de poids moléculaire élevé ont une structure tridimensionnelle en forme de poche. En raison de leur volume, elles créent un encombrement qui perturbe également les réactions de transglycolisation. Ces actions conduisent à l'inhibition de la croissance bactérienne [12].

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I.3.4.1.3-Les fosfomycines

La Fosfomycine agit au début de la synthèse du peptidoglycane, dans sa phase intra-cytoplasmi_que. Elle inhibe la pyruvyl-transférase, enzyme impli_quée dans la synthèse du précurseur, l'acide UDP-N-acétylmurami_que. Pour franchir la membrane cytoplasmique, la Fosfomycine utilise deux systèmes de transport actif :

- le système de transport du glycérophosphate, prépondérant, d'expression constitutive ;

- et le système de transport des hexoses monophosphates, secondaire, d'expression inductible [12].

I.3.4.2-Antibiotiques actifs sur la synthèse des protéines ou des acides nucléiques

I.3.4.2.1-Mécanisme d'action des aminosides

Les aminosides se comportent, sur le plan chimique, comme les polycations. Cette particularité va leur permettre de se concentrer dans l'environnement immédiat des bactéries par attraction des charges négatives de celles-ci [12].

Le passa_ge à la paroi est un transfert passif. Il est aisé chez les bactéries à Gram positif, par contre chez les bactéries à Gram négatif, il utilise la voie des porines. La traversée de la membrane cytoplasmique nécessite, un processus énergie-dépendant impliquant des systèmes de transport qui sont les enzymes de la respiration bactérienne. La cible principale des aminosides est la sous-unité 30S du ribosome, il va y avoir changement morphologique de l'ensemble du ribosome et altération de toutes les étapes de la synthèse protéi_que normale.

En raison de nombreuses erreurs de lecture, on observe une synthèse de protéines anormales lesquelles vont être incorporées dans la membrane cytoplasmique qui va ainsi perdre son intégrité et favoriser une augmentation de la pénétration des aminosides. La bactéricidie rapide et profonde des aminosides résulte donc essentiellement de l'arrêt de la synthèse protéique et de la perte de l'intégrité membranaire [12].

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I.3.4.2.2-Mécanisme d'action des quinolones Les quinolones sont divisées en deux groupes :

- les anciennes molécules, appelées parfois _quinolones de 1ére _génération, actives uniquement sur les bactéries Gram négatif responsables d'infections urinaires ;

- les fluoroquinolones (FQ), au spectre plus large et d'utilisation systémique.

Leurs mécanismes d'action sont identi_ques.

La traversée du peptido_glycane par les _quinolones, aussi bien chez les bactéries à Gram positif _que chez les bactéries à Gram né_gatif se fait par diffusion passive, non saturable. Notons que chez les bactéries à Gram négatif, les quinolones empruntent la voie des porines.

Il existe un processus naturel d'excrétion des systèmes d'efflux fonctionnant à bas niveau.

Les _quinolones entrainent une inhibition rapide de la synthèse de l'acide désoxyribonucléique (ADN) aboutissant à la mort bactérienne [12].

I.3.4.2.3-Mécanismes d'action du groupe : Macrolides-Lincosamides- Synergistines-Kétolides (MLSK)

Les macrolides, lincosamides, syner_gistines et kétolides diffusent très difficilement à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif, ce qui explique la résistance naturelle de nombreux bacilles à Gram négatif à ces antibiotiques [12].

Les macrolides, lincosamides et streptogramines se fixent sur la sous-unité 50S du ribosome au niveau de l'ARN ribosomal 23S. Le site de liaison majeur de l'érythromycine se situe au niveau de deux séquences contiguës de l'ARN 23S situées dans les domaines V et II. Cette fixation a pour résultat un arrêt de la phase d'élongation de la synthèse protéique.

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La télithromycine possède une affinité accrue pour le domaine II. Elle inhibe l'assembla_ge des deux sous-unités 30S et 50S, blo_que l'assembla_ge des peptides et donc la synthèse protéique. Les macrolides, lincosamides, sont considérés comme bactériostatiques. Les synergistines sont formées de deux composés (streptogramines A et B) qui possèdent des sites d'action différents. Ils agissent en synergie et l'association est bactéricide [12].

I.4- Epidémiologie de la résistance des bactéries aux

antibiotiques

Depuis l'introduction des antibiotiques dans l'arsenal thérapeutique des maladies infectieuses, les microorganismes ont développé des moyens de défense leurs conférant une résistance aux antibactériens [13].

Ces résistances aux antibiotiques aux doses thérapeutiques apparaissent plus ou moins rapidement selon la complexité chimique des antibiotiques et du patrimoine génétique de la bactérie.

Actuellement quel que soit l'antibiotique utilisé, il existe des souches de différentes espèces bactériennes qui leur sont résistantes. Le mécanisme de résistance peut avoir comme support _généti_que un _gène d'ori_gine plasmidi_que ou chromosomi_que [13].

La réponse de la bactérie est souvent complexe, il peut s'agir d'empêcher l'antibioti_que de pénétrer à l'intérieur de la cellule bactérienne, d'inactiver le xénobiotique par des enzymes ou de modifier le site d'action de l'antibiotique, voire de synthétiser des systèmes additionnels qui permettent de contourner l'action de l'antibiotique, voire de le refouler activement à l'extérieur (efflux) [13].

Toutes les espèces ou genres bactériens sont concernés par le phénomène de la résistance aux antibactériens posant parfois de véritables problèmes thérapeutiques. La résistance aux antibactériens est un phénomène universel, qui semble plus aigu dans certains pays en voie de développement du fait de la monotonie des antibioti_ques utilisables [13].

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I.4.1-Epidémiologie de la résistance de

Streptoccocus pneumoniae aux antibiotiques

Streptoccocus pneumoniae est responsable d'une importante mortalité et d'une morbidité élevée. Il s'agit du premier agent pathogène responsable des infections respiratoires, la deuxième étiolo_gie des ménin_gites purulentes, et l'une des causes majeures des otites de l'oreille moyenne [13].

Les sulfamides ont été introduits en thérapeutique vers 1936, et dès 1943 les premières souches de pneumocoques résistantes ont été rapportées. Les premières souches résistantes aux cyclines ont été publiées en 1962.

En 1964, les premières souches résistantes à l'érythromycine A ont été décrites lors d'une étude dans le traitement des surinfections lors des poussées ai_gues chez les patients souffrant d'une bronchite chroni_que [13].

Depuis 10 ans, le nombre de souches de S. pneumoniae résistantes à la pénicilline G est en au_gmentation constante.

On appelle souche multirésistante de Streptoccocus pneumoniae, une souche insensible à au moins trois antibiotiques. Le nombre de souches résistantes à l'érythromycine A devient élevé ; ce type de souche a été isolée dans le monde entier. Il s'agit souvent de souches également de sensibilité diminuée ou résistante à la pénicilline G. La première souche multirésistante a été décrite en 1977 en Afrique du Sud ; il s'agissait d'une souche résistante à la pénicilline G, à l'érythromycine A, au chloramphénicol, à la tétracycline et au cotrimoxazole [13].

I.4.2-Epidémiologie de la résistance de Haemophilus influenzae aux antibiotiques

Haemophilus influenzae est un agent important des infections respiratoires basses et hautes, des conjonctivites, et des méningites purulentes. La détermination de l'activité in vitro des antibactériens sur H. influenzae est complexe, car la valeur des CMI est fonction du milieu de culture, du pH, de la composition du _gaz d'incubation du _gaz d'incubation (CO₂), de la taille de l'inoculum [13].

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De plus cette espèce bactérienne a besoin de facteurs de croissance, ce _qui compli_que l'appréciation de la CMI.

Au début des années 1960, l'ampicilline était devenu l'antibioti_que de référence dans le traitement des infections dut à H.influenzae. Dès 1974, les premières souches productrices de béta-lactamases furent décrites.

La résistance à l'ampicilline s'accompa_gne souvent d'une résistance au chloramphénicol et aux cyclines. La résistance aux cyclines a été détectée dès 1970, et celle du chloramphénicol dès 1972.

Gould en 1994 a rapporté la première souche de H .influenzae résistante à la ciprofloxacine (CMI=8mg /L) et à l'ofloxacine (CMI=32mg/L) [13].

I. 5- La résistance des bactéries aux antibiotiques

La résistance aux antibiotiques peut-être naturelle ou acquise.

La résistance naturelle d'une espèce ou d'un genre est une caractéristique propre, appartenant à l'ensemble des souches de cette espèce ou de ce genre. Elle est toujours transmissible à la descendance (transmission verticale), car portée par le chromosome, alors que la transmission horizontale est très rare ou inexistante [12].

La résistance naturelle détermine les phénotypes « sauva_ges » des espèces bactériennes vis-à-vis des antibiotiques.

La résistance acquise ne concerne qu'une proportion variable dans le temps, de souches d'une espèce ou d'un genre ; elle existe grâce à l'acquisition d'un (ou plusieurs) mécanisme(s) de résistance qui détermine(nt) un phénotype bien précis de résistance, différent du phénotype sauvage caractérisant les souches n'ayant pas acquis ce mécanisme [12].

I.5.1-Mécanisme de résistance acquise

Trois mécanismes rendent compte de la résistance acquise des bactéries aux antibiotiques :

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· Diminution de la quantité d'antibiotique atteignant la cible par diminution de la perméabilité ou par apparition de système d'efflux.

La baisse de la perméabilité concerne surtout les bactéries à Gram négatif (membrane externe) dont les porines s'obstruent partiellement ou totalement, ou alors disparaissent [12].

Les systèmes d'efflux sont constitués de protéines particulières jouant le rôle de pompe à extrusion, utilisant une force proton-motrice et expulsant l'antibioti_que dès _qu'il apparaît dans la cellule bactérienne. Ils peuvent concerner les antibiotiques très variés, tels que les fluoroquinolones, le chloramphénicol, les tétracyclines, les béta-lactamines [12].

· Modification de la cible de l'antibiotique

Ce type de résistance peut aller jus_qu'à l'absence de cible. En terme de résistance acquise, on peut observer une modification partielle de la nature de la cible, une modification du nombre (hyperproduction), un changement total (nouvelle cible), parfois une association de plusieurs de ces mécanismes. Ces modifications se font soit par mutation(s) dans les gènes codant pour la cible de l'antibiotique, soit par acquisition de gènes étrangers [12].

· Inactivation de l'antibioti_que

C'est le mécanisme le plus fréquent en pathologie infectieuse. Il peut s'agir d'une destruction de l'antibiotique, telle l'hydrolyse des béta-lactamines par les béta-lactamases, ou d'une modification de la molécule par ajout de radicaux telles les estérifications des aminosides par les aminosides-phosphotransférases (APH), -nucleotidyltransférases (ANT), -acetyltransferases (AAC) [12].

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I.5.2-Mécanismes de résistance par grandes familles d'antibiotiques

I.5.2.1-Résistance aux béta-lactamines

La résistance par modification des PLP est fréquente, qu'il s'agisse de mutation ou d'ac_quisition de _gènes étran_gers, ou d'hyper-ac_quisition des PLP normales.

Les mécanismes d'efflux sont illustrés par Pseudomonas aeruginosa chez qui la surexpression de trois systèmes sous l'effet de mutation touchant les gènes régulateurs se traduit par une résistance de bas niveau aux béta-lactamines anti-pyocyaniques.

La résistance liée à la synthèse de béta-lactamases est très fréquente. Plusieurs centaines d'enzymes différents existent chez les bactéries aérobies et anaérobies à Gram positif ou né_gatif [12].

I.5.2.2-Résistance aux aminosides

Les trois types de résistances qui peuvent être élaborée à l'encontre des aminosides sont:

- défaut d'accumulation, modification de la cible ;

- enzymes inactivatrices.

L'efficacité de ces mécanismes est très variable ainsi que leurs fréquences respectives [12].

I.5.2.3-Résistance aux quinolones

Deux _groupes de mécanismes de résistance ont été décrits pour les fluoro_quinolones :

- défaut ou mauvaise affinité de la cible ;

- défaut de pénétration ou système d'efflux.

A l'heure actuelle, aucune enzyme d'hydrolyse des quinolones n'a été décrite [12].

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I.5.2.4-Résistance aux glycopeptides

Le site de fixation normal des glycopeptides est le D-Ala-D-Ala terminal du précurseur du peptidoglycane. Chez les entérocoques naturellement résistants à la vancomycine, le D-Ala-D-Ala est remplacé par le D-Ala-D-Ser, dipeptide ayant moins d'affinité pour la vancomycine, mais une affinité normale pour la teicoplanine.

Deux types de résistances ac_quises ont été décrits chez les entéroco_ques : VanA et VanB.

I.5.2.5-Résistance aux macrolides et kétolides

Modification de la cible :

Il s'agit d'une méthylation spécifique de l'ARN ribosomal 23S de la sous-unité 50S du ribosome. Il s'ensuit une diminution de l'affinité de Macrolides-lincosamides-syner_gistines (MLS) pour le ribosome [12].

Résistance enzymatique :

Elle est liée à la production d'estérases ou de phosphotransférases à l'origine de la résistance à haut niveau des entérobactéries aux macrolides [12].

Efflux :

Un _gène plasmidi_que msrA code pour une protéine d'efflux _qui confère une résistance inductible aux macrolides à 14 et 15 atomes [12].

I.6-La sensibilité des bactéries aux antibiotiques

I.6.1-Sensibilité de Streptococcus pneumoniae aux antibiotiques

Les souches Streptococcus pneumoniae sont, jusqu'à maintenant, généralement bien sensibles à la majorité des antibiotiques, sauf aux aminoglycosides

Les pénicillines, les sulfamidés, les macrolides sont actifs sur tous les pneumoco_ques, _quel _que soit leur type [14].

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I.6.2-Sensibilité de Haemophilus influenzae aux antibiotiques

Les différentes espèces sont habituellement résistantes au lincosamides et peu sensibles in vitro aux macrolides.

Haemophilus influenzae est sensible aux principales familles
d'antibioti_ques telles _que : la pénicilline (ampicilline) ; les céphalosporines (Ière, IIème et surtout IIIème génération) ; les aminoglycosides ; le chloramphénicol ; la tétracycline ; la triméthoprime ; les sulfamides ; la rifampicine et les quinolones [14].

I.7-L'antibiogramme I.7.1-Définition

Un antibio_gramme est une techni_que de laboratoire visant à tester la sensibilité ou la résistance d'une souche bactérienne à croissance rapide vis-à-vis d'un panel d'antibiotiques [15].

I.7.2-Principe

Les disques d'antibiotiques sont déposés à la surface d'un milieu de culture préalablement ensemencée avec une dilution calibrée de la bactérie à tester [15].

Un gradient de concentration s'établit dans la gélose et après 18 à 24 heures d'incubation la croissance de la bactérie dessine des halos d'inhibition ou de non inhibition autour du disque d'antibiotique qui seront mesurés avec une règle spéciale (pied à coulisse) [15].

Ces diamètres, seront notés Sensible(s), Intermédiaire(I), Résistant(R), comparativement aux livres de référence [15].

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I.8-La Concentration Minimale Inhibitrice(CMI) I.8.1-Définition

La concentration minimale inhibitrice correspond à la plus petite concentration d'antibiotique qui inhibe toute culture visible d'une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l'effet bactériostati_que d'un antibioti_que [16].

Différentes techniques sont possibles ; en milieu gélosé par diffusion avec des dis_ques ou lan_guettes char_gés d'antibioti_ques ou en milieu li_quide avec différentes concentrations d'antibioti_ques dans les méthodes automatisées [16].

I.8.2-Principe

La méthode de diffusion en gélose consiste à déposer des disques de papier imprégnés d'antibiotiques sur une gélose ensemencée avec la bactérie à étudier [16].

Il s'établit dans la _gélose un _gradient de concentration d'antibioti_que autour de chaque disque ou languettes. Après 18 heures d'incubation, il se produit un halo d'inhibition autour de chaque disque ou languettes qui permet de mesurer un diamètre [16].

Ce diamètre reflète la valeur de la CMI. La comparaison de ce diamètre aux diamètres critiques publiés par le CASFM (Comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) permet de répondre qualitativement si la souche étudiée est sensible, intermédiaire ou résistante [16].

C'est la méthode de référence pour mesurer l'activité d'un antibioti_que vis-à-vis d'une souche bactérienne donnée, elle consiste à déterminer, dans des conditions bien standardisées (de milieu et d'inoculum), la concentration minimale d'antibiotique capable d'inhiber la croissance bactérienne.

Pour ce faire, on réalise une gamme de dilutions (habituellement de raison 2) de l'antibiotique, soit en milieu liquide, soit en milieu solide. Les différentes dilutions sont ensemencées avec la bactérie étudiée et l'on peut déterminer après 18h d'incubation, où se situe la CMI [16].

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I.8.3-Interprétation

Le diamètre de la zone d'inhibition est corrélé à la CMI _grâce à des courbes de concordances qui ont été établies en déterminant d'une part la CMI par dilution en gélose d'une série de souches de sensibilités différentes et d'autre part les zones d'inhibition obtenues avec des disques de contenu différent et en traçant pour chaque charge de disque la courbe de concordance entre diamètre d'inhibition et CMI .

La charge du disque qui sera choisie sera celle qui donne le meilleur coefficient de corrélation.

En fonction de la courbe de concordance, on pourra à partir du diamètre, déterminer la CMI et il s'agira d'une lecture quantitative.

On peut interpréter la CMI trouvée en fonction des critères définis plus haut et fournir les résultats en souche sensible (S), intermédiaire (I) et résistant (R).

Un troisième type d'interprétation est le plus souvent utilisé : à chaque concentration criti_que correspond un diamètre criti_que. Le diamètre mesuré en mm peut donc être comparé directement avec les diamètres criti_ques supérieurs et inférieurs délimitant les catégories sensibles, intermédiaires et résistantes [17].

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Figure 4 : Image d'un test de CMI [20]

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II.1-Type d'étude

La présente étude de type transversale a été réalisée de juin 2008 à Juin

2009.

II.2-Lieu d'étude

Les prélèvements ont été effectués dans les différents hôpitaux et cliniques de Libreville notamment : l'Hôpital Régional de Melen, le Centre Hospitalier de Libreville, l'Hôpital d'Instruction des Armés Omar Bongo Ondimba, l'Hôpital Pédiatrique d'Owendo et la clinique EDZANG ; puis acheminés au Département de Microbiologie de la Faculté de Médecine de l'Université des Sciences de la Santé.

II.3-Patients

La population d'étude a été constituée de 150 enfants et adultes, tous sexes confondus, sur lesquels on a effectué les prélèvements du nasopharynx et de l'oreille au cours d'une épidémie de grippe.

II.3.1-Critères d'inclusions

Les critères d'inclusions ont été : les enfants et adultes présentant un syndrome grippal, une rhinopharyngite, de la toux avec ou sans fièvre lors des consultations.

II.3.2-Critères d'exclusions

Tous les patients ne présentant pas les symptômes énoncés dans les critères d'inclusions.

II.4-Matériel

- Gants stériles

- 4 à 5 écouvillons par patients

- 2 jarres d'anaérobie conditionnées

- 1 bougie

- Des allumettes

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- Géloses chocolat polyvitex

- Géloses au sang préparées à base de Trypcase soja + 5% de sang de mouton

- Pinces stériles

- Oses stériles de 1u, 10uL

- Glacière

- Etuves à 35-37°C

- Test à l'optochine

- Réaction d'agglutination : Slidex méningites Kit ou Pastorex Kit

II. 5-Méthodes

II. 5.1-Enregistrements

Les données démographiques des patients ont été enregistrées sur un formulaire (voir annexe).

II. 5.2- Prélèvements nasopharyngés et d'oreille

Ils ont été effectués par écouvillonnages du nez ou de la gorge à l'aide d'un écouvillon stérile. A cet effet, 4 écouvillons ont été utilisés en effectuant des rotations.

En cas d'otite purulent, le prélèvement a été effectué au niveau du conduit

auditif externe par le médecin ORL en utilisant 2 écouvillons.

II. 5.3-Analyses bactériologiques des prélèvements

· Etape 1 : Ensemencement des milieux de cultures

Premier jour

Sitôt le prélèvement effectué, une boite de gélose a été ensemencée par la technique des stries avec l'écouvillon contenant les sécrétions nasales, pharyn_gées ou de l'oreille.

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La _gélose à été ensuite placée dans une jarre anaérobie. Les prélèvements ainsi ensemencés sont transportés au laboratoire et la jarre mise dans une étuve à 37 °C pendant 24 heures.

· Etape 2 : Examen des géloses

Deuxième jour

Après 24 heures, la jarre a été sortie et les géloses examinées. L'examen des colonies s'est fait devant la flamme du bec Bensen. La taille, l'aspect, la couleur et le type d'hémolyse, ont été notés sur un registre.

· Etape 3 : Réalisation du frottis

Pour réaliser un frottis on a :

- émulsionné une colonie dans une goutte d'eau distillée stérile à l'aide d'une pipette Pasteur, sur une lame.

- séché la lame à l'air, non loin de la flamme du bec Bensen.

- passé rapidement la lame à la flamme trois fois pour fixer le frottis.

· Etape 4 : Coloration de Gram

C'est un examen _qui a pour but de déterminer la forme des bactéries, ainsi que leur coloration au Gram, en vue de l'identification du germe.

Pour cela il faut :

- Recouvrir entièrement la lame d'une solution de Violet cristal pendant 1 minute et rincer à l'eau du robinet.

- Recouvrir ensuite d'une solution de lu_gol pendant 1 minute et rincer à l'eau du robinet.

- Décolorer la lame par de l'alcool-acétone pendant 15 secondes, et rincer à l'eau du robinet.

- Recouvrir la lame d'une solution de safranine pendant 1 minute et rincer à l'eau du robinet.

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- Sécher la lame.

- Noter la présence, la morphologie et coloration des bactéries.

· Etape 5 : Tests complémentaires

- Test de sensibilité à l'optochine

La sensibilité de Streptococcus pneumoniae à l'optochine s'est faite en touchant une colonie suspecte alpha-hémolyti_que avec la boucle d'une pipette Pasteur. Cette colonie a été ensuite ensemencée en stries serrées sur _gélose au sang.

Un dis_que à l'optochine de 6 mm de diamètre est déposé sur la _gélose, de préférence aux extrémités.

La gélose a été incubée 18 à 24 heures à 37°C dans une jarre anaérobie puis l'étuve.

- Réaction d'agglutination (trousse Slidex méningite kit R5 de Bio Mérieux).

Ce test permet le diagnostic de certitude de S. pneumoniae et H. influenzae.

Principe

Le principe de cette réaction est basé sur la capacité des antigènes solubles de S .pneumoniae ou de H. influenzae, contenus dans l'échantillon à former des a_gré_gats avec les particules de latex sensibilisées avec des anticorps spécifiques.

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Mode opératoire

Cette technique s'effectue, suite à un résultat positif à l'optochine, ainsi :

- une à deux colonies bactériennes ont été placées dans un tube à essai, contenant de l'eau distillée stérile puis émulsionnées jusqu'à obtenir une couleur blanche laiteuse.

- la préparation centrifugée pendant 10 minutes à 2000t /min et le surnageant récupéré.

- sur une carte aux emplacements prévus à cet effet, on a placé 1 _goutte de chacune des suspensions homo_gènes de latex, puis respectivement 30_uL de surnageant.

- le contenu de chaque cercle a été mélangé, en utilisant toute la surface, à l'aide d'un bâtonnet (utiliser une extrémité propre de bâtonnet pour chaque cercle).

- on a imprimé à la carte un léger mouvement de rotation, puis on a vérifié régulièrement l'apparition d'une agglutination.

· Etape 6 : Antibiogramme Pour effectué l'antibiogramme:

Des _géloses chocolat poly Vitex pour H. influenzae et _gélose Mueller Hinton additionnée de sang de mouton pour S. pneumoniae on été coulées en boîte de Pétri sur une épaisseur de 4 mm. Les géloses ont ensuite été séchées avant l'emploi.

Dans un tube à hémolyse contenant de l'eau distillée stérile, une à deux colonies ont été émulsionnées pour obtenir une turbidité comparable à celle du Mac Ferland 0.5.

Un écouvillon stérile a été trempé dans la préparation, ensemencé sur gélose par la technique des stries serrées. La gélose été placée à l'étuve à 37°C pendant 15 minutes.

Après les 15 minutes, des disques d'antibiotiques ont été déposés à l'aide d'une pince flambée en prenant soin de les espacer de 24 mm.

La gélose a été laissée à température ambiante pendant 30 mm avant de la mettre à l'étuve à 37°C pendant 24 h.

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La lecture s'est faite à l'aide d'un pied à coulisse en mesurant avec précision les diamètres des zones d'inhibition sur la base de la boite de _gélose retournée et maintenue fermée.

Les résultats ont été comparés aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture. Les bactéries ont été classées dans l'une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistant à l'antibiotique.

· Etape 7 : Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)

La CMI est une techni_que de laboratoire _qui est réalisé en cas de résistance des bactéries aux antibiotiques. Pour cela:

Dans un tube à hémolyse contenant de l'eau distillée stérile, une à deux colonies ont été émulsionnées pour obtenir une turbidité comparable à celle du Mac Ferland 0.5.

Un écouvillon stérile a été trempé dans la préparation, ensemencée sur gélose chocolat poly Vitex pour H. influenzae et gélose Mueller Hinton additionné de 5% sang de mouton pour S. pneumoniae par la technique des stries serrées.

La gélose a été placée l'étuve à 37°C pendant 15minutes.

Après les 15 minutes, 2 lan_guettes d'antibioti_ques ont été déposées en sens opposé à l'aide d'une pince flambé.

Les boites ont été laissées à température ambiante pendant 30 minutes avant de la mettre à l'étuve à 37°C pendant 24 heures.

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La lecture de la CMI de l'antibioti_que a été faite au point d'intersection de l'ellipse d'inhibition et de la bandelette après 24 h.

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III.1-Aspect des colonies de Streptococcus

pneumoniae et de Haemophilus influenzae

Sur gélose au sang, les colonies de S. pneumoniae sont petites, grisâtres, muqueuses (en gouttes de rosée), entourées par une zone verdâtre d'hémolyse alpha.

Sur gélose chocolat polyvitex, les colonies de H. influenzae sont grandes, plates, opa_ques, incolores ou _grisâtres sans hémolyse.

III.2-Résultats de la coloration de Gram

Lors de la lecture au microscope on a observé :

S. pneumoniae _qui se présentait comme des diploco_ques à Gram positif lancéolés, parfois en chaînettes ;

H. influenzae _qui avait l'aspect de petits bacilles ou des coccobacilles à Gram négatif polymorphes disposés au hasard.

III.3-Lecture du test à l'optochine

Après incubation, on a observé les zones d'inhibition autour du disque d'optochine. Toutes les souches testées ont donné un diamètre supérieur à 15 mm de diamètre indiquant une sensibilité de la souche à l'optochine, relative à Streptococcus pneumoniae.

III.4-Test d'agglutination

Pour toutes les souches suspectes testées, nous avons noté qu'au niveau de celles dont le test était positif il y avait présence d'agrégats parfois légers ou prononcés.

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III. 5- Répartition des cas dans la population générale

Le tableau I montre que sur les 150 prélèvements effectués nous avons détecté 6 cas positifs soit (4%), et 144 cas négatifs soit (96%).

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Tableau I : Répartition des cas dans la population générale.

Résultats Nombre de cas Pourcentage

144 96

6 4

150 100

Négatifs Positifs Total

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III.6-Répartition des cas selon les tranches d'âge

Le tableau II montre que ce sont les enfants âgés de 0 à 6 ans qui étaient infectés : 3 cas positif dans la tranche d'â_ge de 0-1ans, 2 cas positifs de 1-2 ans et 1 cas de 2-7 ans.

Tableau II : Répartition des cas selon les tranches d'âge

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Tranches d'âge

Résultats	0-1	1-2	2-7	7-12	+ de 12	Total
Négatifs	28	16	12	2	86	144
Positifs	3	2	1	0	0	6
Total	31	18	13	2	86	150

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III.7- Répartition des cas positifs selon les espèces

Sur les 6 cas positifs, 5 étaient des infections dues à Streptococcus pneumoniae (83,33%) et 1 cas du à Haemophilus influenzae soit (16,67%), (figure 5).

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Figure 5 : Répartition des cas positifs selon les espèces

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III.8-Résultats de l'antibiogramme et de la CMI

des souches de S. pneumoniae

Les tableaux (IIII et IV) nous montrent que les 5 souches de Streptococcus pneumoniae testées ont été toutes résistantes à l'Erythromycine et à la Clindamycine (100%) ; 4 souches ont été résistantes à la tétracycline, au chloramphénicol et à l'association sulfamide+Triméthoprime (80%) et enfin 1 souche à été sensible à la tétracycline, au chloramphénicol et à l'association sulfamide+Triméthoprime (20%). Les souches ont été identifiées par les 3 premières lettres du nom du patient, soit ONA, AYO, MAH, MAN et BOU.

Tableau III : Antibiogramme et CMI de la souche S. pneumoniae ONA

Antibiotiques Concentration du disque (ug)

Taille de la zone d'inhibition (mm)

1S 2I 3R CMI (ug/ml)

Erythromycine 15.00 15 R 0.047

Clindamycine 2 2 R 0.5

Sulfamide+triméthoprime 23.75+1.25 25 S

Tétracycline 30 30 S

Chloramphénicol 30 30 S

Amoxicilline+acide clavulanique 20+10 20 I 0.50

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Tableau IV : Antibiogramme et CMI de la souche S.pneumoniae AYO

Antibiotiques	Concentration du disque (ug)	Taille de la 1S 2I zone d'inhibition (mm)	3R	CMI (ug/ml)
Erythromycine	15	12	R	0,044
Clindamycine	2	13	R	0,75
Sulfamide+triméthoprime	23.75+1.25	12	R
Tétracycline	30	12	R
Chloramphénicol	30	13	R
Amoxicilline+acide clavulanique	20+10	14	R	6

Tableau V : Antibiogramme et CMI de la souche de S.pneumoniae MAH

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Antibiotiques	Concentration du disque (ug)	Taille de la 1S 2I zone d'inhibition (mm)	3R	CMI (ug/ml)
Erythromycine	15	10	R	0,040
Clindamycine	2	13	R	0,75
Sulfamide+triméthoprime	23.75+1.25	12	R
Tétracycline	30	10	R
Chloramphénicol	30	13	R
Amoxicilline+acide clavulanique	20+10	19	R	0.38

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Tableau VI: Antibiogramme et CMI de la souche de S.pneumoniae MAN

Antibiotiques Concentration du disque (ug)

Taille de la zone d'inhibition (mm)

1S 2I 3R CMI (ug/ml)

Erythromycine 15 21 R 0,032

Clindamycine 2 21 R 0,80

Sulfamide+triméthoprime 23.75+1.25 10 R

Tétracycline 30 8 R

Chloramphénicol 30 18 R

Amoxicilline+acide clavulanique 20+10 20 I 0.50

Tableau VII : Antibiogramme et CMI de la souche de S.pneumoniae BOU

Antibiotiques Concentration du disque (ug)

Taille de la zone d'inhibition (mm)

1S 2I 3R CMI (ug/ml)

Erythromycine 15 21 R

Clindamycine 2 19 R

Sulfamide+triméthoprime 23.75+1.25 8 R

Tétracycline 30 12 R

Chloramphénicol 30 15 R

Amoxicilline+acide clavulanique 16

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III.9-Résultat de l'antibiogramme et de la CMI de

Haemophilus influenzae

Le tableau VIII montre le diamètre d'inhibition des différents antibiotiques. Il nous montre aussi que la souche de Haemophilus influenzae testée à été résistante à l'association Amoxicilline+acide clavulani_que, à l'association sulfamides+Triméthoprime, et a une résistance intermédiaire à l'Ofloxacine. La souches a été identifiée ALE

Tableau VIII : Antibiogramme et CMI de la souche de H.influenzae ALE

Antibiotiques Concentration du disque (ug)

Taille de la zone d'inhibition (mm)

1S 2I 3R CMI (ug/ml)

Amoxicilline+acide clavulanique 15 21 R

Ofloxacine 2 21 I 0 ,38

Sulfamide+triméthoprime 23.75+1.25 10 R 0 ,4

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Au terme de notre étude, nous avons recueilli 150 prélèvements, nombre _qui s'avère insuffisant lors d'une épidémie.

Généralement, les épidémies d'affections respiratoires sont d'abord virales [4]. Ces affections sont par la suite surinfectées par des bactéries, dont Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.

Le fait de n'obtenir _que 4% de cas positif tel _que mentionné dans le tableau I, peut s'expliquer par le fait que nous avons commencé les prélèvements en retard, faute de réactifs alors que l'épidémie tirait vers la fin.

Bien _que l'échantillonna_ge soit réduit, les résultats mentionnés dans le tableau II, similaire à ceux décrits dans la littérature [10] qui montre que la tranche d'âge la plus touchée est celle de 0 à 2 ans (voir de 0 à Tans).

Les résultas illustrés dans la figure 4, montrent la tendance de S. pneumoniae à être le plus fréquemment retrouvés dans les pneumopathies, les otites et les méningites, par rapport à H. influenzae qui vient au second plan, suivi de Neisseria meningitidis[19].

IV.1-Aspect des colonies

L'aspect des colonies est un élément indispensable à l'identification d'une bactérie, car, toutes les bactéries n'ont pas les mêmes caractéristiques morphologiques sur gélose.

IV.2-Coloration de Gram

La coloration de Gram est une étape clé dans l'identification des bactéries. Après l'examen de l'aspect des colonies, il est important de déterminer le Gram de la bactérie, afin de continuer le processus d'identification. Il nous oriente sur le test qui va être subséquemment effectué.

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IV.3-La sensibilité à l'optochine

C'est à la suite des résultats de la coloration de Gram positif, et vu que nous avions des cocci Gram positif que le test de sensibilité à l'optochine est suggéré comme diagnostic présomptif de S. pneumoniae. Ceci n'était pas valable pour H. influenzae. Le résultat positif avec S. pneumoniae présa_geait qu'il pourrait s'agir de cette bactérie. Néanmoins un test complémentaire s'imposait.

IV.4-La réaction d'agglutination au latex

La formation d'agrégats avec les antigènes solubles provenant des échantillons, a permis de confirmer l'identification à savoir, _qu'il s'a_gissait de S. pneumoniae dans 5 cas et H. influenzae dans 1 cas.

IV. 5-Antibiogramme et CMI

Chaque germe isolé et bien identifié a été soumis à un antibiogramme.

Les résultats de l'antibiogramme nous ont montré qu'il y a un spectre de sensibilité et de résistance, d'intermédiaire, pour chacune des souches identifiées.

Pour des exigences de recherche, la détermination de la CMI nous a été demandée même si le les souches étaient sensibles aux antibiotiques, tel le cas de S. pneumoniae.

Mais en pratique courante, la CMI n'est effectuée que si la souche est résistante à tous les antibiotiques testée. En ce moment un seul antibiotique est choisi pour la réalisation, en collaboration avec le médecin afin de tenir compte des éventuels aller_gies aux antibioti_ques, de connaître (malade hospitalisé, malade en ambulatoire, femme enceinte....). Le choix de l'antibioti_que doit se faire en tenant aussi compte du mode d'administration, de l'âge et du coût.

Le résultat de la CMI est donné au médecin sur une fiche d'antibio_gramme en y inscrivant la concentration minimale.

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Le médecin fera la prescription en tenant compte de la concentration indi_quée, _qui est la plus petite _quantité d'antibioti_que capable d'inhiber la croissance des bactéries.

Une étude a été menée au MALI par MARIKO en 2005 [10], _qui a montré une sensibilité de S. pneumoniae de 97% à la pénicilline G et une résistance de 3%, une sensibilité de 92% au Ceftriaxone et une résistance de 8% , une sensibilité de 94% au Chloramphénicol et une résistance de 6% , et enfin une sensibilité de 87% à l'érythromycine et une résistance 13%. Notre étude a utilisé des antibiotiques différents (clindamycine, tétracycline, amoxicilline+acide clavulani_que, sulfamide+triméthoprime) à l'exception de l'érythromycine et du chloramphénicol. Cin_q souches de S. pneumoniae étaient résistantes à 100% à l'érythromycine, 4 étaient résistantes à la tétracycline, au chloramphénicol et à l'association sulfamide+triméthoprime soit 80% respectivement. Pour la même bactérie et des antibiotiques identiques, nous enregistrons un taux de résistance largement supérieur à celui observé au MALI (résistance au chloramphénicol 6% au MALI versus 80% au GABON, résistance à l'érythromycine 13% au MALI versus 100% au GABON).

Si l'on regarde les tableaux III à VII, la souche isolée chez le patient ONA (tableau III) ne devrait pas être soumis à une CMI, puisqu'il y avait des antibioti_ques pour les_quelles la souche demeurait sensible. Par contre les souches isolées des patients AYO, MAH, MAN et BOU étant totalement résistantes à tous les antibiotiques testés, nécessitaient une CMI.

Dans le cas de H. influenzae, nous nous sommes retrouvés en présence d'une souche _qui avait un profil résistant et intermédiaire (de sensibilité réduite). Dans ce cas aussi, une CMI s'impose.

L'étude menée à Antananarivo (Mada_gascar) par Razafindralambo en 2003 dans une en_quête sur les ménin_gites bactériennes lui a permis, de Juin 1998 à Juin 2000 de recueillir 27 souches de Haemophilus influenzae. Les antibiotiques testés furent la Triméthoprime-sulfaméthazole avec 74% de résistance, la Kanamycine avec 59% de résistance, la Tétracycline avec 52% de résistance, le Chloramphénicol avec 42% de résistance, l'érythromycine avec 26% de résistance, la Minocycline avec 23% de résistance, l'Amoxicilline avec 17% de résistance, la Gentamycine avec 15% de résistance, l'Amoxicilline+acide clavulani_que avec 4% de résistance et 11%

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d'intermédiaire, la rifampicine avec 7% de résistance, le Céfotaxime et péfloxacine 0% de résistance. Cette étude diffère de la nôtre sur plusieurs antibiotiques sauf l'amoxicilline+acide clavulanique, avec un taux de résistance inférieur au notre (4% versus 100%).

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On enre_gistre un taux important de résistance aux antibioti_ques des souches de S.pneumoniae et H.influenzae. Cependant, ceci reste à confirmer avec un échantillonnage plus élargi.

Cette étude constitue une étape préliminaire à la mise au point de le technique de la CMI, dont l'importance est capitale chez un patient hébergeant une souche multirésistante aux antibiotiques.

Il est d'autre part le point de départ de la surveillance de la résistance de ces germes aux antibiotiques qui à la longue sera un outil disponible chez les praticiens en cas d'infections graves nécessitant la mise en place d'une antibiothérapie probabiliste en attendant le résultat du laboratoire.

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1- www.santetropicale.com

2- Précis de Bactériologie clinique 2^ed, J. FRENEY , François RENAUD EKSKA 2007

3- http://fr.wikipedia.ogr/wiki/streptococcus_pneumoniae

₂e d

4- Bactériologie Médicale C. NAUCIEL J-L VILDE, 2005 MASSON

5- www.cbm25.fr/mageslip/analyses/13-en_savoir_plus.pdf

6- Groupe Rémic de la société française M B

7- www.microbes-edu.org/étudiant/haemophilus.html 8- http://fr.wikipedia.org/wiki/haemophilus_influenzae 9- http://menbres.lycos.fr/jolan/muco/clinique.htlm

10- « Caractères bactériologiques et place de Streptococcus pneumoniae dans les infections bactériennes invasives chez les enfants hospitalisés dans le service de pédiatrie de l'hôpital Gabriel TOURE », thèse de pharmacie soutenue par Mariko RAMATA au MALI en 2005.

11- www.medix.free.fr/sim/evolution-dissemination-bactérienne.php

12- De l'antibiogramme à la prescription F. JEHL M.CHOMARAT A. GERARD édition BIOMERIEUX

13- Antibiotiques, agents bactériens et antifongiques A.BRYSKIER Ellipse

14- www.informationhospitalière.com/dico-66-streptococcus-pneumoniae.htlm

15- www.microbes-edu.org

16- www.medec.com/meditline/review/bruluures/vol_1/num_3/ text%5cvol1n³p141.asp

17- L'ANTIBIOGRAMME, COURVALIN P, GOLDSTEIN F. MPC, VIDEON e d Paris 1985

18- www.microbelibrairy.org/etudiant/streptococcus.html

19- A.Gravet et al « Evolution de la sensibilité de S.pneumoniae aux Antibiotiques, 2005 »

20-Manual for laboratory identification and antimicrobial susceptibility Testing of bacterial pathogens of public health importance in the Developing world. World Health Organization.

REPUBLIQUE GABONAISE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

DE LA RECHERCHE ET DE L'INNOVATION TECHNOLOGIQUE

UNIVERSITE DES SCIENCES DE LA SANTE

FACULTE DE MEDECINE

Charte Internationale

Nous technologistes biomédicaux, appartenant au corps des biotechnologistes, chargés:

- de l'exécution des analyses de biologie médicale, du contrôle de leur qualité et le cas échéant de leur mise au point ;

- de la maintenance de l'appareillage ;

- du prélèvement et du recueil de matériel et liquides organiques ;

- de la réalisation technique d'épreuves fonctionnelles ou d'actes liés à la procréation assistée.

Nous engageons à :

- respecter la législation en vigueur concernant le mode d'exercice, les conditions particulières imposées pour la direction d'un laboratoire ;

- maintenir la compétence qu'exigent les standards de qualité d'obligation d'une formation initiale spécifique actualisée, et d'une formation complémentaire pour toute adaptation à une technologie nouvelle ;

- appliquer et faire appliquer les règles d'une bonne exécution des analyses garantissant leur fiabilité ;

- mettre en commun les connaissances et l'expérience acquise pour une amélioration des techniques ;

- aider à la formation et à la promotion du personnel moins qualifié ;

- assurer ou faire assurer l'application des règles minimales d'hygiène et de sécurité ;

- respecter le code de déontologie et contribuer à la reconnaissance et à la promotion de notre profession.

REPUBLIQUE GABONAISE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

DE LA RECHERCHE ET DE L'INNOVATION TECHNOLOGIQUE

UNIVERSITE DES SCIENCES DE LA SANTE

FACULTE DE MEDECINE

Code de déontologie

*Bien que conscient du rôle qu'il joue dans le diagnostic médical et de sa responsabilité dans la réalisation technique des actes de biologie, le technologiste biomédical doit s'abstenir de toute clinique, dans ses relations avec les patients ou les cliniciens. A titre exceptionnel et pour des raisons motivées par l'urgence du diagnostic et la gravité de la pathologie, il pourra enfreindre cette règle après délégation des autorités médicales compétentes et une formation sanitaire complémentaire, notamment lorsqu'une situation économique, géographique ou naturelle particulière crée un contexte sanitaire critique.

* Le technologiste biomédical est tenu au secret professionnel, dans les mêmes conditions que tout autre membre de la chaîne de santé et ne peut en être relevé que dans les conditions légales en vigueur dans son pays.

* Dans l'exercice de sa profession, le technologiste biomédical doit tenir compte des limites de sa compétence et des moyens mis à sa disposition avant d'accepter la charge d'une fonction.

* Le technologiste biomédical ne doit en aucun cas modifier ou accepter de modifier les résultats des examens qui lui sont confiés.

* Il doit également assurer tous les contrôles indispensables à la fiabilité des résultats.

* Le technologiste biomédicale ne contribuera pas sciemment à des travaux dont l'objectif irait à l'encontre de la préservation de la santé et de la qualité de la vie de l'homme ou des recommandations des Comités d'Ethique.

* Le technologiste biomédical doit contribuer dans la mesure de ses possibilités au perfectionnement des techniques utilisées.

* Il doit également prendre une part active à l'évolution de sa profession par l'intermédiaire d'échanges avec ses collègues nationaux et internationaux et doit, en fonction des moyens qui lui sont offerts, participer à des actions de formations ou d'informations professionnelles.