II.1-Type d'étude
La présente étude de type transversale a
été réalisée de juin 2008 à Juin
2009.
II.2-Lieu d'étude
Les prélèvements ont été
effectués dans les différents hôpitaux et cliniques de
Libreville notamment : l'Hôpital Régional de Melen, le Centre
Hospitalier de Libreville, l'Hôpital d'Instruction des Armés Omar
Bongo Ondimba, l'Hôpital Pédiatrique d'Owendo et la clinique
EDZANG ; puis acheminés au Département de Microbiologie de la
Faculté de Médecine de l'Université des Sciences de la
Santé.
II.3-Patients
La population d'étude a été
constituée de 150 enfants et adultes, tous sexes confondus, sur lesquels
on a effectué les prélèvements du nasopharynx et de
l'oreille au cours d'une épidémie de grippe.
II.3.1-Critères d'inclusions
Les critères d'inclusions ont
été : les enfants et adultes présentant un syndrome
grippal, une rhinopharyngite, de la toux avec ou sans fièvre lors des
consultations.
II.3.2-Critères d'exclusions
Tous les patients ne présentant pas les
symptômes énoncés dans les critères
d'inclusions.
II.4-Matériel
- Gants stériles
- 4 à 5 écouvillons par
patients
- 2 jarres d'anaérobie
conditionnées
- 1 bougie
- Des allumettes
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Surveillance de la résistance aux antibiotiques
de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
- Géloses chocolat polyvitex
- Géloses au sang préparées
à base de Trypcase soja + 5% de sang de mouton
- Pinces stériles
- Oses stériles de 1u, 10uL
- Glacière
- Etuves à 35-37°C
- Test à l'optochine
- Réaction d'agglutination : Slidex
méningites Kit ou Pastorex Kit
II. 5-Méthodes
II. 5.1-Enregistrements
Les données démographiques des patients
ont été enregistrées sur un formulaire (voir
annexe).
II. 5.2- Prélèvements
nasopharyngés et d'oreille
Ils ont été effectués par
écouvillonnages du nez ou de la gorge à l'aide d'un
écouvillon stérile. A cet effet, 4 écouvillons ont
été utilisés en effectuant des rotations.
En cas d'otite purulent, le prélèvement
a été effectué au niveau du conduit
auditif externe par le médecin ORL en utilisant 2
écouvillons.
II. 5.3-Analyses bactériologiques des
prélèvements
· Etape 1 : Ensemencement des milieux de
cultures
Premier jour
Sitôt le prélèvement
effectué, une boite de gélose a été
ensemencée par la technique des stries avec l'écouvillon
contenant les sécrétions nasales, pharyngées ou
de l'oreille.
MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59
présenté par ONDENOT Yann Christian
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Surveillance de la résistance aux antibiotiques
de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
La gélose à
été ensuite placée dans une jarre anaérobie. Les
prélèvements ainsi ensemencés sont transportés au
laboratoire et la jarre mise dans une étuve à 37 °C pendant
24 heures.
· Etape 2 : Examen des géloses
Deuxième jour
Après 24 heures, la jarre a été
sortie et les géloses examinées. L'examen des colonies s'est fait
devant la flamme du bec Bensen. La taille, l'aspect, la couleur et le type
d'hémolyse, ont été notés sur un
registre.
· Etape 3 : Réalisation du
frottis
Pour réaliser un frottis on a :
- émulsionné une colonie dans une
goutte d'eau distillée stérile à l'aide d'une pipette
Pasteur, sur une lame.
- séché la lame à l'air, non
loin de la flamme du bec Bensen.
- passé rapidement la lame à la flamme
trois fois pour fixer le frottis.
· Etape 4 : Coloration de Gram
C'est un examen qui a pour but de
déterminer la forme des bactéries, ainsi que leur coloration au
Gram, en vue de l'identification du germe.
Pour cela il faut :
- Recouvrir entièrement la lame d'une solution
de Violet cristal pendant 1 minute et rincer à l'eau du
robinet.
- Recouvrir ensuite d'une solution de
lugol pendant 1 minute et rincer à l'eau du
robinet.
- Décolorer la lame par de
l'alcool-acétone pendant 15 secondes, et rincer à l'eau du
robinet.
- Recouvrir la lame d'une solution de safranine
pendant 1 minute et rincer à l'eau du robinet.
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présenté par ONDENOT Yann Christian
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Surveillance de la résistance aux antibiotiques
de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
- Sécher la lame.
- Noter la présence, la morphologie et coloration
des bactéries.
· Etape 5 : Tests
complémentaires
- Test de sensibilité à
l'optochine
La sensibilité de Streptococcus
pneumoniae à l'optochine s'est faite en touchant une
colonie suspecte alpha-hémolytique avec la boucle d'une
pipette Pasteur. Cette colonie a été ensuite ensemencée en
stries serrées sur gélose au sang.
Un disque à l'optochine de 6 mm de
diamètre est déposé sur la gélose, de
préférence aux extrémités.
La gélose a été incubée
18 à 24 heures à 37°C dans une jarre anaérobie puis
l'étuve.
- Réaction d'agglutination (trousse Slidex
méningite kit R5 de Bio Mérieux).
Ce test permet le diagnostic de certitude de
S. pneumoniae et H. influenzae.
Principe
Le principe de cette réaction est basé
sur la capacité des antigènes solubles de S
.pneumoniae ou de H. influenzae,
contenus dans l'échantillon à former des
agrégats avec les particules de latex
sensibilisées avec des anticorps spécifiques.
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Surveillance de la résistance aux antibiotiques
de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
Mode opératoire
Cette technique s'effectue, suite à un
résultat positif à l'optochine, ainsi :
- une à deux colonies bactériennes ont
été placées dans un tube à essai, contenant de
l'eau distillée stérile puis émulsionnées
jusqu'à obtenir une couleur blanche laiteuse.
- la préparation centrifugée pendant 10
minutes à 2000t /min et le surnageant
récupéré.
- sur une carte aux emplacements prévus
à cet effet, on a placé 1 goutte de chacune des
suspensions homogènes de latex, puis respectivement
30uL de surnageant.
- le contenu de chaque cercle a été
mélangé, en utilisant toute la surface, à l'aide d'un
bâtonnet (utiliser une extrémité propre de bâtonnet
pour chaque cercle).
- on a imprimé à la carte un
léger mouvement de rotation, puis on a vérifié
régulièrement l'apparition d'une agglutination.
· Etape 6 : Antibiogramme Pour effectué
l'antibiogramme:
Des géloses chocolat poly Vitex
pour H. influenzae et gélose
Mueller Hinton additionnée de sang de mouton pour S.
pneumoniae on été coulées en boîte de
Pétri sur une épaisseur de 4 mm. Les géloses ont ensuite
été séchées avant l'emploi.
Dans un tube à hémolyse contenant de
l'eau distillée stérile, une à deux colonies ont
été émulsionnées pour obtenir une turbidité
comparable à celle du Mac Ferland 0.5.
Un écouvillon stérile a
été trempé dans la préparation, ensemencé
sur gélose par la technique des stries serrées. La gélose
été placée à l'étuve à 37°C
pendant 15 minutes.
Après les 15 minutes, des disques
d'antibiotiques ont été déposés à l'aide
d'une pince flambée en prenant soin de les espacer de 24 mm.
La gélose a été laissée
à température ambiante pendant 30 mm avant de la mettre à
l'étuve à 37°C pendant 24 h.
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présenté par ONDENOT Yann Christian
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MENES-USS-FM-DBV Mémoire n°2 59
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Surveillance de la résistance aux antibiotiques
de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
La lecture s'est faite à l'aide d'un pied
à coulisse en mesurant avec précision les diamètres des
zones d'inhibition sur la base de la boite de gélose
retournée et maintenue fermée.
Les résultats ont été
comparés aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture. Les
bactéries ont été classées dans l'une des
catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistant à
l'antibiotique.
· Etape 7 : Détermination de la
Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
La CMI est une technique de laboratoire
qui est réalisé en cas de résistance des
bactéries aux antibiotiques. Pour cela:
Dans un tube à hémolyse contenant de
l'eau distillée stérile, une à deux colonies ont
été émulsionnées pour obtenir une turbidité
comparable à celle du Mac Ferland 0.5.
Un écouvillon stérile a
été trempé dans la préparation, ensemencée
sur gélose chocolat poly Vitex pour H. influenzae
et gélose Mueller Hinton additionné de 5% sang de
mouton pour S. pneumoniae par la technique des stries
serrées.
La gélose a été placée
l'étuve à 37°C pendant 15minutes.
Après les 15 minutes, 2 languettes
d'antibiotiques ont été déposées en sens
opposé à l'aide d'une pince flambé.
Les boites ont été laissées
à température ambiante pendant 30 minutes avant de la mettre
à l'étuve à 37°C pendant 24 heures.
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La lecture de la CMI de l'antibiotique a
été faite au point d'intersection de l'ellipse d'inhibition et de
la bandelette après 24 h.
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de Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae
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