Memoire Online - Optimisation de la dose d'irradiation dans le cadre d'un projet de lutte contre la Ceratitis Capitata

I.1. Les étapes de l'élevage massif de la souche à sexage génétique de la Cératite:

Le système d'élevage au filtre adopté par l'unité pilote de Sidi Thabet représente la solution pour éviter l'accumulation des individus recombinants et assurer leur élimination. L'élevage au niveau du filtre se fait dans un seul sens, aucun insecte ne revient au filtre et la colonie au niveau du filtre est appelée "colonie mère".

La 1ère étape de l'amplification est appelée colonie d'initiation, elle aura pour rôle d'amplifier la colonie mère et donc d'initier le filtre. La 2ème étape de l'amplification est appelée colonie d'injection qui va alimenter les colonies de production. La dernière étape est la colonie de lâcher dont les oeufs seront traités par la chaleur. Cette colonie va donner seulement des mâles pour le lâcher.

Dans le filtre, le recyclage de la colonie a lieu seulement au niveau de la colonie mère. Cette dernière doit donc être maintenue sous des conditions minimales de stress pour éviter au maximum l'accumulation des recombinants.

Le système d'élevage du filtre comprend les différentes étapes de l'élevage en masse mais sur un modèle plus réduit ; ces dernières sont effectuées dans des salles où les conditions sont bien respectées.

La 1ère tâche débute par la séparation des pupes mâles brunes des pupes femelles blanches et choisir celles de bonne qualité et de bon calibre (Figure 8).

Ces pupes sont mises dans des alvéoles avec un volume bien déterminé (150 ml pupes femelles et 50 ml pupes mâles) jusqu'à émergence, sous une température de 24 °C et une humidité relative de 75%.

Après émergence, les recombinants qui sont soit des femelles issues des pupes brunes, soit des mâles issus des pupes blanches sont éliminés. L'élimination concerne aussi les pupes non émergées, demi émergées et les adultes déformées.

Les adultes restants sont vidés dans une cage avec un rapport de 1:1 (un mâle pour une femelle), tout en évitant le stress au cours de l'élevage. Chaque cage présente une source de nourriture avec les proportions suivantes : 2/3 sucre et 1/3 levure hydrolysée. La cage est ensuite mise dans la chambre d'élevage à une température de 24 °C et une HR de 75 %. Dans ces conditions, les femelles sont excitées et la ponte est favorisée. Pour récupérer les oeufs, deux bacs en inox, remplis d'eau, sont placés de part et d'autre de la cage (Figure 10).

Les oeufs collectés sont ensemencés sur un milieu d'élevage bien déterminé. Après éclosion et arrivant au stade L3, les larves effectuent leur saut larvaire caractéristique, dans la sciure de bois où se fait la pupaison à une température de 20-22 °C et HR 70%.

L'unité pilote d'élevage de la cératite présente un travail cyclique qui se déroule dans plusieurs salles, chaque salle est caractérisée par des conditions spécifiques de température et d'humidité relative. Ces conditions sont citées dans le tableau qui suit :

Salle	Température (°C)	Humidité relative (%)
Contrôle de qualité	24	70
Initiation - Lâcher + injection - Mâle	22 à 25 28 à 30	70
Larves	17	75
Pupes	20 à 22	70

Tableau 10: Conditions de température et d'humidité dans la salle d'élevage [15]

Type de milieu	Composition
Son de blé	28%
Sucre	12%
Levure Torula	7%
Benzoate de sodium	0.2%
HCL	1%
Eau	50%

La quantité du milieu à préparer pour chaque colonie est déterminée selon la formule suivante :

Les ingrédients du milieu sont pesés en respectant les pourcentages indiqués dans le tableau et mélangés dans le malaxeur. Après malaxage, vérification de la texture du milieu ; la valeur admise du pH varie entre 3.2 et 3.8.

Une vis sans fin assure l'entraînement du milieu vers la salle d'ensemencement, où il sera réparti à raison de 5 kg / plateau.

Ce type de milieu est utilisé pour la première fois en Tunisie, et pour tester son efficacité, une comparaison avec le milieu standard s'avère nécessaire :

Type de milieu	Composition
Levure de brasseur	15.06%
Sucre	8.99%
Benzoate de sodium	0.15%
Nipagine	0.15%
Acide Citrique	1.70%
Huile de germe de blé	0.15%
Eau	73.81%

En effet le prototype expérimental envoyé du Département de l'agriculture des Etats Unies l'USDA-ARS était composé de : un récipient plastique, une bouteille de germe de blé, une sachet de sucre, une sachet d'acide citrique, un mélange de levure et de produit chimique et de deux éponges.

a.Récipient plastique b.Filet en plastique c.Germe de blé d.Sucre e.A.citrique f.Levure et Nipagine g et h. Deux éponges

Après avoir mélangé tous les composants ensemble et avant de verser le milieu dans le récipient, un ajustement de l'acidité avec quelques goûtes d'acide chlorhydrique doit être fait pour atteindre un pH de 3,5 (Figure 14) optimal pour le développement des larves.

Par la suite, le mélange est versé dans le récipient et une quantité de 1 ml d'oeufs sera ensemencée sur la petite éponge supérieure où les oeufs se développeront après éclosion (Figure 15).

Parallèlement, et pour pouvoir juger l'efficacité de ce milieu liquide, un milieu témoin avec les composants standards est préparé et ensemencé par la même quantité des oeufs (Figure 16).

Trois répétitions de chaque type de milieu ont été réalisées ; ces essais seront par la suite incubés dans une étuve à 23°C pendant 6 jours pour le développement des trois stades larvaires. Vers le septième jour ces milieux sont déplacés vers la salle de collecte des larves où ces derniers effectueront le saut larvaire dans la sciure de bois.

Les pupes issues de ces deux milieux vont subir certains tests de contrôle de qualité afin de pouvoir affirmer le plus performant des deux, les tests subis sont :

C'est un test qui permet de déterminer le rapport entre le nombre des mâles et celui des femelles. Un volume de 2 ml de pupes est pris afin de compter le nombre de pupes de chaque sexe et déterminer la sexe ratio selon la formule suivante :

L'aptitude au vol est un paramètre très important dans l'étude de l'activité de la souche. Ce test consiste à contrôler la capacité des adultes de voler.

On effectue trois répétitions, chaque répétition consiste à mettre 100 pupes (T) de chaque sexe dans un cylindre noir qui contient du papier filtre noir avec du papier en

accordéon afin d'accorder aux mouches de l'espace pour se déployer les ailes. On met du talque sur le contour du cylindre. Les cylindres sont mis dans une cage d'aptitude au vol (T°= 25°C et HR= 60%) et les mouches émergées étant régulièrement aspirées.

La lecture des résultats se fait après 72 heures. On compte le nombre des adultes non émergés (A), demi émergés (B), déformés (C) et émergés non effectuant le vol (D) puis on fait la moyenne des trois répétitions.

Ce test consiste à calculer le pourcentage d'émergence des adultes pour contrôler leur capacité d'émergence lors du lâcher dans la nature.

La procédure de ce test est la même que celle utilisée pour le test d'aptitude au vol sauf qu'on compte seulement le nombre des adultes non émergés (A) et demi émergés (B).

Ce test est utilisé pour la détermination de la qualité des mouches destinées au lâcher. Il consiste à faire trois prélèvements de 2 ml chacun, on compte le nombre des pupes et on les pèse à l'aide de la balance de précision. On calcule le poids d'une pupe et le poids moyen des trois prélèvements. On dégage ainsi le nombre moyen des pupes par millilitre.

Les adultes de la mouche des fruits sont logés dans des cages rectangulaires de cadre métallique avec quatre faces revêtues de moustiquaires.

Les cages sont gardées durant une quinzaine de jours à une température de 23°C #177;1 et à une humidité relative de 70%. La lumière est fournie par un tube fluorescent fixé au plafond ou à proximité des cages. L'eau est introduite par l'intermédiaire des éponges imbibées d'eau par capillarité. Pour l'alimentation des adultes, un mélange de sucre et de levure hydrolysée « yeast hydrolysat enzymatic » à raison de 3/1 est placé à l'intérieur de la cage.

Figure 18. Les cages d'émergence, de maturation et de copulation des mouches

Une fois matures, les femelles s'accouplent avec les mâles et pondent leurs oeufs à travers les mailles des cages.

Les oeufs pondus tombent sous l'effet de la pesanteur dans des bacs remplis d'eau placés sur les côtés de chaque cage et sont collectés et comptés d'une façon volumétrique quotidiennement.

Les suspensions d'oeufs sont incubées sous agitation permanente, dans le "bubbling", à température ambiante (environ 25 °C) pendant 48 heures pour les colonies Injection et Lâcher.

Une partie des oeufs collectés est destinée au lâcher. Ces oeufs subissent un traitement thermique par la mise dans un bain marie réglé à une température de 34 °C sous une agitation permanente pendant 24 heures, c'est la colonie Mâle. La température de la solution est réglée à 34°C pour assurer l'élimination des embryons femelles et par conséquent, il ne reste que les mâles.

II.1.3 Ensemencements des oeufs :

L'ensemencement des oeufs sur le milieu d'élevage est une opération journalière qui se fait pour toutes les colonies dans la salle d'ensemencement.

Les solutions d'oeufs sont récupérées dans une solution d'arrosage contenant du Benzoate de sodium, de l'acide HCL 32 % et de l'eau.

Le volume de la suspension des oeufs de chaque colonie est déterminé selon la formule

Pour chaque colonie, on indique la date d'ensemencement, le volume total et le nombre des plateaux ensemencés sur le haut des plateaux.

Juste après ensemencement, les transferts Injection et Lâcher sont placés dans la salle d'initiation femelle à une température de 23 #177; 1°C et une HR de 70 #177; 10%.

Les transferts mâles sont placés dans la salle d'initiation mâle, réglée à une température de 28 #177; 1°C et d'une humidité relative de 70 #177; 10%. Cette température permet la dégénérescence des embryons femelles qui peuvent résister au traitement thermique. La durée de séjour des plateaux (transfert) dans la salle d'initiation est de trois jours.

Les transferts seront par la suite déplacés vers la salle de maturation où les larves auront accompli leur 1^er et 2^ème stade larvaire. La température est de 21 #177; 2°C et l'humidité relative est de 70 #177;10 % pendant trois jours jusqu'au stade larvaire L3.

Une fois le 3^ème stade larvaire est accompli, les plateaux seront déplacés vers la salle de collecte. Les larves L3 quittent le milieu en accomplissant leur saut caractéristique dans des bacs remplis de sciure de bois.

La collecte des pupes se fait par simple séparation de la sciure de bois soit par un tamis électrique soit manuellement. Les pupes ainsi collectées sont mises dans des plateaux dont le fonds est constitué de filet de très fines mailles afin de favoriser l'aération des pupes.

Figure 23. Collecte des pupes dans la sciure de bois et leur tamisage par la suite

La préparation des cages d'élevage est une opération journalière. Tous les jours,

l'opérateur doit préparer au minimum quatre cages : une pour l'injection, une pour le lâcher et
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deux pour la colonie des mâles. Ces cages vont remplacer celles qui ont achevé leur période de ponte (environ 10 jours).

Les pupes des différentes collectes des transferts matures sont identifiées en prenant 100 pupes de chaque collecte et en notant la couleur des yeux de chaque pupe. Le pourcentage de couleur des yeux doit être noté : les pupes sont considérées matures lorsqu'on trouve 75 % de couleur marron foncé.

On établit le ratio Mâles/femelles pour chaque collecte choisie et on calcule le volume nécessaire de chaque transfert pour le chargement d'une cage (1.5 l de pupes mâles et 1.5 l de pupes femelles),

La nourriture est préparée à raison de 2/3 sucre et 1/3 levures hydrolysées et sera répartie entre les cages.

On met de « chamex » dans les endroits réservés dans les abreuvoirs et remplit les tubes avec de l'eau. Chaque plateau contenant les pupes, les abreuvoirs d'eau et la nourriture doit être identifié par un numéro, la date de chargement et la colonie.

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DEUXIEME PARTIE

- CHAPITRE 6 -

Matériels et méthodes

II.1.3 Ensemencements des oeufs :