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REPUBLIQUE DU CAMEROUN
Paix
-Travail-Patrie
********
UNIVERSITE DE DSCHANG
FACULTE DES SCIENCES
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REPUBLIC OF CAMEROON Peace-work-fatherland
***********
UNIVERSITY OF DSCHANG
FACULTY OF SCIENCE
|
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY
UNITE DE FORMATION DOCTORALE DES SCIENCES FONDAMENTALES
ET TECHNOLOGIQUES
UNITE DE PARASITOLOGIE ET D'ENTOMOLOGIE MOLECULAIRE
DU
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
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CARACTERISATION GENETIQUE DE Glossina pallicera
pallicera CIRCULANT DANS LE FOYER DE LA MALADIE DU SOMMEIL DE CAMPO DU SUD
FORESTIER CAMEROUNAIS
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THESE
Rédigée et présentée pour
l'obtention du diplôme de Master of Science
(M.Sc) en Biochimie
Option : Biochimie Clinique
Par
GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris
Licencié-ès Science en Biochmie
Matricule : CM04-09SCI1597
Sous la Direction de :
Dr SIMO Gustave
Décembre 2015
Chargé de Cours
|
REPUBLIQUE DU CAMEROUN
Paix
-Travail-Patrie
********
UNIVERSITE DE DSCHANG
FACULTE DES SCIENCES
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REPUBLIC OF CAMEROON Peace-work-fatherland
***********
UNIVERSITY OF DSCHANG
FACULTY OF SCIENCE
|
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY
ATTESTATION DE CORRECTION
THESE DE MASTER OF SCIENCE (M.Sc) EN BIOCHIMIE
DE M. GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris
Je soussigné, Pr. TUME Christopher,
Président du jury de thèse de Master de GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris, certifie que la thèse de Master of Science
présentée publiquement le 02 février 2016 à
Université de Dschang, par GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris
pour l'obtention du diplôme de Master of Science
(M.Sc) en Biochimie, option Biochimie Clinique intitulé
« Caractérisation génétique de Glossina pallicera
pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de Campo du Sud
forestier camerounais » a été corrigée selon les
recommandations des membranes de jury.
En foi de quoi la présente attestation est
délivrée pour servir et valoir ce que de droit.
Fait à Dschang le .
Le PRESIDENT DU JURY L'EXAMINATEUR
Pr. TUME Christophe Pr. GATSING Donatien
Le RAPPORTEUR
Dr. SIMO Gustave
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
FICHE DE CERTIFICATION DE L'ORIGINALITE DU
TRAVAIL
Je soussigné, GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel
Boris, matricule CM04-09SCI1597, atteste que la présente
thèse est le fruit de mes propres recherches effectuées à
l'Unité de Parasitologie et d'Entomologie Moléculaire du
Département de Biochimie de la Faculté des Sciences de
l'Université de Dschang en collaboration avec le Laboratoire de
Biochimie, d'immunologie et de Biotechnologie de la Faculté de
Médecine et des Science Biomédicales de l'Université de
Yaoundé I et le laboratoire de biologie moléculaire de la
Faculté des Sciences de l'Université de Yaoundé I, sous la
direction de Dr. SIMO Gustave.
Cette thèse est authentique et n'a été
antérieurement présentée pour l'acquisition de quelque
grade universitaire que ce soit.
Visa de l'auteur
Date
GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris
Visa du directeur
Date
II
Dr. SIMO Gustave
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
DEDICACE
III
Je dédie ce travail à mes parents papa
Djoumsié Pierre et maman Nzogang Christine
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
REMERCIEMENTS
Avant toute chose, je rends gloire à DIEU
qui m'a aimé et m'a aidé à mener ses travaux
jusqu'à la fin.
Je ne saurais commencer sans remercier « l'European
Foundation Initiative for Negleted Tropical Disease » (EFINTD), «
l'Appui Intégré pour le Renforcement des Equipes Scientifiques du
Sud » (AIRES-SUD) et UMR177 IRD-CIRAD, pour leurs appuis
financiés
et le laboratoire de biologie moléculaire de la
Faculté des Sciences de l'Université de Yaoundé I et le
Laboratoire de Biochimie, d'immunologie et de Biotechnologie de la
Faculté de Médecine et des Science Biomédicales de
l'Université de Yaoundé I, qui m'ont offert un cadre idéal
pour la réalisation de ce travail.
Mes remerciements s'adressent aux:
+ Dr. Simo Gustave, qui m'a donné
l'occasion de réaliser les travaux de recherche dans le domaine de la
biologie moléculaire. Vos critiques non seulement dans la
compréhension des manipulations mais aussi dans la rédaction de
ce mémoire m'ont permis de vaincre plusieurs difficultés. Je
saisis cette occasion pour vous adresser ma profonde reconnaissance ;
+ Pr. Njiokou Flobert qui m'a donné
cette opportunité d'exercer mes travaux de recherche au sein de son
laboratoire ;
+ Pr. Kuiate Jules- Roger, Chef de
département de Biochimie pour m'avoir autorisé à prendre
une inscription en Master II. Je saisis cette occasion pour vous adresser ma
profonde reconnaissance ;
+ Mr. Melachio Tanekou Trésor Tito, le
principal mentor de ce travail, pour sa disponibilité, ses
encouragements et ses apports techniques qui m'ont permis de comprendre
l'utilisation des différents logiciels. Je ne saurais jamais vous
remercier assez ;
+ Enseignants du département de
biochimie pour leur encadrement et pour les énormes sacrifices fait pour
notre formation académique. Il s'agit de : Pr. Gatsing Donatien,
Pr. Kuete Victor, Pr. Telefo Phelix, Pr. Tume Christopher, Pr. Womeni Hilaire,
Pr. Zambou Ngoufack François Dr. Agbor Esther, Dr. Biapa
Prospère, Dr. Kaktcham Pierre Marie, Dr. Kengne Anne Pascale, Dr. Klang
Julie, Dr. Kouitcheu Laure, Dr. Kuate Dieudonné, Dr. Mbaveng Armelle,
Dr. Ngoh Newilah Gérard, Dr. Njateng Guy Sedar Senghor, Mme Goka
Stéphanie, Mr. Innocent Mbulli Ali ;
+ Ainés de laboratoire pour leurs
conseils et leurs soutiens techniques. Il s'agit de : Mme Tchouomene
Labou Judith, Mr. Fogué Soubgwi Pythagore, Mme Kame Ginette, Mr.
Noubouossie Sylvain, Mr. Tiofack Zebaze Arnol, Mr. Kanté Sartrien, et
Mr. Ofon Elvis Amih;
iv
+ Camarades de promotion pour leur encouragement.
+ Amis pour l'organisation et le travail en groupe. Il s'agit
de : Natheu Kamhoua Cerge, Marbou Takougoum Wiliane, Wam Elvis Chongsi
et Temgoua Jules;
+ Mr. Kenfack Michel et Mme Fouafack
Fernande pour leur accueil chaleureux et leur encadrement qui m'ont
aidé a surmonté mes difficultés durant mon séjour
dans la ville de Yaoundé ;
+ Frères et soeurs Tsafack Tsanang Henri,
Kouakam Hugues, Tekoudjou Jule-Fleury, Ngouomo-Guy Aurélien, Mekengmo
Irène, Kengni Darine, Messop Zita et Fomo Dorinette pour leurs
soutiens moraux ;
+ Tantes Noubouossie Thérèse, Kouguem
Clotilde pour leurs soutiens moraux et financiers ;
+ Tous ceux qui de près ou de loin, ont
contribué d'une manière ou d'une autre à la
réalisation de ce travail. Merci infiniment.
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
V
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
TABLE DES MATIERES
ATTESTATION DE CORRECTION i
FICHE DE CERTIFICATION DE L'ORIGINALITE DU TRAVAIL
ii
DEDICACE iii
REMERCIEMENTS iv
TABLE DES MATIERES vi
LISTE DES FIGURES viii
LISTE DES TABLEAUX ix
LISTE DES ABREVIATIONS x
RESUME xi
ABSTRACT xii
INTRODUCTION 1
I. REVUE DE LA LITTERATURE 3
I.1. Les trypanosomoses animales africaines 3
I.2. Historique de la trypanosomose animale africaine (nagana)
3
I.3. La Trypanosomiase humaine africaine 4
I.4. Historique de la THA 4
I.5. Répartition géographique des trypanosomoses
africaines 5
I.6. Les parasites responsables des trypanosomoses africaines
7
I.7. Vecteurs 8
I.7.1. Histoire des glossines 9
I.7.2. Taxonomie 9
I.8. Biologie du vecteur 11
I.8.1. Morphologie 11
I.8.2. Cycle de vie 12
I.8.3. Comportement nutritionnel des glossines 13
I.8.4. Ecologie de la glossine 14
I.8.5. Distribution géographique des mouches
tsétsé 14
I.9. Lutte contre les trypanosomoses 16
I.10. Génétique des populations 18
vi
I.10.1. Principe fondamental de la génétique des
populations 19
I.10.2. Facteurs affectant la génétique des
populations 20
I.10.3. Les types de marqueurs moléculaires
utilisés dans la génétique des populations 21
II. MATERIEL ET METHODES 24
II.1. Site d'étude 24
II.2. Echantillonnage 25
II.3. Extraction de l'ADN 25
II.4. Analyses moléculaires 26
II.4.1. Principe de la PCR 26
II.4.2. Identification moléculaire de G. p. pallicera
27
II.4.2.1. Amplification des loci microsatellites des glossines
28
II.4.2.2. Séparation des produits amplifiés par
électrophorèse sur gel d'agarose 29
II.4.2.3. Séparation des allèles sur gel de
polyacrylamide 30
II.4.3. Analyse génétique des données 31
III. RESULTATS 33
III.1. PCR diagnostic des espèces de glossines 33
III.2. Sensibilité des différents marqueurs
microsatellites 33
III. 3. Polymorphisme des marqueurs utilisés 35
III.4. Analyses génétiques 39
III.4.1. Polymorphisme des marqueurs utilisés 39
III.4.2. L'hétérozygotie et le coefficient de
consanguinité 40
III.4.3. Différenciation génétique entre les
populations 45
IV. DISCUSSION 50
CONCLUSION 54
PERSPECTIVES 55
REFERENCES 56
ANNEXES 67
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
VII
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LISTE DES FIGURES
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|
Différents foyers de la THA au Cameroun
|
7
|
|
Classification des trypanosomes
|
8
|
|
classification des glossines
|
10
|
|
Représentation schématique d'une glossine
|
11
|
|
Vue ventrale des appareils génitaux mâle et femelle
des glossines
|
12
|
|
Cycle reproductif de la glossine
|
13
|
Figure 1 : Figure 2: Figure 3: Figure 4: Figure 5 :
Figure 6:
Figure 7 : Distribution des espèces de
glossines appartenant au groupe Fusca, Morsitans
et Palpalis en Afrique 15
Figure 8 : Carte du Foyer de la THA de Campo
(Institut National de Cartographie
Yaoundé. 24
Figure 9: Différentes étapes de la
PCR 27
Figure 10: Photo d'un gel d'agarose montrant les
produits d'amplification des ITS1 de
différentes espèces de glossines.
33
Figure 11: Exemple de photo montrant les profils des
bandes obtenues sur gel d'agarose et
illustrant les amplicons issus de l'amplification du locus 55.3.
35
Figure 12: Photo d'un gel de polyacrylamide montrant les
profils des allèles obtenus pour
|
chaque glossine et aux loci C102 et PGP24.
|
36
|
|
Nombre d'allèles en fonction des espèces de
glossines
|
40
|
|
Nombre d'allèles par locus
|
40
|
Figure 13: Figure 14:
Figure 15: Valeurs de la FIS en
fonction des loci et pour les populations de G. p. pallicera42
Figure 16: Les valeurs de la FIS en
fonction des loci et pour les populations de G. p.
palpalis 42
Figure 17 : Courbe de
régression des FIS en fonction des allèles nuls pour
G. p. palpalis
43
Figure 18 : Courbe de régression
des FIS en fonction des allèles nuls pour G. p. pallicera
43 Figure 19: Dendrogramme illustrant les
différences et les similarités génétiques entre
les espèces de glossines 46
Figure 20:
Dendrogramme illustrant les différences et les
similarités entre les populations
de glossines 47
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
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VIII
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Séquences et
températures d'hybridation des amorces utilisées pour le
génotypage 29
Tableau 2: Nombre de glossines
amplifiées en fonction des espèces et des loci
microsatellites. 34
Tableau 3: Nombre et pourcentage de G. p.
pallicera et G. p. palpalis amplifiés à
chaque locus microsatellite 35
Tableau 4 : Génotypes multilocus
obtenus pour chaque glossine analysée et pour les
cinq loci considérés. 37
Tableau 5: Hétérozygotie et les
valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p.
pallicera 41
Tableau 6: Hétérozygotie et les
valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p.
palpalis 41
Tableau 7 : Fréquence des
allèles nuls observés et attendus 44
Tableau 8: P-values du
déséquilibre de liaison entre paires de loci 45
Tableau 9: Variation de FST entre
les populations de différentes espèces. 48
Tableau 10 : Variation de FST entre
les sous populations de G. p. pallicera 48
Tableau 11 : Variation de FST entre
les sous populations de G. p. palpalis 49
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
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ix
Caractérisation génétique de Glossina
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LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : Acide désoxy-ribonucleique
AFLP: Amplied Fragment Lenght
Polymorphism
AIRES-SUD: Appui Intégré pour le
Renforcement des Equipes Scientifiques du Sud
BET: Bromure d'Ethidium
CIRAD : Centre de coopération
Internationale en Recherche Agronomique pour le
Développement
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
dNTP: Désoxyribonucléotide
5'-TriPhosphate
EDTA: Ethylène Diamine Tétra
Acétate
EFINTD: European Foundation Initiative for
Neglected Tropical Disease
FAO: Food and Agriculture Organisation
IRD: Institut de Recherche pour le
développement
MEGA: Molecular Evolutionnary Genetics
Analysis
MSA : MicroSatellite Analyzer
OMS : Organisation Mondiale de la
Santé
PCR: Polymerase Chain Reaction
RAPD: Randomly Amplified Polymorphic
DNA
SNP: Single-Nucleotide-Polymorphism
SSCP: Single-Stranded Conformational
Polymorphism
TAA: Trypanosomose Animale Africaine
Taq: Thermus aquaticcus
TBE: Tris-Borate-EDTA
TEMED: Tetramethylethylenediamine
THA: Trypanosomiase Humaine Africaine
TIS: Technique des insectes stériles
Tris : Tris
hydroxyméthyl-aminométhane
UV : Ultra-Violet
X
RESUME
Les Trypanosomiases humaines et animales africaines restent un
problème majeur de santé au Cameroun. Ces maladies sont
transmises par un vecteur appelé mouche tsétsé ou
glossine. Glossina pallicera pallicera est une des espèces les
plus répandue et responsable de la trypanosomose animale africaine (TAA)
dans le foyer de Campo. Toutefois, très peu d'informations sont
disponibles sur la biologie et la structure de ces populations de vecteurs.
Pour mieux appréhender la structure génétique des
populations de glossines du sud forestier camerounais, nous avons entrepris une
étude sur la caractérisation moléculaire de Glossina
pallicera pallicera du foyer de la Trypanosomiase Humaine Africaine (THA)
de Campo.
Pour y parvenir, des prospections entomologiques ont
été menées dans trois villages (Akak, Campo Beach et Rio
Campo) du foyer de THA de Campo. Au cours de ces prospections des glossines ont
été capturées à l'aide des pièges
pyramidaux. La méthode du CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) a
été utilisée pour extraire l'ADN des pattes des mouches
tsétsé et par la suite, neuf marqueurs microsatellites ont
été utilisés pour caractériser
génétiquement G. p. pallicera.
Dans cette étude, 72 mouches tsétsé
appartenant à 5 espèces différentes ont été
utilisées: 45 Glossina pallicera pallicera, 17 Glossina
palpalis palpalis, 4 Glossina submorsitans, 3 Glossina
caligenea, 2 Glossina nigrofusca et une Glossina
fuscipes. Parmi les neuf marqueurs microsatellites utilisés, quatre
d'entre eux n'ont pas été considérés pour les
études de génétique des populations parce que moins de 50%
des échantillons ont été amplifiés par ces
marqueurs. Pour les cinq marqueurs utilisés pour les analyses
génétiques, le taux d'amplification variait d'un marqueur
à l'autre: 91,11% pour 55.3 ; 97,77% pour PGP13 ; 97,77% pour GPCAG ;
95,55% pour C102 et 84,44% pour PGP24. Les cinq marqueurs microsatellites ont
montré plusieurs génotypes de G. p. pallicera circulant
dans les villages du foyer de la THA de Campo. Ces résultats indiquent
des polymorphismes génétiques au sein des populations de G. p
.pallicera du même village et des différents villages. Nos
résultats ont révélé un déficit en
hétérozygote non significatif (FIS (indice de fixation
des individus dans les sous-populations) = 0,04 ; P = 0,31) entre les
populations de G. p. pallicera. Cependant, un déficit en
hétérozygote significatif (FIS = 0,145 ; P = 0,0001) a
été observé pour les populations de G. p.
palpalis. Ce déficit en hétérozygote serait dû
à la forte variation entre les valeurs de FIS des
différents marqueurs. Entre les sous-populations de G. p.
pallicera, aucune différence significative n'a été
observée pour les valeurs du FST (indice de fixation entre
sous-populations de la population totale) indiquant l'absence de structuration
au sein des sous-populations des différents villages. Néanmoins,
des différences significatives ont été observées
entre G. p. pallicera et d'autres espèces de mouches
tsétsé.
Ces premières investigations portant sur la
génétique des populations de Glossina pallicera pallicera
ont révélé une absence de sous-structuration entre
ces populations de vecteurs et différents génotypes circulant
dans les villages du foyer de la THA de Campo.
Mots clés : marqueurs microsatellites,
Glossina pallicera pallicera, PCR, génétique des
populations
xi
Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
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