Helicobacter pylori: etude bactériologique des premières souches isolées à l'hôpital Bologhine Ibn Ziri

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE « HOUARI BOUMEDIENE »

FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES

Mémoire de projet de fin d'études en vue de l'obtention du Diplôme de Master
Domaine: Sciences de la Nature et de la Vie

Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire

Option : Microbiologie et Contrôle de Qualité

Helicobacter pylori : Etude bactériologique

des premières souches isolées à l'Hôpital

Bologhine Ibn Ziri

Présenté par: ^Melle DJOUADI Lydia Neïla

Melle RAOUI Sarah Ibtissem

Soutenu le : 13 /06/2011 devant le jury composé de :

Président : M^me Natèche F. (Maitre de conférence, USTHB) Promoteur: M^me Amhis W. (Professeur, EPH Bologhine Ibn Ziri) Examinateur : Melle Antri K. (Maitre assitstante, USTHB) Examinateur : M^r Selama O. (Maitre assitstante, USTHB)

Promotion 2010/2011

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dedicaces :

A la memoire de mon Papy,

A mes parents, et a mon petit frere, Samy. A ma Mamie,

A mes grands-parents paternels,

A Madame Greffou M. qui m'a tant apporte. Et a tous ceux qui me sont chers.

Lydia.

A ma grand-mere, qui est, pour moi, un modele de force et de sagesse. A ma mere, dont le soutien indefectible a ete indispensable.

A ma sceur, Rym.

A mes amis, qui m'ont toujours epaulee.

Et a tous ceux qui me sont chers.

Sarah.

Remerciements :

Nous tenons tout d'abord a remercier le Professeur Amhis, d'avoir accepte d'encadrer ce travail.

Nous remercions egalement, l'ensemble du personnel du laboratoire central de biologie de l'hapital Bologhine Ibn Ziri pour leur disponibilite et leur gentillesse.

Nous adressons nos remerciements aux membres du jury, qui ont accepte de juger ce travail.

Tous nos remerciements vont a nos enseignants qui ont contribue a la reussite de notre cursus.

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Introduction

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I-Introduction :

La découverte, en 1982, de Helicobacter pylori a suscité un immense intérêt scientifique dans le monde et a bouleversé notre compréhension de la pathogénie des principales pathologies gastro-duodénales.

Cette découverte a révolutionné le domaine de la Gastro-Entérologie. En effet, malgré les réticences initiales, le traitement de l'ulcère passe à présent par une antibiothérapie d'éradication de Helicobacter pylori.

Cette éradication a permis un recul notable du lymphome gastrique, puisqu'il est possible aujourd'hui, de faire régresser durablement ce cancer par un traitement antibiotique spécifique. (Ferrand, 2009)

En Algérie, bien que l'incidence de l'infection à Helicobacter pylori soit estimée à plus de 70% (6éme colloque sur Helicobacter pylori, 2011), peu d'études bactériologiques ont été publiées sur ce thème.

La culture de cette bactérie, très exigeante, et donc la réalisation de l'antibiogramme nécessaire à l'orientation du traitement, sont difficiles à mettre en oeuvre compte tenu des contraintes techniques qui s'y rattachent.

L'étude prospective qui nous a été confiée consiste en la mise en place d'un protocole de diagnostic bactériologique permettant , par plusieurs techniques , la culture , l'isolement et la réalisation d'antibiogrammes pour les souches obtenues à partir de biopsies gastriques de patients suivis à l'hôpital Bologhine Ibn Ziri.

I- Généralités

1-Historique :

En 1906 Walter Krienitz, un médecin allemand, observe pour la première fois des bactéries spiralées dans l'estomac d'un patient. (Ferrand, 2009)

Les scientifiques de l'époque étant convaincus de la stérilité de l'estomac, vu la très forte acidité qui y règne, n'accordent pas d'importance à cette observation pensant qu'il ne peut s'agir que de contaminants. (Mégraud, 2005)

Ce n'est qu'au début des années 1980 que de telles bactéries sont cultivées et étudiées : Robin Warren, un pathologiste australien constate la présence de bactéries spiralées, dans la moitié des biopsies gastriques qu'il prélève. Il fait l'hypothèse qu'elles sont à l'origine de gastrites chroniques et d'ulcères gastroduodénaux, pathologies que l'on pensait, jusque là, liées au stress ou à la nourriture épicée. (Ferrand, 2009)

Intéressé par ces résultats, Barry Marshall, un étudiant de Robin Warren, est le premier à cultiver cette bactérie en 1982. (Mégraud, 2005)

Cette dernière est baptisée dans un premier temps Campylobacter pylordis puis Campylobacter pylori (après correction grammaticale latine) en raison de ces similitudes avec Campylobacter jejuni (notamment son caractère microaérophile). Cependant, différentes études portant sur les caractères génétiques (séquences des ARNr 16S, pourcentage de G+C) et phénotypiques (morphologie, structure, composition en acides gras, activités enzymatiques) ont permis d'individualiser cette bactérie dans un nouveau genre, et de la renommer Helicobacter pylori (Ferrand, 2009).

La communauté scientifique, sceptique quant au rôle de H.pylori dans les ulcères gastriques, commence à changer d'avis après des études complémentaires, conduites par Marshall, dont la plus décisive est celle durant laquelle il ingurgite un tube à essai de H. pylori, contracte une gastrite et guérit avec des antibiotiques.

En 1994, le National Institute of Health publie un texte soutenant que la plupart des ulcères gastriques récurrents sont causés par H. pylori, et recommande que des antibiotiques soient inclus dans le traitement.

En 2005, Warren et Marshall obtiennent le prix Nobel de médecine pour leur découverte. (Mégraud, 2005)

Figure n°1 : Photo de Warren et Marshall *

*: http://cours.francocite.ca/courslaf/SBI3Uweb/SBI3Cwebunite3- anatomie/digestion/estomac/SBI3Cdigestionestomaculc%C3%A8re%20de%20l'estomac.htm

2- Epidémiologie :

L'infection à Helicobacter pylori est l'une des infections les plus répandues dans le monde, près de la moitié de la population mondiale est porteuse de la bactérie. Toutefois, la prévalence varie de 20 à 90% selon les pays, l'infection étant plus fréquente dans les pays en voie de développement. (Leclerc, 2006) (Figure n°2)

Figure n°2 : Prevalence de l'infe ction a Helicobacter pylori dans le monde*

L'infection survient généralement pendant l'enfance. La réaction immunitaire qui s'en suit détermine probablement l'évolution de l'infection au cours du temps. (Raymond et al.,2005). En effet, plusieurs études tendent à montrer qu'un individu a très peu de risques d'être infecté après l'âge de 10 ans. (Mitchell et Megraud, 2002)

Le seul réservoir significatif de Helicobacter pylori est l'estomac humain, bien que la bactérie soit retrouvée chez le chat domestique et certains primates. (Ferrand, 2009)

Les facteurs de risque de l'acquisition de l'infection par Helicobacter pylori sont fréquemment liés à la pauvreté. Ils comprennent la promiscuité, le manque d'hygiène, le partage de lits pendant l'enfance et le faible niveau d'éducation des parents. En outre, des facteurs comportementaux propres à certaines sociétés, tel que la pré-mastication des aliments par la mère, semblent également jouer un rôle significatif.

De nombreuses études épidémiologiques suggèrent une transmission de personne à personne par voie féco-orale ou plus vraisemblablement par voie oro-orale.

Le fait que la promiscuité soit un facteur de risque d'acquisition de l'infection, plaide en faveur d'une transmission de personne à personne et les études concernant l'influence de la pré-mastication des aliments suggèrent une transmission oro-orale.

Le risque pour un enfant d'être infecté augmente de façon significative avec le nombre de personnes infectées dans la famille. Il dépend en priorité de l'infection de la mère suivie de celle du père et de la place des enfants dans la fratrie. Ceci montre l'importance de la transmission intrafamiliale. Il a été en effet prouvé, par des techniques de biologie moléculaire de séquençage de gènes, que des souches identiques circulaient chez les différents membres d'une même famille, parents et fratrie. (Raymond et al., 2005)

L'une des conséquences les plus inattendues de cette transmission intrafamiliale est la possibilité de retracer les grandes migrations humaines à partir de l'Afrique de l'Est en étudiant la diversité génétique des souches de H.pylori. Ainsi, ces résultats montrent la co-évolution de la bactérie avec l'Homme depuis plus de 58 000 ans. (Ferrand, 2009)

* : http://www.nature.com/onc/journal/v23/n38/figtab/1207726f7.html#figure-title

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3- Rappel anatomique sur l'estoma c humain :

L'estomac est constitué de plusieurs régions: (Figure n°3)

- le cardia: jonction entre l'oesophage et l'estomac

- le fundus ou grosse tubérosité: partie en forme de dôme faisant saillie au dessus et à coté du cardia.

- le corps: portion médiane de l'estomac

- l'antre: portion terminale de l'estomac, terminée par le pylore qui régit l'évacuation gastrique via le muscle sphincter pylorique. *

Figure n° 3 : Schema de l'anatomie de l'estoma c humain *

La paroi de l'estomac est constituée des quatre couches concentriques caractéristiques de la majeure partie de tube digestif: (Figure n°4)

- Muqueuse : en contact avec la lumière (ou cavité) gastrique, elle est formée d'une monocouche cellulaire ou épithélium gastrique qui s'invagine dans un tissu conjonctif appelé chorion. Les cellules de l'épithélium sont responsables de la sécrétion de suc gastrique.

- Sous-muqueuse: tissu conjonctif

- Musculeuse: tissu musculaire qui mélange et propulse les aliments dans l'estomac

- Séreuse: tissu conjonctif ayant un rôle protecteur. *

* : http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/physiogerland/sysdigestif/page%20html/aa%2024.html

Figure n°4 : Histologie de l'estoma c humain *

4- Classification de Helicobacter pylori : (Manuel de Bergey, 2001) Domaine: Bacteria

Phylum: Proteobacteria

Classe: Epsilonproteobacteria

Ordre : Campylobacterales

Famille : Helicobacteraceae

Genre et espece : Helicobacter pylori

5- Caracteres bacteriologiques de Helicobacter pylori : 5-1-Morphologie :

Helicobacter pylori est un petit bacille (0,5 pm de diamètre sur 2 pm de longueur) de forme hélicoïdale, Gram négatif, mobile grâce à de multiples flagelles (5 à 7) entourés d'une gaine et disposés selon une ciliature polaire. La bactérie ne forme pas de spores mais peut adopter une forme coccoïde lorsqu'elle atteint la phase du plateau de croissance. (O'Rourke et Günter, 2001) (Figure n°5)

Figure n°5 : Helicobacter pylori observe au Microscope électronique a balayage**

* : http://nte-serveur.univ lyon1.fr/physiogerland/sysdigestif/page%20html/aa%2024.html ** : http://preveengeorge.blogspot.com/2011/02/h-pylori-and-peptic-ulcers.html

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5-2-Caracteres bio chimiques :

Helicobacter pylori est micro-aérophile (mais capable de croître en anaérobiose en présence de CO2) et possède une catalase, une oxydase, une nitrate réductase ainsi qu'une uréase très active. Elle n'acidifie pas les sucres, et cultive à une température comprise entre 33 et 40°C. Elle est RM et VP négatifs. (Ferrand, 2009)

5-3-Caracteres culturaux :

Elle croît lentement (3 à 4 jours minimum) et exige des conditions de culture particulières (micro-aérophile) et des milieux de culture additionnés de sang, de sérum ou de suppléments d'enrichissement (Flandrois,1997) tels que la gélose PYL (sélective pour H.pylori) ou Columbia additionnée de sang. Les colonies sont petites (0.5 mm) ou en nappes brillantes et non hémolytiques.* (Figure n°6)

Figure n°6 : Aspect des colonies de H.pylori sur gelose Columbia au sang frais* 5-4-Genetique :

Le génome de H. pylori est séquencé depuis 1997 : il possède 1 667 867 paires de bases codant pour 1590 protéines essentielles.

Environ trente pour cent des gènes de Helicobacter pylori sont spécifiques à l'espèce et une grande variabilité génétique peut être retrouvée entre les différentes souches.

Cette hétérogénéité se manifeste par des taux de mutation et de recombinaison importants, par l'acquisition d'ADN étranger (endogène ou exogène à l'espèce) et par des différences au niveau de l'organisation des gènes.

Helicobacter pylori possède environ 1200 gènes communs à toute l'espèce et 200 à 400 gènes présents de manière variable selon les souches. La majorité des différences génétiques est retrouvée dans la zone de plasticité et dans l'îlot de pathogénicité cag.

(cf. § 6-1)

L'importance des taux de mutation et de recombinaison serait due au manque d'efficacité du système de réparation de H.pylori.

De plus, Helicobacter pylori peut possèder des plasmides ou des systèmes d'import d'ADN qui lui permettent d'augmenter son adaptabilité. Ainsi, les analyses in silico ont permis de montrer que les gènes de ménage ou de virulence peuvent être transférés entre bactéries. Ces gènes peuvent provenir d'autres espèces du genre Helicobacter mais également d'autres genres bactériens. (Ferrand, 2009)

* : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf

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La diversité génétique de Helicobacter pylori s'explique aussi par des différences notables, entre les souches, dans l'organisation générale du génome, l'ordre des gènes et les séquences protéiques théoriques.

La grande variabilité génétique de Helicobacter pylori pourrait être due à sa voie de transmission intrafamiliale et à sa grande adaptation à un hôte unique. (Fauconnier,1998)

6- Pouvoir pathogène de Helicobacter pylori :

6-1-Fa cteurs de virulence :

Helicobacter pylori dispose de tout un arsenal de propriétés lui permettant de résister à l'acidité gastrique, de se mouvoir dans le mucus gastrique d'une grande viscosité et d'échapper aux réponses du système immunitaire de l'hôte (facteur de colonisation et de

persistance). Les facteurs de colonisation sont généralement exprimés par l'ensemble des souches cliniques.

D'autres facteurs sont plus spécifiquement associés à la genèse des lésions et interviennent en altérant l'intégrité de la muqueuse ou en déclenchant, puis modulant la nature de la réaction inflammatoire (facteurs de pathogénicité). La présence ou non des gènes codant ces facteurs, ou leur expression, est une composante variable. (Ferrand, 2009) (Tableau I)

Tableau I : Fa cteurs de virulence de Heli coba cter pylori (Amir-Tidani, 2003)

Fa cteurs de virulence	Fon ction	Présence dans toutes les sou ches :(+) oui, (_) non.
Fa cteurs de colonisation de la muqueuse gastrique
Flagelles*	Mobilité	(+)
Uréase**	Résistante à l'acidité Métabolisme azoté Echappement à la réponse immunitaire Effet cytotoxique (NH3)	(+)
Bab A	Adhérence aux antigènes Lewis b	( - )
Sab A	Adhérence (se lie à un lipide particulier présent à la surface des cellules épithéliales)	( - )
Alp A, Alp B	Adhérence (récepteurs non identifiés)	(+)
Fa cteurs d'inflammation et lesions cellulaire
Cytotoxine vacuolisante Vac A***	Cytotoxicité	( - )
Cag A****	Perturbation des voies de	( - )

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	signalisation cellulaire Modification de la morphologie épithéliale
Motifs antigéniques Lewis (x, y) (Lipopolysaccharides)	Mimétisme moléculaire (échappement à la réponse immunitaire) Adhérence	( - )
Autres fa cteurs
Catalase	Détoxication (échappement à la réponse immunitaire)	(+)
Superoxyde-dismutase	Détoxication (échappement à la réponse immunitaire)	(+)
Oip A	Activation des voies de signalisation pro inflammatoires (libération d'IL-8) réorganisation du cytosquelette	( - )
NapA	Recrutement de neutrophile et monocytes	( - )
Tip	Capacités de colonisation Rôle carcinogène	( - )

* Ces flagelles sont Constitués de 2 protéines distinctes FlaA et FlaB et sont recouverts d'une gaine permettant une protection contre l'acidité gastrique. (Fauconnier, 2002)

** L'uréase transforme l'urée en dioxyde de carbone et ammoniac permettant de

neutraliser localement l'acidité gastrique et créer ainsi un microenvironnement favorable
au développement bactérien. L'uréase de H.pylori est composée de deux sous unités :
UreA et UreB. Elle correspond à 6 à 10% de la masse totale bactérienne, ce qui montre le

rôle essentiel de cette molécule. (Gerhard et al., 2002)

*** La cytotoxine vacuolisante VacA tient son nom de sa capacité à induire l'apparition de vacuoles dans certaines lignées de cellules épithéliales. (Lamarque, 2001)

**** l'îlot de pathogénicité « cag » code pour un système de sécrétion de type IV : le TSS4 qui permet d'injecter, dans le cytoplasme de la cellule cible, la protéine CagA

(Ferrand, 2009).

6-2- Physiopathologie :

Figure n°7 : Résumé de la pathogenicite de H. pylori (Ferrand, 2009)

1/ Les flagelles et la forme spiralée de H. pylori permettent une mobilité dans le mucus. L'uréase bactérienne permet de créer un microenvironnement tamponné favorable à sa survie.

2/ La présence d'adhésines permet une adhérence à la surface cellulaire.

3/Cette liaison induit la production de cytokines pro inflammatoires.

4/ Ces cytokines pro-inflammatoires recrutent les cellules de l'immunité circulante.

5/ Ces cellules sont responsables d'une inflammation locale entraînant des lésions cellulaires. (Figure n°7)

6/ D'autre part, H. pylori secrète la cytotoxine vacuolisante, VacA. Ses effets sont nombreux sur les cellules : (Figure n°8)

A) La protéine VacA peut être retrouvée au niveau membranaire où elle joue le rôle d'adhésine.

B) VacA peut également être sécrétée et activer des voies de signalisation proinflammatoires après activation de récepteurs cellulaires.

C) L'internalisation de VacA et sa localisation mitochondriale induit un relarguage du cytochrome C et l'apoptose cellulaire (7). (Figure n°7)

D) Les protéines VacA endocytées forment des pores à l'intérieur des vésicules d'endocytose responsables de l'apparition de vacuoles, celles-ci proviendraient des vésicules d'endocytose après la liaison de VacA au niveau de la membrane cellulaire. Plusieurs molécules de VacA s'organisent en canaux permettant le passage de certains ions chlorure. Ce passage anionique serait compensé par l'entrée d'ions hydrogènes par les canaux cellulaires. Les vacuoles seraient alors une conséquence du rétablissement de la pression osmotique

E) La cytotoxine peut également interférer avec les lymphocytes T présents au niveau de la lamina propria. (Figure n°8)

Figure n° 08 : Effets de la cytotoxine va cuolisante Va cA. (Ferrand, 2009)

8/In vivo, l'administration de la protéine Vac A purifiée à des souris est responsable d'une dégénération de la muqueuse gastrique. (Figure n°7)

9/ Les bactéries retrouvées sur la face basale des cellules épithéliales se lient spécifiquement aux intégrines alpha5beta1 et injectent la protéine CagA et le peptidoglygane (PGN) via le TSS4.

10/CagA perturbe les voies de signalisation cellulaire et modifie la morphologie épithéliale en désorganisant les jonctions intracellulaires. La perturbation des jonctions serrées peut jouer un rôle dans le développement tumoral.

11/ La sécrétion de NapA et la production de cytokines pro-inflammatoires induite par CagA et le PGN sont responsables d'un recrutement de cellules immunitaires.

12/ H. pylori bloque également la maturation des lymphocytes et induit leur apoptose. (Ferrand, 2009)

6-3- E chappement a la reponse immunitaire de l'hate :

Toute infection entraîne une réponse immunitaire à la fois humorale et cellulaire de la part de l'hôte. Toutefois H.pylori persiste pendant longtemps dans l'estomac, en échappant aux systèmes de défense de l'organisme.

Différents mécanismes expliquent l'échec de la réponse immunitaire :

Le premier repose sur la saturation des anticorps opsonisants, par une libération abondante, programmée ou non par H.pylori, d'antigènes extrêmement immunogènes tels que l'uréase, la catalase ou encore la protéine de choc thermique Hsp B. (AmirTididani, 2003)

En outre le lipopolysaccharide de H.pylori caractérisé par un faible pouvoir endotoxique, est capable de mimétisme par la présence de motifs antigéniques de type Lewis X ou Lewis Y également présents à la surface des cellules épithéliales gastriques. (Szczepanik,2006)

De plus, lors d'une infection, H.pylori est phagocyté par les macrophages mais peut retarder cette internalisation et rester viable après fusion des phagosomes.

La bactérie est également capable d'induire l'apoptose des macrophages permettant une évasion de la réponse immunitaire innée. Ces mécanismes de résistance seraient portés par des facteurs de virulence, les souches dépourvues de l'îlot de pathogénicité cag et du gène vacA étant plus sensibles à la phagocytose. (Lamarque et Peek, 2003)

Enfin, H.pylori sécrète une catalase, une superoxyde dismutase (SOD) et une alkylhydroperoxyde-réductase qui lui permettent d'échapper aux réactions humorales et

à la phagocytose. Ces enzymes convertissent les radicaux libres bactéricides (en particulier H2O2) libérés par les lysosomes des polynucléaires neutrophiles en réponse à l'infection par H.pylori, en composés inoffensifs tels que l'oxygène, alors que l'uréase neutraliserait l'environnement phagolysosomial. (Ferrand, 2009)

6-4- Aspects cliniques :

La lésion de base de l'infection à H. pylori est une gastrite, c'est-à-dire une inflammation de la muqueuse gastrique. Elle peut persister des décennies, voire toute la vie du sujet

mais n'est pas forcément symptomatique. Par contre, elle peut évoluer vers les maladies suivantes :

Maladie ulcéreuse:

L'infection à H. pylori peut évoluer dans environ 5% des cas, vers la maladie ulcéreuse. Elle va fragiliser la muqueuse qui devient alors sensible à l'acide.

Cancer gastrique:

L'infection à H. pylori est la première infection bactérienne associée au développement de cancers chez l'homme. Dans moins de 1% des cas, la gastrite va évoluer vers un carcinome gastrique.

Le lymphome du MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue), autre cancer gastrique, encore plus rare a vu son pronostic transformé depuis la connaissance de H. pylori.

(Megraud ,2004)

Infection chronique à Helicobacter pylori

Gastrite chronique, Gastrite surtout au niveau du

acidité normale, pas corps. Acidité réduite. Atrophie

d'atrophie. (85%) (10%)

Gastrite surtout au niveau de l'antre, pas

d'atrophie, acidité accrue.

(5%)

Pas de signe Lymphome du MALT

Clinique (0.1%)

Ulcère duodénal Gastrite atrophique

Métaplasie ulcère gastrique

Intestinale (1%)

(10%)

Dysplasie

Adénocarcinome

Figure n° 09: Pathologies gastro-intestinales induites par l'infe ction a H. pylori. (Ferrand, 2009)

7- Diagnosti c histologique : Anatomo-pathologie :

L'examen anatomopathologique est pratiqué sur des coupes de biopsies gastriques colorées par coloration de Giemsa modifiée ou par la coloration argentique. Il permet, en plus de la détection de H.pylori, l'étude de l'état de la muqueuse et est indispensable au diagnostic, au typage, au grading et à la stadification des lésions associées à l'infection.

La sensibilité et la spécificité de l'examen histologique sont toujours supérieures à 90% dans les différentes publications scientifiques (96,8 % à100 % de sensibilité ; et 97,7 % de spécificité). (Amir-Tidadini,2003)

8- Diagnostic ba cteriologique :

Les méthodes de recherche de Helicobacter pylori sont classées en « invasives » ou « non invasives » selon qu'elles nécessitent ou non une fibroscopie gastro-duodénale.

8-1-Méthodes invasives (dire ctes) :

Elles consistent à pratiquer plusieurs biopsies de la muqueuse antrale ou fundique au cours d'un examen endoscopique et à rechercher les bactéries dans ces prélèvements biopsiques.

La mise en évidence des germes se fait par trois méthodes différentes, souvent combinées. En règle générale, trois biopsies sont examinées au laboratoire, chacune d'entre elle servant à réaliser une des méthode suivantes : ( Mégraud , 1997)

- Recherche de l'activité uréasique :

Cette technique consiste à rechercher l'activité uréasique des germes contenus dans un fragment de biopsie en plaçant celui-ci dans un milieu urée-indole (contenant un

indicateur coloré). En présence de l'uréase bactérienne, l'urée est hydrolysée en

ammoniac et CO2 en quelques minutes à quelques heures. La réaction s'accompagne de

l'alcalinisation du milieu et du virage de l'indicateur.* (Figure n°10)

* : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf

Figure n°10: Test de l'urease en milieu Uree-Indol.* - Examen direct :

Les biopsies sont soit broyées soit dilacérées stérilement au scalpel. Le produit, étalé sur une lame, est coloré par la méthode de Gram. Cette méthode permet de mettre en évidence H.pylori à la surface de l'épithélium de la muqueuse.* (Figure n°11)

Figure n°11 : Fragment de biopsie gastrique colore par la methode de Gram.** - Culture :

La culture est théoriquement l'examen de référence pour le diagnostic d'une infection à H.pylori. Elle permet essentiellement l'étude de la sensibilité aux antibiotiques. (AmirTididani, 2003)

La biopsie est dilacérée ou broyée puis ensemencée en milieu solide (enrichi en suppléments et agents sélectifs). Après une incubation de 2 à 5 jours à 37° C et dans une atmosphère appauvrie en oxygène, la croissance obtenue sur une gélose enrichie au sang se traduit par l'apparition de colonies translucides, non pigmentées d'un diamètre d'environ 1 mm.* (Figure n°9)

Figure n°12 : Aspects des colonies de Helicobacter pylori sur gelose Columbia au sang. **

* : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf ** : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html

L'identification de H.pylori passe par deux étapes :

- La première est une identification morphologique après coloration de Gram.

- La seconde est basée sur l'analyse de la présence de trois enzymes spécifiques : uréase, catalase et cytochrome oxydase. (Mégraud,1997)

8-2- Methodes non invasives (indire ctes) :

Les méthodes indirectes ont l'avantage de ne pas nécessiter d'endoscopie et d'être des méthodes dites « globales », c'est-à-dire qui explorent la totalité de la muqueuse gastrique. Elles sont sensibles et spécifiques et permettent un suivi de l'infection. Cependant, elles ne permettent pas l'isolement des bactéries.

- Test respiratoire à l'urée marquée :

Cette méthode consiste à mettre en évidence l'activité uréasique de la bactérie en faisant ingérer au patient de l'urée marquée au ¹³C (isotope non radioactif), puis à détecter le

CO2 marqué dans l'air expiré. Le ¹³CO2 doit alors être dosé par spectrographie de masse.

Si la bactérie est présente dans l'estomac, l'urée se scinde et libère le carbone 13 (ou 12) qui passe dans le sang puis les poumons et se retrouve dans l'air expiré. Ce test, fiable à plus de 98 %, présente l'avantage de rechercher la présence de la bactérie dans la totalité de l'estomac.* (Figure n°13)

Figure n°13: Test respiratoire a l'urée marquée.**

- Sérodiagnostic :

La sérologie consiste à détecter les anticorps anti-H.pylori par des techniques de type ELISA ou Western Blot. (Figure n°14)

Elle permet de définir des profils d'anticorps sériques avec :

- la présence d'anticorps anti-Cag A (116 kD)

- la présence d'anticorps anti-Vac A (89 kD)

Figure n°14: Bandelette ELISA pour le serodiagnostic. **

Le sérodiagnostic est utile en dépistage mais a l'inconvénient de rester positif de nombreux mois après éradication de la bactérie, les anticorps étant toujours présents dans le sérum des patients.

*: http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf ** : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html

- Recherche des antigènes fécaux :

Cette méthode récemment proposée, est un test ELISA qui consiste à rechercher les antigènes de Helicobacter pylori sur un échantillon de selles.

Elle est indiquée dans le contrôle de l'éradication à condition de respecter un intervalle de 8 semaines après arrêt du traitement. Il est surtout très performant chez les enfants de tout âge : c'est la méthode non invasive de choix pour ce groupe de patients. (AmirTidadini,2003)

Tableau II : Sensibilite et Specificite des methodes de diagnostic bacteriologique (AmirTidadini,2003)

Méthodes Sensibilité Spécificité

Test rapide à l'urée 85 à 95% 99%

Culture 80 à 90% 95 à 100%

Test respiratoire à l'urée marquée 90 à 98% 99%

Recherche des antigènes fécaux 89 à 98% > 90%

Sérologie 85 à 95% 80 à 95%

9- Traitement : sensibilite aux antibiotiques :

Le traitement consiste en une trithérapie de 7 jours associant un inhibiteur puissant de l'acidité gastrique : l'IPP (inhibiteur de la pompe à protons) et deux antibiotiques, le plus souvent l'Amoxicilline et la Clarithromycine (macrolide) ou encore le Métronidazole, si possible guidé par l'antibiogramme. (Vilaichone et al~,2006) (Figure n°15)

La bactérie est éradiquée dans plus de 70 % des cas après un premier traitement. Les facteurs d'échec sont : résistance à la clarithromycine retrouvée dans 12 à 14 % des cas, mauvaise observance du traitement, âge inférieur à 50 ans et tabagisme.

Après un traitement de deuxième ligne, 90 % des patients sont guéris de leur infection.*

Figure n°15 : Exemple d'antibiogramme pour les ma crolides dont l'erythromycine (E) *

* : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html

Tableau III : Resistance de Helicobacter pylori aux antibiotiques, selon les pays. (Botuna Eleco, 2003)

Pays (année)	No. de tests	Amoxicilline	Métro- nidazole	Cla rithro- mycine	Quino- lones	Furazoli- done	Tétra- cycline
Afrique
Sénégal (2009)	40	0%	90%		0%
Nigeria (1999)	50	0%	55%	13%	13%
Asie
Inde (2003) Inde (2005)	259 67	33% 0%	78% 85%	45% 0%	3%	0%	4% 7%
Asie du Sud-est (2006)	72	19%	100%	28%	7%
Taiwan (2009)	227	0%	27%	11%	9%
Chine (2007)	340	3%	76%	28%
Thaïlande (2009)	221	7%	39%	3%			3%
Moyen Orient
Iran (2007) Egypte (2004)	101 48	21% 2%	73% 100%	9% 4%	5% 2%	9%	5%
Arabie Saoudite (2002)	223	1%	80%	4%			0 .5%
Koweït (2006)	96	0%	70%	0%			0%
Amérique du Sud
Argentine (2006)	242			24%
Colombie (2009)	106	2%	82%	4%			0%
Brésil (2002)	202	53%		9%			0%

II- Matériel et Méthodes

Notre travail est une étude prospective (février à mai 2011) portant sur la recherche de Helicobacter pylori , à partir de la culture de biopsies gastriques provenant de 38 patients suivis dans les services de médecine interne et de pédiatrie de l'hôpital Bologhine Ibn Ziri , adressés pour une endoscopie digestive haute.

1- Materiel Biologique :

Les biopsies gastriques constituent le matériel biologique objet de notre étude. Celles-ci sont prélevées en salle d'endoscopie et sont acheminées au laboratoire de bactériologie dans un délai n'excédant pas 10 minutes.

En règle générale, pour chaque patient, deux prélèvements sont effectués : une biopsie antrale (au niveau de l'antre) et une biopsie fundique (au niveau du fundus).

Cependant, si l'endoscopiste est contraint de mettre fin à l'examen, en cas de reflexes nauséeux ou d'hémorragies digestives constatées, une seule biopsie est prélevée.

Lorsqu'il s'agit de patients suivis en pédiatrie, le protocole n'exige qu'un seul prélèvement : la biopsie antrale.

Nous avons établi, pour chaque patient, une fiche de renseignements mentionnant outre le nom, le prénom et le sexe, la pathologie ayant motivée la recherche de Helicobacter pylori et les éventuels traitements actuels ou antérieurs. (Annexe n°3)

2- Materiel non biologique : 2-1- Materiel pour le broyage des biopsies :

- Pipette Pasteur (1mL)

- Bistouri

- Porte bistouri

- Boite de Pétri (90mm de diamètre)

- Poire en plastique

- Portoir

- Alcool (70°)

- Lames propres

2-2- Matériel pour la realisation du test rapide a l'urée :

- Milieux Urée-Indole

- Pipette Pasteur (1mL)

- Tablette en plastique blanc

- Poire en plastique

2-3- Materiel pour l'isolement, l'identifi cation et l'in cubation :

- Lame

- Lamelle

- Boite de Pétri (90mm de diamètre)

- Pipette Pasteur (1mL)

- Poire en plastique

- Portoir

Milieux de base :

- Flacon de gélose Columbia (180ml) (Annexe n°4)

- Sang frais humain (groupe O rhésus +)

- Supplément sélectif pour Helicobacter pylori : Trimétoprime, Cefsulodine

Vancomycine, Amphotéricine B (Oxoid)

Réa ctifs :

- Milieux de réaction Urée-Indole (Annexe n°5)

- Générateurs d'atmosphère microaérophile (Annexe n°6)

- Peroxyde d'hydrogène (H2O2)

- Disque d'oxydase (1% diméthyl para phényléne diamine)

- Alcool (70°)

- Violet de Gentiane

- Lugol

- Fushine

2-4- Matériel pour l'étude de la sensibilité :

- Boite de Pétri (90mm de diamètre)

- Pipette Pasteur (1mL)

- Ecouvillon stérile

- Disques d'Antibiotiques

- Pince stérile

- Poire en plastique

Milieux de base :

- Milieux Mueller-Hinton (Annexe n°7)

- Sang frais humain (groupe O rhésus +)

2-5- Matériel pour la conservation :

- Pipette Pasteur (1mL)

- Tube stérile

- Poire en plastique

- Portoir

Milieux de base :

- Gélose Columbia au sang cuit coulé en pente.

2-6- Appareillage né cessaire :

- Etuve

- Congélateur -50°C

- Réfrigérateur

- Bain-Marie

- Microscope photonique

- Vortex

- Densitomètre

- Bec Bunsen

3- Méthodes de recherche et d'identifi cation de Helicobacter pylori :

Les biopsies gastriques étant récoltées en salle d'endoscopie et immédiatement

transportées au laboratoire, les prélèvements ne nécessitent pas de milieux de transport particuliers. Ils sont déposés, lors de l'endoscopie, dans des tubes à essai contenant uniquement de l'eau physiologique stérile. Une fois au laboratoire de bactériologie, nous soumettons les prélèvements à un examen direct comportant un test rapide à l'urée, une observation microscopique à l'état frais et une coloration de Gram. Nous procédons alors a leur mise en culture dans des conditions favorables au développement de Helicobacter pylori. Ces opérations se déroulent selon le protocole suivant :

3-1- Broyage des biopsies :

- Essuyer une lame avec de l'alcool et flamber au bec Bunsen. - Mettre la lame dans une boite de Pétri stérile.

- Prélever et jeter l'eau physiologique des tubes contenant les biopsies et la remplacer par du BHIB (Bouillon coeur-cervelle)

- Pipeter les biopsies avec le BHIB et les déposer sur une lame. - Dilacérer les biopsies à l'aide d'un bistouri.

3-2-Realisation du test rapide a l'uree :

- Déposer une goutte de milieu Urée-Indole sur une tablette en plastique blanc (permet d'apprécier le virage du milieu)

- Pipeter un fragment de biopsie et le déposer dans la goutte de milieu Urée-Indole.

En présence de l'uréase bactérienne, au bout de quelques minutes, le milieu passe du jaune-orangé au rose fushia. (Figure n°16)

Figure n°16 : Test rapide a l'uree (photo prise au laboratoire de bacteriologie, de l'EPH Bologhine Ibn Ziri).

3-3- Observation mi cros copique a l'état frais :

- Essuyer une lame avec de l'alcool et flamber au bac Bunsen.

- Déposer une goutte d'eau stérile à l'aide d'une seringue ou d'une pipette Pasteur sur la lame.

- Pipeter un fragment de biopsie et déposer sur la lame. Observation au microscope photonique :

- Déposer une lamelle sur la lame.

- Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lamelle. - Observer à l'objectif x100.

L'observation d'un petit bacille incurvé avec une mobilité caractéristique très

importante, indique la présence de Helicobacter pylori.

3-4- Coloration de Gram : Frottis :

- Déposer une goutte d'eau distillée sur une lame propre, à l'aide d'une seringue ou d'une pipette Pasteur.

- Pipeter un fragment de biopsie, le déposer dans la goutte d'eau et l'étaler en

effectuant des mouvements circulaires, à l'aide d'une pipette Pasteur.

- Laisser sécher la lame dans une boite de Pétri stérile à température ambiante, la coloration et l'observation se fontt le lendemain.

Coloration :

- Recouvrir le frottis de Violet de Gentiane. Laisser agir 1 minute. Rincer à l'eau.

- Verser le lugol. Laisser agir 1 minute 30. Rincer.

- Verser l'alcool (70°) goutte à goutte sur la lame jusqu'à recouvrir tout le frottis. Laisser agir 30 secondes, puis rincer.

- Recouvrir la lame de Fushine. Laisser agir 1 minute. Rincer. Sécher. Observation au microscope photonique :

- Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lame.

- Observer à l'objectif x100.

L'observation d'un bacille de forme hélicoïdale, coloré en rose (Gram -), indique la présence de Helicobacter pylori.

3-5- Culture :

3-5-1- Ensemencement :

- Pipeter un fragment de biopsie et le déposer sur le milieu Colombia au sang frais avec supplément (prélablement coulé et incubé pendant 24 heures, à 37°C)

- Ensemencer à l'aide d'une pipette en râteau en effectuant des mouvements circulaires sans toucher les bords de la boite de Pétri.

3-5-2- Incubation :

L'incubation se fait dans des jarres contenant des générateurs de microaérophilie (2 sachets par jarre). Ces dernières sont placées dans une étuve à 37°C pendant 2 à 15 jours.

3-6- Identification des cultures :

Les milieux ensemencés et mis à l'étuve à 37°C en atmosphère microaérophile, sont observés tous les deux jours pour détecter une éventuelle croissance de colonies suspectes : petites (environ 1mm de diamètre) et translucides. (Figure n°17)

Figure n°17 : Helicobacter pylori en primo- culture (photo prise au laboratoire de bacteriologie, de l'EPH Bologhine Ibn Ziri).

L'identification repose sur les conditions de culture (notamment la microaérophilie), et sur les caractères morphologiques et biochimiques. Elle comprend les étapes suivantes :

3-6-1- Réalisation d'un frottis coloré par la méthode de Gram : Frottis :

- Déposer une goutte d'eau distillée sur une lame propre, à l'aide d'une seringue ou d'une pipette Pasteur.

- Prélever une colonie, la déposer dans la goutte d'eau et l'étaler en effectuant des

mouvements circulaires, à l'aide d'une pipette Pasteur.

- Sécher puis fixer au bec Bunsen.

Coloration :

- Recouvrir le frottis de Violet de Gentiane. Laisser agir 1 minute. Rincer à l'eau.

- Verser le lugol. Laisser agir 1 minute 30. Rincer.

- Verser l'alcool (70°) goutte à goutte sur la lame jusqu'à recouvrir tout le frottis. Laisser agir 30 secondes, puis rincer.

- Recouvrir la lame de Fushine. Laisser agir 1 minute. Rincer. Sécher la lame.

Observation au microscope photonique :

- Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lame. - Observer à l'objectif x100.

L'observation d'un bacille de forme hélicoïdale, coloré en rose (Gram -), isolé ou en « banc de poissons », indique la présence de Helicobacter pylori.

3-6-2- Recherche de la cytochrome oxydase :

- Humidifier un disque de diméthyl paraphényléne diamine, avec une goutte d'eau distillée.

- Prélever une colonie et l'écraser sur le disque avec une pipette Pasteur.

La présence d'une cytochrome oxydase se traduit par l'apparition d`une coloration brunnoir sur le disque.

3-6-3- Recherche de la catalase :

- Déposer une goutte d'eau oxygénée (H2O2) sur une lame propre.

- Prélever une colonie avec une pipette Pasteur et déposer dans la goutte d'eau oxygénée.

La présence de l'enzyme se traduit par le dégagement de bulles gazeuses. 3-6-4- Recherche de l'uréase :

- Déposer une goutte de milieu Urée-Indol sur une tablette en plastique blanc . - Prélever une colonie et la déposer dans la goutte de milieu Urée-Indol.

En présence de l'enzyme, au bout de quelques minutes, le milieu passe du jaune-orangé au rose fushia. (Annexe)

3-6-5- Résistance à l'acide nalidixique :

Cette résistance est appréciée par la méthode de diffusion sur gélose. (cf § 3-7) 4-Methodes d'etude de la sensibilite aux antibiotiques :

Après recherche et identification de Helicobacter pylori, nous procédons à l'étude de la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques habituellement prescrits dans les pathologies gastriques qui lui sont liées.

Helicobacter pylori présentant une résistance naturelle à l'acide nalidixique, nous testons cet antibiotique pour confirmer l'identification.

4-1- Antibiogramme par la methode de diffusion sur gelose :

4-1-1- Liste des antibiotiques testés :

- Amoxicilline

- Ciprofloxacine

- Tetracycline

- Erythromycine

- Acide nalidixique (caractère d'identification) 4-1-2- Préparation de l'inoculum :

L'inoculum est préparé à partir de colonies viables fraîchement identifiées dans un tube à essai stérile contenant de l'au distillée. La turbidité est ajustée à l'aide d'un vortex et d'un densitomètre à 3 Mac Farland.

4-1-3- Inoculation : (méthode par écouvillonnage ou méthode de KIRBY-BAUER)

- Plonger un écouvillon stérile dans l'inoculum et bien l'essorer sur les rebords du tube.

- Frotter l'écouvillon sur la totalité de la surface gélosée d'un milieu Mueller- Hinton au sang frais, de haut en bas, en stries serrées.

- Répéter l'opération deux fois en tournant la boîte de Pétri à 60°, à chaque fois. Finir en en passant l'écouvillon sur toute la périphérie de la boîte.

4-1-4-Application des disques d'antibiotiques :

Les disques d'antibiotiques sont d'abord retirés du congélateur (-20°C), puis laissés à température ambiante.

A l'aide d'une pince stérile, déposer les disques, un à un, sur la gélose ensemencée, à l'extrémité de la boite de Pétri. Pour une bonne lecture, déposer trois disques maximum par boite.

4-1-5- Incubation :

Incuber à l'étuve à 37°C deux à trois jours, en atmosphère microaérophile. 4-1-6- Interprétation des résultats :

La lecture est faite après une période minimale d'incubation de 72 heures. Si la croissance, à la surface de la gélose, est significative et que les zones d'inhibitions sont clairement visibles, on peut mesurer les rayons d'inhibitions à l'aide d'un pied à coulisse métallique (les disques ayant été déposés aux bords de la boite de Pétri) et les multiplier par deux pour obtenir les diamètres d'inhibition. Les valeurs obtenues sont alors interprétées en fonction d'un abaque de lecture. Si ces conditions ne sont pas remplies, on prolonge le délai d'incubation.

4-2- Determination de la CMI (concentration minimale inhibitri ce) pour l'Amoxi cilline par E-test® :

4-2-1- Définition :

Le système E-test® consiste en une bande plastique non poreuse calibrée par un gradient de concentration d'antibiotiques contenant 15 dilutions.

Les concentrations prédéfinies sont immobilisées à la face opposée à l'échelle et représentent des valeurs de CMI (la CMI est définie comme étant la plus faible concentration d'antibiotiques inhibant en 72 heures la multiplication des bactéries).

4-2-2- Méthodologie :

La CMI est déterminée à partir du même inoculum bactérien, après inoculation par les mêmes méthodes et sur le même milieu que pour l'antibiogramme par méthode de diffusion sur gélose.

Application des bandes (retirées du congélateur puis laissées à température ambiante) :

- Déposer la bande de E-test® sur la gélose sèche à l'aide d'une pince stérile en mettant l'échelle de la CMI face à l'ouverture de la boîte.

- Assurer un bon contact entre la bande et la gélose en appuyant sur la bande en partant de la base.

4-2-3- Incubation :

L'incubation se fait à l'étuve à 37°C pendant 72 heures en atmosphère microaérophile ( à condition que la croissance soit significative et que l'ellipse d'inhibition soit clairement visible).

4-2-4- Interprétation des résultats :

La CMI est lue au point d'intersection de l'ellipse et de la bande. 5- M6thode de conservation des sou ches :

La conservation des souches de Helicobacter pylori se fait sur milieu Columbia au sang cuit, coulé en pente dans des tubes à essai stériles. La gélose est ensemencée en stries à partir des colonies obtenues en primo-culture ou à partir des réisolements.

III-Résultats et

Discussion

1-Etude épidémiologique :

1-1-Repartition générale des resultats : Tableau IV : Taux de positivité globale (culture)

Nombre total de patients	Effectif patients positifs		Pourcentage	38
13	34,2%

D'après le tableau IV, sur un total de 38 patients atteints de pathologies gastriques associées à Helicobacter pylori, 13 se sont avérés positifs après culture.

Un patient est considéré positif à Helicobacter pylori lorsque la culture est positive. L'examen direct (test rapide à l'urée, états frais, coloration de Gram), quant à lui, permet d'orienter ou de confirmer le diagnostic.

Le taux de positivité global de notre étude (34,2%), très bas par rapport aux taux de prévalences obtenus par des techniques de diagnostic histologique et sérologique (supérieur à 70%) de plusieurs études algériennes, montre que notre technique doit être améliorée. Celle-ci n'ayant été mise en place qu'en février 2011 durant notre stage au laboratoire de bactériologie de l'hôpital Bologhine, des progrès au niveau du protocole et du matériel de travail peuvent être obtenus.

1-2-Repartition des resultats en fon ction du sexe :

Tableau V : Repartition des resultats en fon ction du sexe (culture).

Sexe		Nombre			Pourcentage			Positifs				Pourcentage		Féminin
23		60,5%			07			30,4%				Masculin
15		39,5%			06			40%				Total
											34,2%
	38			100%			13

On note que le taux de positivité chez l'homme (40%) est supérieur à celui retrouvé chez la femme (30,4%). Cependant, de nombreuses études épidémiologiques rapportent que l'infection à Helicobacter pylori touche plus le sexe féminin (6^éme colloque sur Helicobacter pylori, 2011). Ceci s'explique par notre faible effectif qui ne nous permet pas de conclure.

Figure no 18 : Répartition des resultats en fon ction du sexe.

1-3- Repartition des resultats en fon ction de l!age :

Tableau VI: Repartition des resultats en fon ction de l!age (culture).

Age	Nombre	Pourcentage	Positifs		Pourcentage	[0-16]
04	10,5%	01	7,6%		[17-32]
14	36,8%	04	30,7%		[33-48]
07	18,4%	03	23%		[49-64]
07	18,4%	02	15,3%		[65-80]
05	13,2%	02	15,3%		[81-96]
01	2,6%	01	7,6%		Total
38	100%	13	100%

Le tableau ci-dessus nous montre que la tranche d'âge la plus touchée par les infections à Helicobacter pylori est celle de [17-32] ans avec un taux de positivité de 30,7%, suivie par celle de [33-48] ans (23%). Ceci est probablement lié à l'âge d'apparition des premières manifestations gastriques motivant la consultation en gastro-entérologie, sachant que le portage de la bactérie augmente avec l'âge et que seuls 10% des porteurs développent des pathologies gastriques.

En revanche les tranches d'âge les moins touchées sont celles de [0-16] ans et [81-96] ans avec un taux de 7,6%. Ceci s'explique par le faible effectif pour ces deux tranches d'âge, qui ne nous permet pas de conclure.

Figure n°19 : Repartition des patients adresses pour une endos copie en fon ction des tran ches d'age.

Figure n°20 : Repartition des résultats positifs en fon ction de l'age.

1-4- Repartition des resultats en fon ction de la pathologie ayant motivee la recherche d'Helicobacter pylori :

Tableau VII: Association entre H.pylori et differents types de pathologies gastriques.

Pathologies	Femmes (N=23)		Hommes (N=15)		Femmes Positives (N=7)		Hommes Positifs (N=6)			Total F+H Positifs
	%	N	%	N	%	N	%
05	21,7%	07	46,7%	03	42,8%	04	66,7%		53,8%	Néoplasie
00	00%	00	00%	00	00%	00	00%		00%	Lymphome
00	00%	01	6,7%	00	00%	00	00%		00%	Gastrite
16	69,6%	07	46,7%	04	57,1%	02	33,3%		46,2%	Maladie coeliaque
00	00%	00	00%	00	00%	00	00%		00%	Autres
02	8,7%	01	6,7%	01	14,3%	00	00%		7,7%

Figure n°21 : Repartition des patients en fon ction des pathologies ayant motive la recherche de Helicobacter pylori.

Dans notre étude, chez les patients positifs à Helicobacter pylori aucun cas de néoplasie, de lymphome, ou de maladie coeliaque n'a été retrouvé. En outre, certains patients peuvent présenter une deuxième pathologie gastrique en plus de celle liée à Helicobacter pylori.

On remarque que les taux de positivité les plus élevés concernent les patients atteints d'ulcères et de gastrites avec des proportions de 53,8% et 46,2%, respectivement.

On note également que pour les patients dont l'infection à Helicobacter pylori est avérée, la gastrite touche plus les femmes, tandis que l'ulcère prédomine chez les hommes.

Figure no 22 : Répartition des résultats positifs en fon ction de la pathologie.

1-5-Traitement antérieur :

Tableau VIII : Proportions de patients traités et non traités

	Nombre	Pourcentage	Positifs		Pourcentage	Patients traités
11	29%	03	27,3%		Patients non traités
27	71%	10	37%		Total
38	100%	13	34,2%

D'après le tableau VIII, sur les 38 patients de notre étude, seuls 11 ont reçu un traitement d'éradication contre Helicobacter pylori.

Sur les 13 patients positifs à Helicobacter pylori, 3 d'entre eux ont reçu un traitement antérieur d'éradication. Cet échec thérapeutique peut s'expliquer soit par une mauvaise observance du traitement soit par une résistance des souches de Helicobacter pylori à l'un des antibiotiques prescrits (le traitement étant souvent donné à l'aveugle)

Molecules utilisees :

Tableau D (: Proportion des differents traitements administres.

TRAITEMENTS		Nombre de patients (N=11)		Pourcentage
Amoxicilline		45,4%
	05
Clarithromycine		18,2%		J ES
	02
Metronidazole	06	54,5%		AUTRES
IPP	09
		81,8%

On constate que l'antibiotique le plus administré est le metronidazole (54,5% des patients), suivi de l'amoxicilline (45,4%). Ceci correspond au schema thérapeuthique de première ligne utilisé en Algérie, la clarythromicine etant prescrite en cas d'allergie aux bêtalactamines

L'IPP (inhibiteur de la pompe à protons) est systématiquement associé à l'antibiothérapie d'éradication de Helicobacter pylori.

Figure n°23 : Répartition des antibiotiques administrés.

2-Etude bacteriologique :

2-1-Repartition des resultats en fon ction du site anatomique de prelevement :

Tableau X : Repartition des resultats en fon ction du site anatomique de prelevement.

Sites		Nombre de prélèvements reçus			Positifs				Pourcentage de patients positifs		Antre
37		13			35%				Fundus
33		11			33,3%				Total
								34, 3%
	70			24

Le tableau X nous montre qu'il n'y a pas de différence significative entre les taux de positivité, à la culture, des prélèvements antraux et fundiques. Néanmoins nous avons noté, durant notre étude, des cultures plus abondantes pour les prélèvements antraux. Ceci corrobore les données de la littérature où il est rapporté que Helicobacter pylori infecte préférentiellement l'antre (6^éme colloque sur Helicobacter pylori, 2011).

Figure n°24 : Repartition des prelevements en fon ction du site anatomique. 2-2- Resultats de l'examen direct :

Tableau XI : Positivite aux examens directs (N=70)

Examens directs	N	Fundus %	N	Antre %	N		TOTAL (N=70) %	Coloration de Gram
21	63,6 %	24	64,9%	45	64, 3%		Test rapide à l'urée
19	57,6 %	25	67,6 %	44	62,8%		Mobilité
29	87,9 %	34	91,9 %	63	90%

On remarque que les taux de positivité aux différents examens directs sont nettement plus importants que ceux de la culture seule. Ceci s'explique par le fait que ces tests soient réalisés immédiatement après le prélèvement, sur des bactéries fraichement prélevées, non encore confrontées à des conditions défavorables à leur survie.

On remarque également que le taux de positivité le plus élevé concerne l'étude de la mobilité (90%). Ce taux peut s'expliquer par la présence de bactéries contaminantes mobiles provenant de la flore oro-pharyngée des patients ou des contaminations du matériel d'endoscopie qui peuvent souiller la lame et induire de faux positifs.

La coloration de Gram et le test rapide à l'urée représentent respectivement 64, 3% et 62,8% de positivité. Ces taux se rapprochent de ceux retrouvés dans différentes études algériennes sur la prévalence de l'infection à Helicobacter pylori. (6^éme colloque sur Helicobacter pylori, 2011)

On remarque également une positivité plus importante aux différents tests rapides pour les prélèvements antraux. Ce qui coïncide avec les données de la littérature qui rapportent que Helicobacter pylori est retrouvé de manière plus abondante dans l'antre, cette bactérie ayant un tropisme particulier pour les cellules antrales. (6^éme colloque sur Helicobacter pylori, 2011)

Figure n°25 : Pourcentages de positivite aux examens directs. 2-3- Ftesultats de la Culture :

Tableau XII : Pourcentage de positivite de la culture.

	Fundus	Antre		Total	Culture
Positifs	Positifs
(N=33)	(N=37)	(N=70)		Nombre
11	13	24		Pourcentage
33%	35%	34, 3%

On note un taux de positivité à la culture de 34,3% ce qui concorde avec le taux de
positivité rapporté au nombre de patients (34,2%). Sur les 38 cas adressés, 13 souches
ont été identifiées et seules 10 ont pu être isolées et purifiées (Figure n°26). En effet

pour trois des patients, une contamination importante à rendu les cultures inexploitables (Figure n°27). Ceci s'explique par des contaminants pouvant provenir du matériel d'endoscopie, de la flore oro-pharyngée des patients, des poches de sang servant la préparation des milieux de culture, ou de l'environnement (matériel, manipulateur, ambiance). Il est à noter également que ces bactéries contaminantes sont forcément résistantes aux différents antibiotiques contenus dans le milieu de culture spécifique à Helicobacter pylori.

Lors de notre étude, nous avons remarqué que pour un patient dont on traite les deux prélèvements (antral et fundique), la positivité est retrouvé pour les deux sites.

Figure n°26 : Reisolement de Helicobacter pylori (Photo prise au laboratoire de bacteriologie de l'EPH Bologhine).

Figure n°27 : Contamination d'une primo culture de Helicobacter pylori (Photo prise au laboratoire de bacteriologie de l'EPH Bologhine).

Figure n° 28: Contamination d'un reisolement de Helicobacter pylori (Photo prise au laboratoire de bacteriologie de l'EPH Bologhine).

2-4- Résultats des antibiogrammes :

Tableau XIII : Résultats des Antibiogrammes

Antibiotique	Diamètre			Interprétation (S / R)		Patient 1
Amoxi cilline Ciprofloxa cine Tetracycline Erythromy cine Acide nalidixique Rifampi cine
Fundus 82 mm 58mm 72mm 60mm < 0.6mm 56mm	Antre 82 mm 58mm 72mm 60mm < 0.6mm 56mm		Fundus S S S S R S	Antre S S S S R S	Patient 2
Amoxi cilline Ciprofloxa cine Tetracycline Erythromy cine Acide nalidixique Rifampi cine
92mm 40mm 96mm < 0.6mm < 0.6mm 64mm	92mm 40mm 96mm < 0.6mm < 0.6mm 64mm		S S S R R S	S S S R R S

Sur les 10 souches isolées, seulement deux antibiogrammes ont pu être réalisés. En effet plusieurs difficultés ont été rencontrées :

Les repiquages successifs des souches avant réalisation de l'antibiogramme induisent l'apparition de formes coccoides non cultivables.

Dans certains cas, une suspension de 3 Mac Farland n'a pas pu être réalisée même après réisolement en raison de contaminations envahissant toute la surface gélosée. (Figure n°28)

Le lot de milieu Mueller- Hinton utilisé durant notre stage semble déficient, et ne permet donc pas la croissance de Helicobacter pylori, étant une bactérie exigeante.

Des problèmes de contaminations sont survenus, le milieu Mueller-Hinton étant riche et non séléctif.

On remarque une résistance à l'erythromycine pour le patient 2, et une bonne sensibilité globale pour les 2 souches avec de grandes zones d'inhibition.

On note également une résistance des 2 souches à l'acide nalidixique, celle-ci étant un caractère d'identification de Helicobacter pylori.

2-5- Ftesultats de l'etude de la CMI :

L'étude des CMI pour l'amoxicilline par E-test n'a pas pu être réalisée pour les raisons suscitées.

Conclusion

Conclusion :

Notre étude a permis de contribuer à la mise en place d'un poste de culture de Helicobacter pylori au sein du laboratoire central de biologie de l'hôpital Bologhine Ibn Ziri. Un protocole de recherche et d'étude de la sensibilité aux antibiotiques de cette bactérie a été élaboré.

Sur 38 patients prélevés, ce dernier a permis de cultiver 13 souches différentes, d'en isoler et purifier 10 et d'obtenir 2 antibiogrammes exploitables pour le traitement.

Le faible taux de positivité à la culture (34,2%) comparé aux résultats que nous avons obtenu à l'examen direct (environ 63%) qui sont corroboré par les taux de prévalence d'environ 70% retrouvés dans les études algériennes (estimé par les méthodes

histologique et sérologique), indique que notre protocole de culture induit un nombre non négligeable de faux négatifs.

Le caractère « capricieux » de Helicobacter pylori nécessite certainement une optimisation de notre protocole et exige une observation plus stricte de la qualité du matériel utilisé.

Malgré le modeste taux de réussite de la culture de Helicobacter pylori, cette étude prospective nous montre qu'un investissement dans l'amélioration du protocole est souhaitable pour permettre d'établir, in situ, des profils de résistance aux antibiotiques nécessaires à l'orientation du traitement et de ce fait, réduire l'acquisition de nouvelles résistances induites par le traitement à l'aveugle.

References

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- 6 ^éme colloque sur Helicobacter pylori , Laboratoire Algérien de Recherche sur Helicobacter- Alger, Palais de la Culture Moufdi Zakaria, 20 Février 2011.

Annexes :

Annexe n°1 : Coloration de Giemsa.

Coloration qui repose sur l'action complémentaire de deux colorants neutres et sur l'affinité des éléments cellulaires pour les colorants acides ou basiques. Ces colorant neutres sont :

- Le May-Grünwald, neutre, contenant un colorant acide, l'éosine , et un colorant basique, le bleu de méthylène.

- Le Giemsa, neutre, contenant lui aussi de l'éosine , et un colorant basique, l'azur de méthylène .

Annexe n°2 : Coloration argentique

Technique basée sur la capacité des membranes et parois cellulaires à s'imprégner d'argent. Elle permet d'épaissir le corps bactérien et de mieux le visualiser.

Annexe no 3: Fiche de renseignements

Annexe n°4 : Composition du milieu Columbia

Polypeptones : 17,0 g/L

Peptone pancréatique de coeur : 3,0 g/L Amidon de maïs : 1,0 g/L

Chlorure de sodium : 5,0 g/L

Extrait de levure : 3,0 g/L

Agar : 13,5 g/L

pH = 7,3 +/- 0,2

Annexe n°5 : Composition du milieu urée -idole

L-tryptophane : 3 g

Urée : 20 g

Monophydrogénophosphate de potassium : 1 g

Dihydrogénophosphate de potassium : 1 g

Chlorure de sodium : 5 g Éthanol à 95 °GL : 10 ml Rouge de phénol : 25 mg Eau distillée : 1 l

Annexe n°6 : composition du milieu Mueller-Hinton

infusion de viande de boeuf:300,0 ml peptone de caséine:17,5 g

amidon de maïs:1,5 g

agar: 17,0 g pH = 7,4

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Glossaire :

Adenocarcinome : Tumeur maligne développée aux dépens d'un épithélium glandulaire.

Alkylhydroperoxyde-reductase : Enzyme dont La fonction est de protéger H. pylori par réduction d'hydroperoxydes organiques toxiques.

Antigene lewis a, b : antigènes libres dans le plasma et autres liquides biologiques, adsorbés sur les érythrocytes (antigènes des groupes sanguins).

Antigene lewis x, y : antigènes présents sur les membranes des leucocytes et des cellules endothéliales.

Carcinome : Cancer développé à partir d'un tissu épithélial (peau, muqueuse).

Cytokine : Substances solubles de communication synthétisées par les cellules du système immunitaire (les lymphocytes T) ou par d'autres cellules et/ou tissus, agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction.

Dysplasie : Malformation ou déformation résultant d'une anomalie du développement d'un tissu ou d'un organe, qui survient au cours de la période embryonnaire ou après la naissance.

Grading : Détermination du grade.

Intégrine alpha5 beta 1 : Protéine transmembranaire qui intervient dans les interactions entre les molécules d'adhésion sur les cellules adjacentes et/ou la matrice cellulaire.

Lamina propria : Membrane située au dessous de l'épithélium de la muqueuse, constituée essentiellement d'un épithélium et d'un chorion, et accessoirement de fibres élastiques musculaires, de glandes, de villosités, etc., selon la muqueuse considérée.

Lymphome : Cancer du système lymphatique aux dépens des lymphocytes.

Metaplasie : Transformation d'un tissu cellulaire différencié en un autre tissu cellulaire différencié.

Super oxyde-dismutase : Enzyme dont la fonction est de protéger H. pylori par réduction d'hydroperoxydes organiques toxiques.

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Liste des abréviations :

· ADN: Acide désoxyribonucléique.

· Alp: Adhesion associated protein.

· Bab A: Blood group antigen binding protein.

BHIB: Beef Heart Infusion Broth, bouillon Coeur cervelle. Cag A: Cytotoxin associated gene.

CMI: Concentration minimale inhibitrice.

ELISA: Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay. H.pylori: Helicobacter pylori

Hsp: Heat Shock Protein, protéine du choc thermique. IL-8 : Interleukine 8

MALT: Mucosa Associated Lymphoid Tissue, tissu lymphoïde associé aux muqueuses.

Nap A: Neutrophile associated protein.

RM : Rouge de méthyle.

Sab A: Sialic acid-binding adhesion.

SOD: Super oxyde-dismutase.

Tip: TNS inducing protein.

TSS4: Système de sécrétion type 4.

Vac A: Active vacuolating cytotoxin, cytotoxine vaccuolisante.

VP: Voges proskauer.

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