Annexes
Annexe 1 : Tableau de conversion de la VMEA en
âge moyen d'une population de
glossines mâles (source : manuel de lutte contre la
mouche tsé-tsé/volume 1/FAO)
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VMEA
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Age
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VMEA
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Age
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VMEA
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Age
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VMEA
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Age
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moyen
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moyen
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moyen
|
moyen
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1,6
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11
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2,8
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21
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3,9
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31
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5,1
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41
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1,8
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12
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2,9
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22
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4
|
32
|
5,2
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42
|
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1,9
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13
|
3
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23
|
4,2
|
33
|
5,3
|
43
|
|
2
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14
|
3,1
|
24
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4,3
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34
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5,4
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44
|
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2,1
|
15
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3,3
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25
|
4,4
|
35
|
5,5
|
45
|
|
2,2
|
16
|
3,4
|
26
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4,5
|
36
|
5,6
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46
|
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2,3
|
17
|
3,5
|
27
|
4,6
|
37
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5,8
|
47
|
|
2,4
|
18
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3,6
|
28
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7,7
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38
|
5,9
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48
|
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2,6
|
19
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3,7
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29
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4,8
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39
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6
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49
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2,7
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20
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3,8
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30
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5
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40
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Annexe 2 : Protocole détaillé du
dosage immuno-enzymatique (ELISA-indirect) des anticorps anti-trypanosomes :
ELISA-indirect à Trypanosoma spp
1. Sensibilisation des plaques
- Diluer 125 jtl d'antigènes solubles de T. vivax
et T. congolense (soit 5 jtg/ml) dans 25 ml de tampon
carbonate-bicarbonate ou Coating Buffer (CB) 0,05 M ;
- Déposer 100 jtl de cette dilution dans tous les puits
de la plaque à sensibiliser ;
- Incuber les plaques pendant 2 heures à 37°C sous
agitation ou les garder une nuit à +4°C ; - Vider, sceller et
garder les plaques à -20°C si le test est programmé pour
plus tard.
2. Blocage des sites non spécifiques
- Sortir les plaques du congélateur, et laisser environ 5
minutes à la température ambiante ; - Déposer 150 jtl du
tampon de blocage ou Blocking Buffer (BB) dans chaque puits des plaques
sensibilisées ;
- Incuber les pendant 30 minutes à 37°C sous
agitation permanente.
3. Dilution des sérums
- Sortir les plaques de l'incubateur, vider et les laver 3 fois
à l'aide du tampon de lavage (WB) ;
- Les sérums à tester ainsi que des standards
(positifs et négatifs) sont dilués à 1/25ème et
à 1/50ème dans un tampon de dilution (DB) dans des plaques de
dilutions ;
- Les sérums (100 jtl) sont déposés en
double dans chaque plaque ;
- Incuber les plaques pendant 1 heure à 37°C sous
agitation permanente.
4. Ajout de l'anti-sérum ou
conjugué
- Sortir les plaques de l'incubateur, vider et les laver 3 fois
à l'aide du tampon de lavage (WB) ;
- Déposer 100 pl de conjugué (anti-IgG) dans chaque
puits, préalablement dilué au 1/10000ème dans
du PBS + 0,1% Tween ;
- Incuber les plaques pendant 1 heure à 37°C sous
agitation.
5. Substrat / Chromogène
- Sortir les plaques de l'incubateur, vider et les laver 3 fois
à l'aide du tampon de lavage (WB) ;
- Placer 100 pl de substrat par puits, préparé
à partir de 25 ml d'acide citrique, 125 ml d'ABTS et de 100 pl H2O2.
6. Lecture des résultats (densités
optiques ou DO)
- Mettre en marche le lecteur ELISA (spectromètre) au
moins 15 minutes avant et vérifier que le programme
sélectionné est correct ;
- Essuyer le dessous des plaques pour éviter les
aberrations ;
- Sur l'ordinateur sélectionner le logiciel Procomm ;
- Lire les plaques à 405 nm.
Préparation des tampons
Les tampons doivent être préparés 24 heures
à l'avance et conservés à +4°C tout ou plus une
semaine. Vérifier systématiquement et ajuster si
nécessaire le pH avant leur utilisation à l'aide d'un
pH-mètre.
-Coating Buffer (CB) ou tampon
carbonate-bicarbonate:
Na2CO3 1,58 g
NaHCO3 2,93
H2O qsp 1 litre ajusté pH 9,6
- PBS Buffer:
Na2HPO4 1,21 g
KH2PO4 0,20 g
NaCl 8,00 g
QSP 1 litre eau distillée pH 7,4
- Washing Buffer 0,05% Tween (WB) ou tampon de lavage:
soit 500 pl de «Tween 20» par litre de tampon
- Blocking Buffer (BB): 0,2 g de
caséine/100ml WB
- Diluting Buffer (DB): 0,2 g de
caséine/ 100ml WB
- Conjugate Buffer (CB1): PBS 0,5% «Tween
20»
- Conjugué bovin sigma au 1/10.000 dans
CB1: l'enzyme utilisé dans le couplage est la peroxydase de
Raifort E.C.1.11.1.17, enzyme à deux substrats (H2O2 et ABTS).
- H2O2 ou eau oxygéné ou peroxyde
d'hydrogène: 500jil d'H2O2 à 30% + 7,5ml d'eau
distillée; conserver au frais et à l'abri de la
lumière.
- ABTS ou 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline
sulfonate]: 135 mg ABTS poudre/6,25 ml d'eau distillée;
conserver au frais et à l'abri de la lumière.
- Substrate Buffer: acide citrique (C6H8O7) 9,6
g dans 1 litre d'eau distillée, pH 4
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