Etude microbiologique de l'eau consommée par les habitants de kafubu

IV.2.3.3. SIM

Ce milieu est utilisé pour la recherche de trois caractères : Mobilité, Indole et H₂S.

1. Principe et Intérêt

· Le milieu doit être reparti en tubes ou en flacons et ensemencé, après refroidissement, avec une culture pure par piqure droite et profonde sur un tiers environ de la hauteur du milieu. Incuber 18 heures ou plus si nécessaire à 37°C.

· C'est un semi-solide (agar à 3g. L-1) qui permet la mise en évidence de la mobilité ;

· Il contient de peptone caséine, riche en tryptophane : on pourra mettre en évidence la production de l'Indole lors de la dégradation du tryptophanase.

· Il contient de thiosulfate de Sodium et de citrate de Fer qui permettent de déceler la production de H₂S (réduction de thiosulfate) par formation de sulfure de Fer noir.

Ce milieu est utilisé pour l'identification des entérobactéries, et on ajoute le réactif de Kovacx, car les réactions obtenues ne pas pour identifier un germe, et ce réactif permet de confirmer comme test biochimique complémentaire.

1. Lecture

Les germes non mobiles poussent le long de la piqure tandis que les germes mobiles diffusent en général tout autour et envahissent le milieu.

La production d'H₂S entraine un noircissement au niveau de la piqure.

IV.2.4.COLORARATION DE GRAM

1. Généralités

Certains genres de bactéries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ils forment le groupe des bactéries Gram positives (Gram+).

Toutes les autres bactéries soit qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement différentes se laisse décolorer par la méthode de Gram. Elles sont dites (Gram -).

Matériel

Ø Microscope ;

Ø Huile à immersion ;

Ø Culture (prélèvement) bactérienne ;

Ø Lames dégraissées ;

Ø Pince à lames ;

Ø Bec de Bunsen (ou bien lampe à alcool) ;

Ø Pissette d'alcool absolu ou alcool-acétone.

Ø Pissette d'eau.

2. Colorants

v Violet phéniqué (Nicole)

· Violet de gentiane ;

v Liquide de Lugol ;

v Solution de Fuschine ;

v Alcool Absolu ou bien Alcool-Acétone

v Principe

1. Etalement.

L'étalement doit se faire en couche mince sur une lame dégraissée ;

2. Dessiccation.

Laisser sécher à l'air.

3. Fixation.

Passer trois fois rapidement dans la flamme du Bec bunsen la face de la lame opposée à l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement. On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool méthylique versées directement sur le prélèvement.

A ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.

4. Coloration

1^e Déposer quelques gouttes de violet de gentiane ;

2^e Laisser agir 4 à 6 secondes ;

3^e Egoutter sans rincer ;

4^e Déposer quelques gouttes de Lugol ;

5^e Laisser agir 4 à 6 secondes ;

6^e Egoutter et recommencer avec le Lugol ;

7^e Egoutter ;

8^e Faire couler sur la lame (pas sur l'étalement) l'Alcool ou l'Alcool-Acétone. Jusqu'à la disparition du violet ;

9^e Laisser agir quelques gouttes de Fuschine 25 secondes ;

10^e Laver ;

11^e Sécher.

5. Examen.

Examiner à l'objectif à immersion.

Lecture

La coloration de Gram se fait en trois phases suivies d'une phase facultative de coloration du fond.

- (1, 2, 3) Coloration au violet. Tous les éléments sont colorés en violet.

- (4, 5, 6, 7) Le Lugol fixe le violet sur les structures membranaire de Bactéries Gram+. Les éléments sont colorés en noir.

-(8) Décoloration. Les Bactéries Gram+ sont colorées en violet foncé, les autres éléments ne sont pas colorés.

- (9, 10, 11) Recoloration du fond à la Fuschine. Les éléments tissulaires et les bactéries Gram négatif sont colorés en rose. Les Bactéries Gram positif sont colorées en violet.