WOW !! MUCH LOVE ! SO WORLD PEACE !
Fond bitcoin pour l'amélioration du site: 1memzGeKS7CB3ECNkzSn2qHwxU6NZoJ8o
  Dogecoin (tips/pourboires): DCLoo9Dd4qECqpMLurdgGnaoqbftj16Nvp


Home | Publier un mémoire | Une page au hasard

 > 

Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur l'alpha - amylase

( Télécharger le fichier original )
par Ihcen Khacheba
Université AMAR TELIDJI - LAGHOUAT - Ingénieur d'Etat en Biologie 2008
  
Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE AMAR TELIDJI-LAGHOUAT

FACULTE DES SCIENCES ET DE L'INGENIERIE

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

MEMOIRE DE FIN D'ETUDES

En vue de l'obtention du diplôme d'Ingénieur d'Etat en Biologie

Option : Génie Biologique

Thème

Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur l' -

Présenté par :

Encadré par :

KHACHEBA Ihcen

BENAMAR Hanane

Mr YOUSFI Mohamed

Mr DJERIDANE Amar

Juin 2008

Dédicace

Ce mémoire qui est le résultat et le fruit d'un travail de longue haleine, de nuits interminables, de recherche et de documentation, d'une multitude d'expériences au niveau du laboratoire et de contacts sans relâche pour des enquêtes ethnobotaniques sur le terrain.

Je le dédie avec grand amour

A ma mère Khadidja

A mon père Mohamed

A mes deux soeurs Hajer et Iness

Ces êtres chères qui m'ont tant aidé, orienté et conseillé et qui ont fait preuve d'une patience sans égal face à tous mes caprices d'étudiante exigeante, perfectionniste et infatigable

Qui n'ont jamais douté de moi et encouragé tout au long de mes études et leur soutien pendant cette longue et pénible épreuve que représente ce mémoire

Je leur dis tout simplement merci

Que dieu vous bénisse

Ihcen

Dédicace

À celui qui m'a indiqué la bonne voie en me rappelant que la science et la volonté forgent les grands esprits

À mon père

À celle qui m'a appris que la patience est la clé du succès et de la Victoire.

À ma mère

À celui qui m'a toujours soutenu et encourage psychologiquement

À mon frère

Et à ceux qui m'ont élevé et réchauffé durant mon enfance

Mes grands parents

Tous m'ont couvert avec la chaleur de leurs amours et leurs soutiens

Je leur dédie les premiers fruits de ma réussite et prie dieu le tout puissant de leur donner santé et longue vie

Ainsi à toutes les amies qui ont répondu à notre invitation.

Hanane

Remerciements

Ce travail a été réalisé au laboratoire des sciences fondamentales de l'université Amar Telidji - Laghouat - sous la direction du docteur YOUSFI Mohamed, maître de conférences à l'université de Laghouat.

Nous adressons nos remerciements à monsieur D. Benbertal directeur du laboratoire des sciences fondamentales de nous avoir accueilli et mis à notre disposition tout le matériel et réactifs nécessaires à la réalisation de ce travail.

À monsieur YOUSFI Mohamed, qui malgré ses nombreuses obligations, a accepté de nous encadrer et de nous choisir un thème. Nous sommes très honorés d'avoir pu bénéficier de son encadrement, il nous a accueilli dans son laboratoire avec la plus grande bienveillance, ses encouragements et sa confiance nous ont guidé tout au long de ce travail. Nous tenons à l'assurer de notre grande estime et en témoignage de notre profonde gratitude, nous lui adressons nos remerciements les plus sincères

À monsieur DJERIDANE .Amar, co - promoteur de ce mémoire, dont les remarques et compétences tout au long de ces trois mois de mémoire nous ont été très utiles. Nous tenons à lui présenter notre profonde reconnaissance. Nous garderons en mémoire ses grandes qualités, tant humaines, qu'intellectuelles, sa gentillesse et son humour.

Et on voudrait adresser plus particulièrement des remerciements plein de reconnaissance et de gratitude à nos professeurs des départements de biologie, d'agronomie et de chimie qui ont toujours été à la hauteur de leur noble mission d'enseignants assidus, ponctuels, attentifs et généreux.

Nos remerciements iront également à toutes les personnes qui, grâce à leur disponibilité et à leur bonne humeur, nous ont soutenu en rendant agréable les moments passés ensemble : Massouda, Hadjira, Kaltoum, Assia, Sarha et Linda.

Une pensée pour toutes nos amies étudiantes du département de biologie qui nous ont soutenues au cours de ces années.

À notre jury de mémoire, qu'il ne soit ainsi permis de vous remercier très sincèrement pour avoir spontanément accepté de juger ce travail et d'en être le rapporteur et tenons à vous assurer de notre considération la plus respectueuse.

Abréviations

ADN : acide désoxy ribo nucléique

ARN : acide ribo nucléique

°C : degré Celsius

CuSO4 : Sulfate de cuivre

DID : diabète insulino -dépendant 

DNID : diabète non insulinodépendant

DO : densité optique

g : gramme

HCl : acide chlorhydrique

[I] : Concentration de l'inhibiteur

Ki : constante d'inhibition

KM : constante de Michaelis et Menten

l: litre

ul : microlitre

M : molaire

uM : micromolaire

mg: milligramme

ml : millilitre

mM: Millimolaire

mmol : millimoles

 : Maturity Onset Diabetes in the Young

m/v: masse / volume

ppm: partie par millions

NaCl : chlorure de sodium

Na2CO3: Carbonate de sodium

nm: nanomètre

OH : groupement hydroxyle

pH : potentiel hydrogène

[S] : Concentration du substrat

UV : ultraviolet

Vmax : Vitesse maximale

XXème siècle : 20ème siècle

? : Alpha

MS : Matière sèche

Liste des figures

Partie bibliographique

Figure III . 1 : Variations de la vitesse initiale de la réaction enzymatique en fonction de la concentration en substrat. Figure III . 2 : Variation de 1 / V en fonction de 1 / [S]. Figure III . 3 :Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive. Figure III . 4 : Graphique Dixon d'inhibition compétitive. Figure III . 5 : Variation des pentes du graphique Lineweaver - Burk en fonction des [I] pour l'inhibition compétitive. Figure III . 6 : Graphique Lineweaver - Burk d'inhibition non compétitive. Figure III . 7 : Graphique Dixon d'inhibition non compétitive Figure III . 8 : Variation de 1 / V'max en fonction de [I] pour l'inhibition non compétitive. Figure III. 9 : Graphique Lineweaver - Burk d'inhibition incompétitive Figure III. 10 : Graphique Dixon d'inhibition incompétitive. Figure III . 11 : Variation de 1 / K'M en fonction de [I] pour l'inhibition incompétitive. Figure III . 12 : Variation de 1 / V'max en fonction de [I] pour l'inhibition incompétitive. Figure II . 13 : Variation des pentes du graphique Lineweaver - Burk en fonction des [I] pour l'inhibition mixte.

r Partie expérimentale r Figure I. 1 : Produits de dégradation de l' -amylase. Figure II. 1 : La courbe d'étalonnage de l'acide gallique. Figure II. 2: La courbe d'étalonnage de la rutine. Figure II. 3: La courbe d'étalonnage du maltose Figure II. 4 : La cinétique de l' - amylase Figure II. 5 : La représentation de Lineweaver ? burk de l' - amylase . Figure II. 6 : Représentation de Lineweaver ? burk de l'extrait aqueux la plante "Salvia officinalis" Figure II. 7 : Représentation graphique de Dixon de l'extrait aqueux de la plante "Salvia officinalis" Figure II. 8 : Représentation de Lineweaver ? burk de l'extrait méthanolique de la plante "Salvia officinalis" Figure II. 10 : Représentation graphique de l'extrait méthanolique de la plante "Salvia officinalis"

17

17

18

18

18

19

19

19

20

20

20

20

21

35

40

42

46

47

47

51

52

52

53

Liste des tableaux

Partie bibliographique

Tableau II . 1 : Les principales classes de composés phénoliques. Tableau IV. 1 : Quelques propriétés des - amylases.

Partie expérimentale

Tableau I . 1 : Noms des plantes investiguées et les différentes parties utilisées.

Tableau I . 2 : Nom, pharmacopée, et photo des plantes investiguées.

Tableau II . 1: Teneurs, aspects et couleurs des extraits aqueux.

Tableau II . 2 : La teneur en phénols totaux dans les 23 extraits aqueux.

Tableau II . 3 : La teneur en flavonoïdes dans les 23 extraits aqueux.

Tableau II . 4 : Teneurs, couleurs et aspects des extraits méthanoliques

Tableau II . 5 : La teneur en phénols totaux et flavonoïdes dans les 6 extraits méthanoliques.

Tableau II . 6 : Taux d'inhibition des 23 extrais aqueux.

Tableau II. 7 : Inhibition l' - amylase par les extraits aqueux et méthanloniques.

12

23

29

30

39

41

43

44

45

48

50

Table des matières.

Introduction

Partie bibliographique

I. Le diabète

1. Définition  

2. Classification

3. Les deux principales classes du diabète sucré 

3. 1. Diabète de type I 

3. 1. 1. Définition 

3. 1. 2. Circonstances d'apparition 

3. 1. 3. Signes cliniques

a- Les signes fonctionnels et généraux

b - Signes biologiques 

3. 1. 4. Traitements  

3. 2. Diabète de type II 

3. 2. 1. Définition 

3. 2. 2. Circonstances d'apparition

3. 2. 3. Les Signes 

3. 2. 4. Les traitements 

4. Complication

II. Les composés phénoliques 

1. Les polyphénols

1.1. Définition

1.2. Structure 

3. Localisation 

4. Classification 

1. 5. Le rôle des composés phénolique 

Importance biologique 

2. Les flavonoïdes

2. 1. Définition 

2. 2. Structure

3. 3. Localisation 

2. 4. Classification 

2. 5. Propriétés des flavonoïdes

III . Cinétique enzymatique et inhibition

1. Définition d'une enzyme 

2. Le site actif 

3. Théorie de Michaelis et Menten

4. Méthode de Lineweaver et Burk

5. Graphiques de Dixon

6. Inhibition enzymatique 

6. 1. Définition 

6. 2. Différents types d'inhibiteurs 

6. 2. 1. Inhibition compétitive

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition compétitive

6. 2. 2. Inhibition non compétitive :

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition non compétitive

6. 2. 3. Inhibition incompétitive 

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition incompétitive

6. 2. 4. Inhibition mixte

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition mixte

IV . L' - amylase

1. Définition

2. Localisation de ces enzymes 

3. Attaque des grains d'amidon par les - amylases 

4. Structure du site catalytique

5. Mécanisme d'action 

6. Les acides aminés impliqués dans le mécanisme catalytique

6. 1. Localisation 

6. 2. Identification 

7. Produits formés

8. L'inhibition de l' - amylase

Partie expérimentale

I. Méthodes d'études:

1. Choix des plantes

2. Préparation des extraits

3. Dosage des composés phénoliques 

3. 1. Dosage des phénols totaux 

3. 1. 1. Principe 

3. 1. 2. La courbe d'étalonnage de l'acide gallique

3. 2. Dosage des flavonoïdes

3. 2. 1. Principe 

3. 2. 2. La courbe d'étalonnage  de la rutine

4. Cinétique de l' -amylase 

4. 1. La courbe d'étalonnage du maltose 

4. 2. Dosage de l'activité enzymatique de l'?-amylase 

5. Tests d'inhibition 

II. Résultats et discussions

1. Analyse des extraits aqueux

1. 1. Teneurs des extraits aqueux

1. 2. Quantité des phénols totaux des extraits aqueux

1. 3. Quantité des flavonoïdes dans les extraits aqueux

2. Cinétique de l' -amylase 

3. Tests d'inhibition

4. Evaluation de l'effet inhibiteur des extraits sur l' - amylase

Conclusion

Bibliographie

Annexe 1

Annexe 2

Annexe 3

2

6

6

7

7

7

7

7

7

7

8

8

8

8

9

9

9

11

11

11

11

11

13

13

13

13

13

14

14

14

16

16

16

17

17

17

17

17

17

18

18

19

19

20

20

21

23

23

24

24

24

25

25

25

25

26

29

32

32

32

32

32

33

33

33

33

36

36

37

37

39

39

40

42

48

49

55

58

62

65

71

Introduction

On a longtemps employé des remèdes traditionnels à base de plantes sans savoir à quoi étaient dues leurs actions bénéfiques. (Bahorun. T, 1997)

En Algérie la liste de plantes entrant précisément dans ce cadre est exhaustive. Elles sont utilisées sous forme de tisanes, extraits ou préparations complexes, sans savoir les molécules responsables de l'action. En effet, certains effets pharmacologiques prouvés sur l'animal aient été attribués à des composés tels que les alcaloïdes et dérivés, des terpènes, des stéroïdes et des composés polyphénoliques.

Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts multiples mis à profit dans l'industrie : en alimentation, en cosmétologie et en dermopharmacie. Parmi ces composés, on retrouve dans une grande mesure les métabolites secondaires qui se sont surtout illustrés en thérapeutique. La Pharmacie utilise encore une forte proportion de médicaments d'origine végétale, pour la recherche plantes des molécules actives nouvelles, ou des matières premières pour la semi synthèse. (Bahorun. T, 1997)

Le présent travail entre dans le cadre de la valorisation de quelques plantes médicinales locales, utilisées en thérapeutique traditionnelle dans la région de Laghouat, comme antidiabétique. L'intérêt de ces plantes, est lié aux différents principes actifs qu'elles renferment. On distingue parmi eux, les composés phénoliques dont de nombreux travaux ont été consacrés ces dernières années à l'étude de leurs propriétés chimiques et biologiques ainsi que de leurs mécanismes d'actions. La structure chimique de ces substances leur confère une capacité très développée pour réagir avec toutes sortes de molécules, essentiellement les protéines. (Djelili farida et al, 2008).Certains polyphénols jouent un rôle très important dans l'inhibition des enzymes digestifs y compris l' - amylase.

L' - amylase, est l'enzyme clé de la première étape du processus digestif des hydrates de carbone. D?où, une augmentation de la glycémie. Les inhibiteurs de cette enzyme retardent et prolongent l'hydrolyse des hydrates de carbone, en évitant la monté du taux de glucose plasmatique par la réduction de son taux d'absorption (Megh Raj Bhandari et al, 2008)

2

L'objectif de notre travail est la confirmation de l'activité antidiabétique de ces plantes par l'inhibition de l'enzyme clé qui est l' -amylase.

Notre travail sera réalisé selon les étapes suivantes:

La première partie est consacrée à une étude bibliographique sur le diabète un aperçu général sur les composés phénoliques ainsi qu' un rappel sur la cinétique enzymatique.

La deuxième partie est réservée à la description du protocole expérimental

L'interprétation et la discussion des résultats obtenus serait présentées dans la dernière partie.

3

Partie bibliographique

L'activité biologique connaît, des accidents et des anomalies. Celles-ci se manifestent chez le sujet qu'elles atteignent par des troubles, passagers ou permanents, bénins ou graves, parmi lesquels la douleur, la souffrance, le malaise, ect. Certains de ces troubles peuvent être suffisamment graves pour interrompre les fonctions vitales et leur arrêt, souvent après des jours ou des mois de souffrances intolérables.

Certaines maladies sont passagères, maîtrisables et dont les causes sont connues tel les maladies infectieuses, maladies des dents et des gencives (Caratini Roger, 1985). D'autres maladies sont permanentes, et n'ont pas de cause connue, mais le système biologique affecté peut être identifié. (Encarta, 2006) Tel les cancers, les maladies immunologiques, hématologiques, endocriniennes et métaboliques. Le métabolisme des glucides est l'un des métabolismes qui peut être déréglé provocant ainsi le diabète pancréatique (Caratini Roger , 1985).

1. Définition:

Le mot « diabète » vient du grec ancien dia-baïno, qui signifie « passer au travers ». Les médecins grecs avaient observé que les malades semblaient uriner aussitôt ce qu'ils venaient de boire, comme s'ils étaient « traversés par l'eau » sans pouvoir la retenir (Wikipedia).

Le diabète pancréatique est aussi appelé diabète sucré (= maladie de Willis) car est marqué biologiquement par une élévation importante du taux de glucose dans le sang et l'apparition de sucre dans l'urine. Chez un sujet normal, le taux de glucose sanguin ou glycémie est comprie entre 4,5 et 6,1 mmol/l, au-delà de 6,1 mmol/l à jeun, on parle d'hyperglycémie, au dessous de 4,5 mmol/l on parle d'hypoglycémie (Caratini Roger, 1985).

2. Classification: (Wikipedia)

Différentes formes de diabète sont répertoriées, en fonction de leur  :

Les diabètes de (Maturity Onset Diabetes in the Young), englobant plusieurs formes de diabètes héréditaires.

Le , des diabètes secondaires à des maladies, notamment celles du pancréas ( notamment).

6

Le , lié à un défaut de la réabsorption d'eau au niveau du rein, se manifestant par des urines abondantes et non sucrées.

Le , lié à un défaut de réabsorption du glucose par le rein, donnant une urine sucrée ( ) sans anomalies de la glycémie.

Le diabète secondaire à une mutation de l'ADN mitochondrial (associé à une surdité de perception et caractérisé par une hérédité maternelle).

Le diabète lipoatrophique : caractérisé par la disparition du , avec insulino-résistance majeure.

3. Les deux principales classes du diabète sucré :

3. 1. Diabète de type I :

3. 1. 1. Définition :

Autrefois appelé « diabète insulino-dépendant » (DID, ou encore diabète juvénile), cette maladie est une forme de qui apparaît le plus souvent de manière brutale chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Le diabète de type 1 est une , aboutissant à une destruction totale des cellules bêta des . Ces cellules sont chargées du contrôle de la (taux de glucose dans le sang), par la production d' en fonction de la glycémie : ainsi, en cas d'hyperglycémie, l'insuline est produite en plus forte quantité. (Wikipedia)

3. 1. 2. Circonstances d'apparition :

Le début est rapide, voire brutal dans 80 % des cas. L'évolution de la maladie est accélérée par les infections, stress et autres chocs, ce qui fait que le diagnostic se fait souvent lors de consultations pour autre chose. Cependant, cela ne veut en aucun cas dire que l'infection présente est la cause du diabète. (Wikipedia)

3. 1. 3. Signes cliniques : (Wikipedia)

a- Les signes fonctionnels et généraux :

Une importante.

Une parallèle.

Un amaigrissement rapide de plusieurs kilos.

Infections favorisées par l'hyperglycémie.

Des maux de tête et d'estomac ainsi que des nausées.

b - Signes biologiques :

La glycosurie (quantité de glucose dans les urines).

L'hyperglycémie.

7

L'hémoglobine glyquée (dosage de fraction de l' ) le taux chez un diabétique peut être supérieur à 10 %.

Auto-anticorps.

3. 1. 4. Traitements :

Les diabétiques de type I doivent s'injecter de l'insuline plusieurs fois par jour tout au long de leur vie et manger de manière équilibrée. Cet équilibre glycémique étant précaire, traitement et alimentation varient au jour le jour en fonction des circonstances (activités, émotions, horaires, maladies, etc.). Le diabétique se doit donc d'être autonome dans sa gestion de la maladie. (Wikipedia)

3. 2. Diabète de type II :

3. 2. 1. Définition:

Le « diabète de type 2 » ou « diabète non insulinodépendant » (DNID) (aussi appelé « diabète insulinorésistant » ou « diabète de l'âge mûr »), est une maladie touchant la provoquant à terme un . Sur le plan physiopathologique, le diabète non insulinodépendant se caractérise par une résistance à l'insuline de l'organisme (Wikipedia), l'insulinorésistance décrite entraîne pendant 10 à 20 ans un hyperinsulinisme (A. Grimaldi, 2000). Le fabrique de plus en plus d'insuline (Wikipedia), permettant pendant des années de maintenir la glycémie à jeun (A . Grimaldi, 2000) jusqu'a l'épuisement et lorsque la quantité d'insuline ne suffit plus à contrer les résistances, le taux de sucre devient anormalement élevé. (Wikipedia) L'insulinémie décroît progressivement en même temps que la glycémie augmente à jeun. (Grimaldi. A, 2000)

3. 2. 2. Circonstances d'apparition :

Le diabète de type 2 résulte d'une interaction entre des facteurs génétiques et des facteurs d'environnement (Roberfroid Marcel B, 2002). Ainsi que suite à la prise de certaines médications (par exemple, l'utilisation prolongée de ). Il y a également un puissant facteur dans l'étiologie de cette maladie : avoir des membres de la famille atteints de diabète de type 2. La majorité des patients atteints du diabète de type 2 sont obèses - l'obésité chronique induit une résistance accrue à l'insuline qui peut évoluer en diabète. Le diabète de type 2 a plus de risque d'apparaître s'il y a manque d'activité physique, une alimentation riche (graisses, sucres). (Wikipedia)

3. 2. 3. Signes :

8

Le diabète de type 2 est généralement asymptomatique durant de longues années, son dépistage et son diagnostic reposent sur l'examen biologique de la glycémie à jeun ou après stimulation par l'ingestion de sucre (glycémie post-prandiale ou hyperglycémie provoquée).À la différence du diabète de type 1, les symptomes et complications du diabète de type 2 apparaissent tardivement dans l'évolution de la maladie. Mais il peut parfois être difficile de faire la différence entre ces deux maladies notamment chez l'adolescent. (Wikipedia)

3. 2. 4. Les traitements : (Wikipedia)

Les mesures hygiéno-diététiques : Le diabète de type 2 est traité au départ par des mesures de régime et par la . Dans cette perspective, la pratique d'exercices physiques, éventuellement dans le cadre d' est recommandée.

Les traitements oraux : un traitement par des antidiabétiques oraux ex : .

Traitement préventif : Il repose essentiellement sur une perte de poids et l'exercice physique.

4. Complication:

Le diabète peut résulter en conséquences lourdes pour la santé. Le diabète est un facteur de risque important de :

.

.

.

Des tissulaires, conduisant à l' .

Le diabète est une maladie aggravant l'invalidité, provocant la diminution de l'espérance de vie, et engendrant de forts coûts médicaux. (Wikipedia)

9

1. Les polyphénols :

1. 1. Définition :

Le terme polyphénol a été introduit en 1980. (wikipedia). Les composés phénoliques ou polyphénols constituent une famille de molécules organiques largement présente dans le règne végétal (wikipedia), se sont des métabolites secondaires, caractérisés par la présence d'un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec un glucide.( Boizot N et Charpentier J. P,2006).

1. 2. Structure :

Les polyphénols naturels regroupent un vaste ensemble de substances chimiques (wikipedia). L'élément fondamental qui les caractérise est la présence d'au moins un noyau benzénique (aromatique), auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, ou hétéroside. (Laraoui. H, 2007) Ils peuvent aller de molécules simples, comme les acides phénoliques, à des composés hautement polymérisés, de plus de 30000 Dalton, comme les tanins. (wikipedia)

3. Localisation :

Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs (racines, tiges, feuilles, fleurs, pollens, fruits, graines et bois) .( Boizot N et Charpentier J. P,2006). Ils sont présents aussi dans diverses substances naturelles : dans les fruits rouges, le raisin (en relation avec les ), dans les , et sous forme de dans le , dans les , les ......etc. (wikipedia) Parmi les composés phénolique, dont 8000 sont connus : les flavonoïdes, les quinones phénoliques, ligans, les xanthomes, les coumarines et d'autres classes existent en nombre considérable (Laraoui. H, 2007).

4. Classification :

Les composés phénoliques sont commodément classés selon le nombre d'atomes de carbone dans le squelette de base. (Laraoui. H, 2007). Les différentes classes principales de ces composés phénoliques isolées des plantes sont illustrées dans le (tableau II. 1)

11

Tableau II . 1 : Les principales classes de composés phénoliques. (Macheix Jean-jacques et al , 2005)

Squelette carboné

Classe

Exemple

Origine

C6

C6 - C1

C6 - C3

C6 - C4

C6 - C2- C6

C6 - C3- C6

(C6 - C3)2

(C6 - C3)n

(C15)n

Phénols simples

Acides hydroxybenzoiques

Acides hydroxycinamiques

Coumarines

Napthoquinones

Stilbènes

Flavonoides

Flavonols

Anthocyanes

Flavonols

Flavonones

Isoflavonoides

Lignanes

Lignines

Tannins

Cathécol

P - hydroxybenzoique

Acides caféique, férulique

Scopolétine, esculétine

Juglone

Resvératrol

Kaemférol, quercétine

Cyanidine, pélargonidine

Catéchine, épicatéchine

Narigénine

Daidzéine

pinorésinol

Epices, fraise

Pomme de terre, pomme

Citrus

Noix

Vigne

Fruits, légumes, fleurs

Fleurs, fruits rouges

Pomme, raisin

Citrus

Soja, pois

Pin

Bois, noyau des fruits

Raisin rouge, kaki

Les formules chimiques de chaque exemple sont regroupées dans (Annexe 1)

12

5. Le rôle des composés phénolique : (Macheix Jean - Jacques et al, 2005)

Le rôle des composés phénoliques est maintenant reconnu dans différents aspects de la vie de la plante et dans l'utilisation que fait l'homme des végétaux. Ils peuvent en effet intervenir :

Dans certains aspecs de la physiologie de la plante.

Dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique.

Dans les critères de qualité.

Importance biologique :

12

Les métabolites secondaires font l'objet de nombreuses recherches, Ceci est notamment le cas des polyphénols végétaux (Bahorun.T, 1997) qui prennent une importance croissante notamment, à cause de leurs effets bénéfiques sur la santé (Wikepedia), dans la protection de l'homme vis - à - vis de certaines maladies, en raison de leur action possible avec de nombreuses enzymes. (Macheix Jean - Jacques et al, 2005)

Ils sont largement utilisés en thérapeutique comme vasculoprotecteurs, anti-inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques, antiradicaires et antioxydants (Bahorun. T, 1997). En effet, leur rôle d'antioxydants naturels suscite de plus en plus d'intérêt pour la prévention et le traitement du cancer, des maladies inflammatoires et cardiovasculaires . Ils sont également utilisés comme additifs pour l'industrie agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique (wikipedia), en particulier les flavonoïdes et les proanthocyanidines. (Bahorun.T, 1997)

2. Les flavonoïdes :

2. 1. Définition :

Les flavonoïdes ont été découverts par . Le terme flavonoïde (ou bioflavonoïde) est attribué à une classe de secondaires (wikipedia). Le terme « flavonoïdes »  désigne une très large gamme de composés naturels, appartenants à la famille des polyphénols. Ils sont considérés comme les pigments quasiment universels des végétaux. (Portet Bénédicte, 2007)

2. 2. Structure :

13

Tous les flavonoïdes (plus de 4000) (Portet Bénédicte, 2007) présentent un squelette de base à 15 atomes de carbone, fait de deux cycles en C6 reliés par une chaîne en C3. Le pont à 3 carbones entre les deux phényles forme généralement un troisième cycle pyrone.

Ils couvrent une grande gamme de couleur du rouge à l'ultraviolet en passant par le jaune. Leur couleur dépend de leur structure mais aussi de l'acidité du milieu ( ), on en trouve aussi de nombreux sous forme d' . On en retrouve dans le rouge des et des , dans les baies de , le , le raisin. On donne aux pigments flavonoïdes le nom d' . (Wikipedia).

3. 3. Localisation :

Les flavonoïdes sont largement rencontrés dans le règne végétal. Ils sont cependant rares chez les végétaux inférieurs. Par contre, on les trouve en abondance dans les familles suivantes : Polygonacees, Rutacees, Legumineuses, Apiacees et Asteracees

De plus, leur localisation au sein de la plante est caractéristique. En effet, les flavonoïdes ce répartissent volontiers dans les organes aériens jeunes (jeunes feuilles, boutons floraux) où ils sont localisés dans les tissus superficiels. Ils se répartissent aussi volontiers dans les racines.Au niveau cellulaire, les flavonoïdes sont dissous dans le suc vacuolaire ou localisés dans les chloroplastes et les membranes des végétaux. (Hadi Milaine, 2004)

Chez les angiospermes, la diversité structurale des flavonoïdes est maximale. Ils sont de façons très générale localisés dans les feuilles, dans les fleurs ou encore dans les fruits (Portet Bénédicte, 2007).

2. 4. Classification :

Ils peuvent être regroupés en une douzaine de classes selon le degré d'oxydation du noyau pyranique central. (Portet Bénédicte, 2007) Ce groupe de molécules comporte plusieurs classes : les flavanones, les isoflavonoïdes, les flavones, les flavonols ainsi que les anthocyanidines. (Girotti - Chanu Catherine, 2006)

2. 5. Propriétés des flavonoïdes :

Ce sont des molécules douées de plusieurs propriétés biologiques : Propriétés anti - inflammatoires, antivirales et antibactériennes, anti - carcinogènes, antioxydante, pro - oxydante (Hadi Milaine, 2004). Inhibitrices d'enzymes, elles sont impliquées dans d'importantes fonctions cellulaires, en affectant l'activité de nombreux systèmes enzymatiques in vitro mais également in vivo. Certaine possèdent des propriétés lypolitiques, protectrices de l'ADN (Girotti - Chanu Catherine, 2006)

14

Les réactions chimiques de la vie sont sous la dépendance des enzymes. Ces catalyseurs remarquables sont tous spécifiques pour des réactions données. Dans l'ensemble, les enzymes sont très versatiles, dans la mesure où des quelques milliers d'enzymes actuellement connues catalysent des réactions aussi diverses que : hydrolyse, polymérisation, transferts de groupes fonctionnels, oxydo-réduction, déshydratation et isomérisation. L'enzyme, n'est pas des surfaces passives sur lesquelles se déroulent les réactions, mais plutôt des machines moléculaires qui fonctionnent grâce à des mécanismes très variés. (Voet Donald et Voet Judith C, 1995)

1. Définition d'une enzyme :

Une enzyme, est une molécule protéique, [à l'exception de quelques unes dont leur structure chimique est une association d'une partie protéique (apoenzyme) et d'une partie non- protéique (cofacteur) ] ou ARN dans le cas des ribozymes). Agissant comme catalyseur, permettant d'accélérer jusqu'à des millions de fois les réactions chimiques du métabolisme se déroulant en chaque instant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire. (Wikipedia) Ella modifie la vitesse d'une réaction sans être elle -même modifiée. Les enzymes sont hautement spécifiques et leur activité peut être régulée. (Hames. B.D et al, 2000)

2. Le site actif :

Le site actif d'une enzyme est la région qui fixe le substrat et le convertir en produit. Il s'agit en général, d'une petite partie de l'ensemble de la molécule d'enzyme, et c'est une entité tridimensionnelle formé par des acides aminés, pouvant être éloignés sur la chaîne polypeptidique linéaire. Le site actif est souvent une crevasse ou une fissure à la surface de l'enzyme, formant un environnement essentiellement apolaire qui favorise la liaison du substrat. Le ou les substrats sont liés au site actif par de multiples interactions faibles (interaction électrostatique, liaisons hydrogène, liaison de Vander Walls et interaction hydrophobe). Certains cas par liaisons covalentes réversibles. (Hames. B.D et al, 2000)

3. Théorie de Michaelis et Menten :

16

Au début du XXème siècle, Maud Menten et Leonar Michaelis se sont intéressés à la cinétique des réactions enzymatiques. Après des développements mathématiques complexes, ils ont pu définir un paramètre lumineux de la cinétique enzymatique, la constante de Michaelis -Menten (KM). Elle correspond à la concentration en substrat pour la quelle la vitesse est égale à la moitié de Vmax. La cinétique de Michaelis - Menten décrit les variations de la vitesse initiale de la réaction enzymatique en fonction de la concentration en substrat. Le model considère une quantité fixe d'enzyme. (Horn Florian et al, 2005)

La vitesse de la réaction pour une concentration déterminée de substrat est donnée par la relation de Michaelis -Menten :

Vmax X [S]

V =

[S] + KM

Figure III . 1 : Variations de la vitesse initiale de la réaction enzymatique en fonction de la concentration en substrat. (Horn Florian et al,2005)

4. Méthode de Lineweaver et Burk: (Horn Florian et al,2005)

Pour préciser la valeur de Vmax, Lineweaver et Burk ont développé une méthode graphique en inversant les deux termes de la relation de Michaelis -Menten.

Lineweaver et Burk ont développés une méthode graphique en inversant les deux termes de la relation de Michaelis -Menten. Ceci donne :

[S] + KM

1 / V =

Vmax X [S]

Figure III. 2 : variation de 1 / V en fonction de 1 / [S] (Horn Florian et al,2005)

5. Graphiques de Dixon:

En 1953, Dixon a proposé une façon alternative pour déterminer la valeur de Ki, en utilisant un graphique de 1 / V = f ([I]). Dans un graphique de Dixon, les droites déterminées à différentes concentrations de substrat se croisent à -Ki. (Keillor Jeffrey W, 2004)

6. Inhibition enzymatique :

6. 1. Définition :

17

D'une manière générale, un inhibiteur est tout composé dont la fixation sur la molécule enzymatique entraîne son inactivation partielle (ou totale), ce qui se traduit par une baisse (ou une annulation) de la vitesse initiale. (Weil Jacques-Henry, 2001).

6. 2. Différents types d'inhibiteurs :

6. 2. 1. Inhibition compétitive :

Un inhibiteur compétitif entre en compétition avec les molécules de substrat pour se lier au site actif de l'enzyme. L'effet d'un inhibiteur compétitif peut être réversible à des concentrations élevées de substrat.Sur la représentation de Lineweaver-Burk, un inhibiteur compétitif peut être reconnu du fait qu'il augmente KM mais laisse Vmax inchangée (Hames B.D et al, 2000)

Figure III . 3 : Graphique Lineweaver - Burk Figure III . 4 : Graphique Dixon

d'inhibition compétitive (Keillor J. W, 2004) d'inhibition compétitive. (Keillor J. W, 2004)

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition compétitive

On peut déterminer la valeur de Ki à l'aide d'un graphique. Il s'agit de la préparation d'un graphique secondaire des pentes du graphique Lineweaver-Burk en fonction des concentrations d'inhibiteur L'abscisse à l'origine donne la valeur de Ki (Keillor Jeffrey W, 2004)

18

Figure III . 5 : Variation des pentes du graphique Lineweaver - Burk en fonction des [I] pour l'inhibition compétitive. (Keillor Jeffrey W, 200

6. 2. 2. Inhibition non compétitive :

Un inhibiteur non compétitif se lie à un site autre que le site actif de l'enzyme et diminue la vitesse réactionnelle de l'enzyme en modifiant sa conformation tridimensionnelle. L'effet d'un inhibiteur non compétitif ne peut être inversé par une élévation des concentrations du substrat. Sur la représentation de Lineweaver-Burk d'un inhibiteur non compétitif, on visualise une diminution de Vmax mais une invariance de KM (Hames B.D et al, 2000)

Figure III . 6 : Graphique Lineweaver - Burk Figure III . 7 : Graphique Dixon d'inhibition non D'inhibition non compétitive . (Keillor J. W, 2004) compétitive. (Keillor J. W, 2004)

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition non compétitive  :

La détermination des valeurs de Ki peut ce faire à l'aide d'un graphique. les valeurs de1 / V'max , sont obtenues directement de l'ordonné à l'origine du graphique Lineweaver-Burk en fonction des concentrations. L'abscisse à l'origine donne la valeur de Ki (Keillor Jeffrey W, 2004)

19

Figure III . 8 : Variation de 1 / V'max en fonction de [I] pour l'inhibition non compétitive. (Keillor Jeffrey W, 2004)

6. 2. 3. Inhibition incompétitive :

Dans un système ou l'inhibiteur se combine de façon réversible exclusivement au complexe enzyme - substrat, l'effet est une inhibition dite in compétitive. Elle n'est pas levée par l'addition de substrat. (Weinman Serge, 2004).

Figure III . 9 : Graphique Lineweaver - Burk Figure III . 10 : Graphique Dixon d'inhibition

d'inhibition incompétitive. (Keillor J. W, 2004) incompétitive. (Keillor J. W, 2004)

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition incompétitive :

La détermination des valeurs de Ki peut se faire à l'aide d'un graphique. les valeurs 1 / K'M ou de 1 / V'max , sont obtenues directement des axes x et y du graphique Lineweaver-Burk, en fonction des concentrations. L'abscisse à l'origine donne la valeur de Ki (Keillor Jeffrey W, 2004)

Figure III . 11 : variation de 1 / K'M en fonction Figure III . 12 : variation de 1 / V'max en fonctionde [I] pour l'inhibition incompétitive. (Keillor J. W. de [I] pour l'inhibition incompétitive.

20

, 2004) (Keillor J. W, 2004)

6. 2. 4. Inhibition mixte :

Si l'enzyme et le complexe enzyme - substrat fixent tous les deux l'inhibiteur, (Voet Donald et Voet Judith C, 1995), mais avec des affinités différentes (Wikipedia) dans ce cas de figure l'inhibition est appelée inhibition mixte. (Voet Donald et Voet Judith C, 1995) 

A - Détermination des valeurs de Ki pour l'inhibition mixte :

La détermination des valeurs de Ki peut se faire à l'aide d'un graphique. Les valeurs de K'M / Vmax sont obtenues directement des ordonnées à l'origine du graphique Lineweaver-Burk, en fonction des concentrations L'abscisse à l'origine donne la valeur de Ki (Keillor Jeffrey W., 2004)

Figure II . 13 : Variation des pentes du graphique Lineweaver - Burk en fonction des [I] pour l'inhibition mixte. (Keillor Jeffrey W, 2004)

21

1. Définition :

Les - amylases existent dans le règne animal, végétal et microbien. (Baron. A et al, 1985). Elles apparaissent au cour de la germination des céréales. Elles sont aussi présentes dans la salive et dans le suc pancréatique. (Weil Jacques-Henry, 2001). Les - amylases salivaires et pancréatiques ont été les plus étudiées à cause de leur accessibilité et de leur rôle dans les phénomènes de digestion chez les mammifères. (Baron A et al, 1985).

Les - amylases (1, 4 - - D ? glucane, 4 glucanohydrolase; EC 3. 2. 1. 1) ont la capacité d?hydrolyser les liaisons de types - (1,4) à l?intérieur des chaînes d?amidon. Ce sont donc des endo ? enzymes. (Lévêque Emmanuel et al, 2000)

Plusieurs - amylases végétales, animales (mammifères) et microbienne (bactériennes, fongique ?. Ect) ont été purifiées et étudiées. (tableau IV . 1)

Tableau IV. 1 : Quelques propriétés des - amylases. (Baron. A et al, 1985)

Enzymes d'origine

Poids moléculaire

pH optimal

Température optimale (°C)

Animal :

Salive humaine

Pancréas de porc

Végétale

Malt d'orge

Blé

Microbienne

Bacillus coagulans

Aspergillus oryzae

50 000

50 000

59 500

59 500

49 000

52 600

6,9

6,9

4,7 - 5,4

4,6

5,2

5,5 - 6,9

40

37

50 -55

60 - 66

57

40

2. Localisation de ces enzymes :

La majeure partie des - amylases se trouve à l?extérieur des cellules productrices : en effet, l?amidon étant une grosse molécule, il ne peut pénétrer à l?intérieur des cellules pour y être digérer. Ces dernières sont donc contraintes de sécréter leurs - amylases dans le milieu extracellulaire. Ces enzymes peuvent alors attaquer l?amidon et libérer des sucres de plus petite taille, capables de franchir les barrières cellulaires (membrane et parois). (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

23

3. Attaque des grains d'amidon par les - amylases :

Leur action sur le grain d'amidon natif semble être liée aux possibilités de pénétration de l'enzyme à l'intérieur du grain et en particulier, à ses possibilités d'attaque en surface. De ce fait, chaque grain appartenant à une population d'un type d'amidon donné, a sa propre sensibilité à l'attaque de l'enzyme. On distingue généralement, les amidons faciles à s'hydrolyser par l' - amylase (amidon de céréales et de légumineuses à teneur normale en amylose) et les amidons plus résistants à l? - amylase (amidon de pomme de terre). (Baron A et al, 1985)

L'attaque du grain d'amidon se fait essentiellement au niveau de l'amylose. Les - amylases capables d?hydrolyser l?amidon natif (insoluble et sous forme de granules) possèdent un site de fixation à l?amidon natif. Ce site, nommé strach ? binding ? domain (SBD), qui est situé, dans la majorité des cas dans la partie C ? terminale de la protéine, et est éloigné du site actif de l?enzyme. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

L'action des - amylases sur les chaînes d?amidon est séquentielle : l?enzyme se fixe au hasard sur la chaîne puis poursuit son attaque en se déplaçant le long de la chaîne d?amidon. Lorsqu?elle rencontre une liaison de type - (1,6) elle ne peut pas l?hydrolyser et s?arrête donc. Elle se décroche alors de la chaîne d?amidon et va initier un nouveau site d?attaque à un endroit différent. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

4. Structure du site catalytique :

Le site catalytique des - amylases peut être subdivisé en plusieurs sous ? sites numérotés à partir de celui qui lie le glucose le plus proche de l?extrémité non ? réductrice du substrat. Un sous ? site peut être défini comme une partie du site actif capable d?interagir avec un résidu glucose du substrat. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

Les spécificités des enzymes amylolytiques pourraient également s'expliquer par le nombre de leurs sous - sites, par la nature des acides aminés formant ces sous - sites et par la localisation des acides aminés catalytiques au niveau de ces sous - sites. Par exemple, les glucoamylases fongiques possèdent généralement sept sous - sites tandis que l' - amylase d?Aspergillus oryzae en possèderait six. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

5. Mécanisme d'action :

24

Les - amylases catalysent la dégradation de l?amidon par un mécanisme catalytique acide dans lequel le « catalyseur général » - l?acide aminé à l?origine de l?attaque ? est un acide glutamique. Ce résidu agirait en protonant (ajout d?un ion H +) l?oxygène de la liaison glycosidique à couper. Lors de la seconde étape de la réaction catalytique, dans la majorité des cas, le carbone C1 impliqué dans la liaison glucosidique subit une attaque nucléophile, soit par une molécule d?eau activée par l?acide aspartique, soit directement par cet acide aspartique. Dans ce dernier cas, un second acide aspartique activerait ensuite une molécule d?eau pour permettre l?hydrolyse au niveau du carbone C1.

Pour la grande majorité des - amylases, l?ion calcium Ca2+ a un effet positif sur leur activité enzymatique. En contrôlant la géométrie du site actif de ces enzymes, il régule leur activité. Les - amylases peuvent donc être considérées comme étant des métallo ? enzymes « enzymes nécessitant un ion métallique pour leur activité. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

Cependant, si le calcium, à faibles doses, a un effet activateur sur les - amylases, cette activation peut diminuer, à des doses élevées, pour certaines de ces enzymes. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

6. Les acides aminés impliqués dans le mécanisme catalytique :

6. 1. Localisation :

Les acides aminés impliqués dans le mécanisme général de la catalyse étaient communs à la plupart des enzymes amylolytiques. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)Les acides aminés impliqués dans la catalyse ou dans la fixation du substrat sont localisésdans la partie C - terminale des feuillets ou à l?intérieur des boucles reliant un feuillet à une hélice .( Lévêque Emmanuel et al , 2000)

6. 2. Identification :

Chez les - amylases, il y?a neuf acides aminés invariants : Asp 117, Val 119, His 122, arg 204, Asp 206, Lu 230, His 296 et Gly 323, huit d?entre eux appartiennent au site actif.

L'acide glutamique 230 semble jouer un rôle important dans la catalyse. Ce résidu serait un donneur de proton et aurait donc une fonction de catalyseur général acide. De même, l'acide aspartique 297 jouerait le rôle de catalyseur général, basique. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

7. Produits formés :

25

L'action des - amylases sur les chaînes d?amidon aboutit, dans le cas des chaînes linéaires (amylose), à l?hydrolyse totale en unités de maltose. Mais dans le cas de l?amylopectine, l?hydrolyse des liaisons - 1,4 - glucosidiques se fait mal au voisinage des points de ramification et, en outre les liaisons - 1,6 - glucosidiques qui constituent ces points de ramification ne sont pas attaquées. D?où l?obtention d?un mélange de maltotriose et de dextrines résiduelles (ou dextrines limites) formées d?oligo ? et polyosides branchés (Weil Jacques-Henry, 2001). Ces polyosides de 3 à 5 résidus de glucose contiennent toute des liaisons - 1,6 de la macromolécule d?origine. (Baron. A et al, 1985) Et plus rarement l?obtention de glucose. (Lévêque Emmanuel et al , 2000)

Les produits d'hydrolyse de l'amidon varient selon l'origine de l' - amylase, celle du substrat et les conditions d?hydrolyse.

Cela permet de classer les - amylases en deux catégories :

Les - amylases liquéfiantes qui hydrolysent 30 à 40 % de l?amidon.

Les - amylases saccharifiantes qui peuvent hydrolyser jusqu?à 50 à 60 %. de l?amidon.

8. L'inhibition de l' - amylase :

Pour agir sur une voie métabolique, il faut disposer d'un médicament effecteur agissant spécifiquement sur un enzyme de cette voie métabolique (Horn Florian et al 2005).

L' - amylase de mammifère, sécréter par la glande pancréatique comme étant une enzymes glycolytiques à travers le suc pancréatique dans l?intestin, est l?enzyme clé qui catalyse la première étape du processus digestif des hydrates de carbone (glucides).

D'où, les inhibiteurs de l'hydrolyse des hydrates de carbone par l' - amylase dans le tractus digestif retardent leur digestion et prolongent son temps, causant une réduction dans le taux d?absorption du glucose (Megh Raj Bhandari et al 2008), et par conséquent diminution des niveaux de glucose plasmatique et abaissement de l?hyperglycémie. (Hong Gao et al 2008)

.

26

Partie expérimentale

1. Choix des plantes:

Dans un premier temps, nous avons commencé notre étude par une collecte d'information sur les plantes antidiabétiques utilisées par la population locale de la ville de Laghouat. Cette enquête nous a permis de recenser vingt et une plantes. Les noms des plantes ainsi que les parties utilisées de chaque plante sont résumées dans le (Tableau I. 1)

Tableau I. 1 : Noms des plantes investiguées et les différentes parties utilisées

Partie utilisée

Nom de la plante

Commun

Systématique

Toute la partie aérienne

Les résines

Les fleurs

L'écorce

Les feuilles et les tiges

Les grains

Les feuilles

Toute la partie aérienne

Les fleurs

Toute la partie aérienne

Toute la partie aérienne

Toute la partie aérienne

Les feuilles

Les feuilles

Les gousses

Les feuilles

Les grains

Les fleurs

Toute la partie aérienne

Toute la partie aérienne

Les fleurs

Les grains

Toute la partie aérienne

Chendgoura

marou' esabr

Nougd

Oud griss

El kassa

Denb el kail

Moraret el hanech

Remth

Reguig

Tmiroute

Gardoufa

Tassalhine

Hinaina

Henet el ibil

Gouzeh

Arfage

Siwak el nabie

Jiaida

Thafsia

Helba

Agga

Ajuja iva

Aloe socotrina

Anthemis arvensis

Berberis Vulgaris

Cistus

Equisetum arvense

Erythraea centaurium

Haloxylon scoparium

Helianthemum lipplii

Marubium vulgae

Matricaria pubescens

Rhamnus alaternus

Ononis angustissima

Oudneya africana

Pituranthos chloranthus

Rhantherium adpressum

Salvia offisinalis

Teucrium polium

Thapsia garganica

Trigonella faenum

Zygophyllum album

29

Les plantes choisies pour l'étude de l'activité inhibitrice vis-à-vis de l' - amylase, sont de nombre de six. Les noms, la pharmacopée et les photos de ces plantes sont présentées dans le (Tableau I . 2). Sauf la plante "El kassa" ??????(Cistus) dont le genre n'a pas pu être déterminé

Tableau I . 2 : Nom, pharmacopée, et photo des plantes investiguées.

Photo

Pharmacopée

Nom

Photo prise de l'encyclopédie Wikipedia

Elle a un effet important comme reminéralisant . Utilisé pour soigner les tissus conjonctifs et fracture mais également les parois artérielles. un effet positif sur l'hémorragie.
Elle favoriserait le ralentissement des dégénérescences tumorales.

Anti-inflamatoire, astringente et

Cicatrisante (Wikipedia)

Denb el kail -

EquisetaceaeEquisetum arvense (Wikipedia)

Photo prise du site

Pour le rhumatismes, courbatures, déshydratation, dentition, afféctions oculaires, toux, allergie et piqure de scorpions (Maiza. K et Hammiche. V, 1993)

Gardoufa -

AsteraceaeMatricaria pubescens (Maiza. K et Hammiche. V, 1993)

30

Photo prise du site

Au Maroc elle est consommée comme bon traitement pour les maladies de l'intestin. Au sud Algérien, elle est indiquée pour les maladies de la peau en usage externe, sous forme de pâte, mélangée avec du Henné. (Dr Chehma Abdelmadjid, 2006)

Henat l'ibel -

BrassicaceaeOudneya africana (Dr Chehma Abdelmadjid, 2006)

Photo prise de l'encyclopédie Wikipedia

Elle est antiseptique, stimulante, tonique, stomachique et hypoglycémiante. Elle possède aussi divers degrés des propriétés antispasmodiques, antisudorales. En usage externe (en décoction), ses propriétés sont, antiseptiques et cicatrisantes. En tisane ou en aromate elle facilite la digestion. (Baba aissa Farid, 2000)

siwak el nabie -

LamiaceaeSalvia officinalis (Wikipedia)

31

En médecine populaire algérienne, l'usage de cette plante toxique est réservé aux traitements externes, énéralement sous forme de décoction aqueuse ou de macération huileuse de racine, en applications locales contre les douleurs rhumatismales, ou quelquefois sur le thorax pour traiter les bronchites. (Baba aissa Farid, 2000)

Bounnafaa dérias

OmbélliféreaeThapsia garganica

(Wikipedia)

9 plantes, sont connues par les différents herboristes de la ville de Laghouat par leurs vertus thérapeutiques contre le diabète sucré. Elles diminuent la glycémie, et confèrent un soulagement aux diabétiques non insulinodépendants sans qu'ils prennent les médicaments antidiabétiques, par contre les autres ont été récoltées dans les environs de la ville de Laghouat et qui ont déjà fait l'objet des études sur leur activité antioxydante dans le laboratoire des sciences fondamentales de l'université de Laghouat.

2. Préparation des extraits:

En supposant que les principes actifs sont des composés polaires, l'extraction de ces derniers a été faite dans un premier temps avec de l'eau distillée. Les parties utilisées ont été broyées manuellement, tamisées pour éliminer les grosses graines. Environ 1g de chaque poudre ainsi obtenue est macéré dans 20 mL d'eau distillée à 75°C pendant 20 minutes. Après filtration et évaporation de l'eau à pression réduite à 75°C , les résidus sont pesés solubilisés dans 5 ml d'eau distillée puis conservés sous une température de 4°C.

3. Dosage des composés phénoliques :

3. 1. Dosage des phénols totaux :

3. 1. 1. Principe :

Le dosage des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée de Singleton et Ross (1965) avec le réactif de folin-Ciocalteu commercial. (T Bahorun, 1997)

Le réactif de Folin constitué par un mélange d'acide phosphotungestique (H3PW12 O40 ) et d'acide phosphomolybdique (H3PMO12 O40 ), est réduit lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène. (Nathalie Boizot, Jean-Paul Charpentie). La coloration bleue produite, dont l'absorption maximum est à 755 nm est proportionnelle à la quantité de polyphénols présente dans les 23 extraits aqueux. La quantification des phénols totaux dans les extraits nécessite de tracer une courbe d'étalonnage d'un phénol étalon (standard) comme l'acide gallique.

3. 1. 2. La courbe d'étalonnage de l'acide gallique:

A partir d'une solution mère aqueuse d'acide gallique, de concentration massique de 0,5 g/l, une gamme étalon de solutions filles en milieu aqueux a été préparée.

32

A l'aide d'une micropipette, 100 ul de chaque solution fille sont mis dans un tube à essai puis 500 ul du réactif de folin-Ciocalteu à 10 % (10 fois diluée dans de l'eau distillée) est additionné. Après deux minutes d'incubation, 2 ml de carbonate de sodium Na2CO3 à 2 % sont ajouté. Les tubes sont ensuite agités et placés à l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.

La lecture de l'absorbance de chaque solution préparée est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible de type Shimadzu 1601, à une longueur d'onde de 755 nm contre un blanc préparé de la même manière sauf qu'il ne contient pas d'acide gallique mais de l'eau distillée à la place. Les valeurs de l'absorbance de chaque concentration nous ont permis de tracer la courbe d'étalonnage de l'acide gallique.

Pour la quantification de phénols totaux dans nos extraits, nous avons suivi la même procédure décrite précédemment.

3. 2. Dosage des flavonoïdes :

3. 2. 1. Principe :

Les teneurs des flavonoïdes ont été mesurés par une méthode adaptée de Lamaison et Carnat (1991). (T Bahorun, 1997), en utilisant le trichlorure d'aluminium (AlCl3) comme réactif. La présence d'une case libre dans AlCl3 forme une liaison dative avec les doublets libres de l'oxygène des groupements OH des flavonoïdes, en produisant un complexe de couleur jaune, dont son absorbance maximale est enregistrée à 409 nm. Les quantités des flavonoïdes dans nos extraits, ont été calculées à partir d'une courbe d'étalonnage d'un flavonoïde étalon (la rutine).

3. 2. 2. La courbe d'étalonnage  de la rutine:

Une solution mère de rutine de concentration massique 0,2 g/l a été préparée dans le méthanol. A partir de cette solution mère, une gamme étalon de concentration allant de 0,01 g/l jusqu'à 0,07 g/l, a été préparée en milieu aqueux.

1 ml de chaque solution fille est placé dans un tube à essai suivi par l'addition d' 1 ml du trichlorure d'aluminium 2 %. Les tubes sont ensuite agités légèrement et incubés à l'obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution préparée a été mesurée dans le même spectrophotomètre à une longueur d'onde de 409 nm contre un blanc. Les valeurs de l'absorbance ainsi obtenues nous ont aidé à tracer la courbe d'étalonnage de la rutine.

Le dosage des flavonoïdes dans nos extraits a été effectué de la même manière que la courbe d'étalonnage.

4. Cinétique de l' -amylase :

33

La mesure de l'activité enzymatique revient à un dosage indirect du substrat transformé ou du produit apparu par unité de temps dans des conditions opératoires bien définies.

Dans notre cas on s'intéresse au dosage spectrophotométrie indirect du maltose libéré lors de l'hydrolyse de l'amidon par l' - amylase fongique d?Aspergillus oryzae.

La méthode est basée sur le pouvoir réducteur du produit. Le maltose et les autres produits (Figure I . 1) ont un pouvoir réducteur car le carbone 1 de leur glucose terminal porte le OH hémiacétalique plus réactif que les autres OH. Chaque produits libérés (une liaison hydrolysée) a la capacité de réduire la solution A (Bleue) (glycine (0,21 M), Na2CO3 (0,38 M) et le CuSO4  (1,8 mM)) en un complexe coloré (jaune à rouge) avec la solution B : la néocoproïne. La coloration mesurée à 450 nm est proportionnelle à la quantité de produit libéré.

Pour doser l'activité enzymatique de l' - amylase, une courbe d'étalonnage du maltose a été préalablement établie.

34

Amidon

Action de l' -amylase

Maltose

Maltotriose

Dextrines limite

Figure I. 1 : Produit de dégradation de l'amidon par l' -amylase.

35

4. 1. La courbe d'étalonnage du maltose:

A partir d'une solution mère de maltose de concentration molaire de 0,2 mM préparé dans un tampon phosphate (20 mM, 6 mM NaCl pH = 6,9), une gamme étalon de solutions filles a été préparée pour des concentrations allant de 20 uM jusqu'à 140 uM.

Dans un tube à essai, 100 ul de chaque solution fille sont mélangés avec 0.5 ml de la solution A et 0.5 ml de la solution B. Le milieu réactionnel est agité vigoureusement, puis porté à l'ébullition pendant 10 minutes. À leur sortie du bain, les tubes sont refroidis dans du l'eau de robinet (à température ambiante) , puis 3,5 ml d'eau distillée sont ajoutés au milieu réactionnel.

La lecture de l'absorbance de chaque solution préparés a été enregistrée à 450 nm contre un blanc. Les valeurs de densité optique ainsi obtenues, nous ont permis de tracer la courbe d'étalonnage du maltose.

4. 2. Dosage de l'activité enzymatique de l'?-amylase :

Le dosage de l'activité enzymatique de l'?-amylase a été exprimé en fonction de la concentration du maltose libéré, lors de la dégradation de l'amidon, dans un intervalle de temps bien déterminé. La quantité du maltose libéré est calculée à partir de la courbe d'étalonnage du maltose.

Nous avons préparé deux solutions à savoir une solution mère aqueuse d'amidon à 1 % et une solution d' -amylase 0,5 mg /ml dans le tampon phosphaté à pH 6,9, les deux solutions sont conservées à une température de 4°C.

A partir d'une solution mère aqueuse d'amidon (1% m/v), nous avons préparé une gamme de dilutions de concentrations allant de 0,2 g / l jusqu'à 10 g /l. Le mélange réactionnel contient 300 ul du tampon phosphate, 100 ul de chaque dilution et 100 ul d' -amylase de concentration portée à 0.5 mg/ml. Le mélange est placé dans un bain marie à 37 °C pendant 4 min, puis la réaction enzymatique est stoppée par l'ajout d'1 ml de la solution A. Ensuite, 1 ml de la solution B est ajouté et les tubes sont agités et placés immédiatement dans un bain marie porté à l'ébullition. Après 10 minutes de chauffage, les tubes sont sortis du bain marie, refroidis dans de l?eau de robinet. Le volume final du mélange réactionnel est ajusté à 4.6 ml avec de l'eau distillée.

36

Les mesures de la densité optique de chaque solution préparée ont été effectuées à 450 nm contre un blanc dans le même spectrophotomètre utilisé précédemment. Les résultats obtenus nous ont permis de déterminer la concentration du maltose libéré dans le milieu réactionnel et par conséquent, de tracer la courbe de la cinétique enzymatique de l'?-amylase.

5. Tests d'inhibition :

En premier temps, nous avons testé l'effet des 23 extraits aqueux à la même concentration sur l'activité enzymatique de l' -amylase. Le choix de la concentration du substrat (amidon) a été maintenu dans le domaine de la linéarité de la courbe cinétique de l'enzyme.

Le milieu réactionnel contient : 200 ul du tampon, 100 ul d'amidon, 100 ul de chaque extraits aqueux et 100 ul d' -amylase. Un témoin a été préparé de la même façon sans inhibiteur. Ensuite, le mélangé réactionnel est traité de la même manière que celle appliquée pour le dosage de l'activité ?-amylasique et les mesures de l?absorbance ont été enregistrées à 450 nm contre un blanc. L?activité inhibitrice de chaque plante est calculée selon la formule suivante (Megh Raj Bhandari et al, 2008)

(DO contrôle - DO échantillon du test)

Activité inhibitrice (%) = x 100

DO contrôle

DO contrôle : Densité optique du control ou témoin

DO échantillon du test : Densité optique de l'échantillon sans inhibiteur

37

1. Analyse des extraits aqueux:

1. Teneur des extraits aqueux :

Les rendements des extraits, leurs couleurs et aspects sont consignés dans le (Tableau II.1). Les rendements des extraits aqueux varient de 0.46 à 31.32 % dans les différentes plantes étudiées. La teneur la plus élevée est enregistrée pour les feuilles de la plante "Oudenaya africana" par contre la plante "Trigonella faenum" est la plus pauvre en extrait aqueux. La majorité des plantes atteint plus de 10% d'extraits. Tous les extraits montrent des couleurs différentes, les aspects des extraits sont tous visqueux.

Tableau II . 1: Teneurs, aspects et couleurs des extraits aqueux.

Plantes

Aspect et couleur

Teneurs

mg / g

Rendement (%)

Ajuja iva

Aloe socotrina

Anthemis arvensis

Berberis Vulgaris

Cistus

Equisetum arvense

? Les grains

? Les feuilles

Erythraea centaurium

Haloxylon scoparium

Helianthemum lipplii

Marubium vulgare

Matricaria pubescens

Ononis angustissima

Oudneya africana

? Les gousses

? Les feuilles

Pituranthos chloranthus

Rhamnus alaternus

Rhantherium adpressum

Salvia offisinalis

Teucrium polium

Thapsia garganica

Trigonella faenum

Zygophyllum album

Visqueux - jaune foncé

Visqueux - marron foncé

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - jaune

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - jaune

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - jaune

Visqueux - jaune

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - marron

Visqueux - jaune

Visqueux - jaune clair

Visqueux - jaune

131,1

156,7

193,4

179,5

210,8

60,6

144,6

194,4

182,9

39,4

119,3

190,4

76,3

185

313,3

113,9

242,1

57,3

154

106,9

236,3

4,6

98,2

13,12

15,67

19,33

17,95

21,08

6,06

14,46

19,44

18,29

3,94

11,93

19,02

7,62

18,5

31,32

19,39

5,73

15,39

10,69

23,63

0,46

9,82

39

1. 2. Quantité des phénols totaux des extraits aqueux:

A l'aide de la courbe d'étalonnage de l'acide gallique (Figure II . 1), nous avons calculé la quantité des phénols totaux présents dans les 23 extraits aqueux en équivalent d'acide gallique. Les résultats sont résumés dans le (Tableau II . 2)

Figure II . 1 : La courbe d'étalonnage de l'acide gallique

Le dosage des composés phénoliques dans les 23 extraits aqueux des 20 plantes étudiées a donné des teneurs en composés phénoliques qui varient de la plus petite valeur : 0,18 mg /g de matière sèche celle de « Trigonella faenum » à la plus grande valeur : 43,088 mg /g de matière sèche celle de « Cituse ».

40

Tableau II . 2 : La teneur en phénols totaux dans les 23 extraits aqueux.

Nom de la plante

Teneur en phénols totaux : mg / g MS

Taux de phénols

totaux (%)

Ajuja iva

Aloe socotrina

Anthemis arvensis

Berberis Vulgaris

Cistus

Equisetum arvense

? Les grains

? Les feuilles

Erythraea centaurium

Haloxylon scoparium

Helianthemum lipplii

Marubium vulgare

Matricaria pubescens

Ononis angustissima

Oudneya africana

Les gousses

? Les feuilles

Pituranthos chloranthus

Rhamnus alaternus

Rhantherium adpressum

Salvia offisinalis

Teucrium polium

Thapsia garganica

Trigonella faenum

Zygophyllum album

1,80

8,91

3,94

6,74

43,08

2,48

1,92

7,32

26,71

1,39

1,71

1,36

1,91

9,17

15,86

3,62

3,01

2,48

16,12

5,61

8,10

0,18

2,16

43,08

1,37

5,68

2,03

3,75

20,43

4,09

1,32

3,76

14,60

3,52

0,89

1,14

2,50

4,95

5,06

3,17

5,25

1,18

10,46

5,25

3,42

3,91

2,20

20,43

41

Si on compare les valeurs de ces teneurs en composés phénoliques ( Tableau II . 2) à celles des teneurs des extraits aqueux bruts (Tableau II . 1), on remarque qu'elles sont toutes inférieures à ces dernières, ce qui indique que les extraits bruts aqueux obtenus contiennent d'autres composés polaires à part les phénols tel que : les protéines, les sucre simple (glucose), les glycoprotéines. Par exemple pour la plante "Csitus" qui a enregistré la teneur la plus élevée en phénols totaux, la masse de son extrait aqueux est de 210,8 mg/g alors que la quantité des phénols totaux ne dépasse pas la valeur 43,08 mg/g qui représente que 20,43 % de l'extrait aqueux brut. Il faut noter que les teneurs en extraits bruts et en phénols totaux ne varient pas dans le même sens, car on remarque que pour des teneurs élevées en extraits aqueux on enregistre des quantités faibles en phénols totaux. Cette constatation est valable pratiquement pour toutes les plantes et notamment dans la plante "Oudenaya africana" car cette plante a enregistré la valeur la plus élevée en extrait aqueux brut alors que ce n'est pas le cas pour les teneurs en phénols totaux.

1. 3. Quantité des flavonoïdes dans les extraits aqueux:

A partir de la courbe d'étalonnage de la rutine (Figure I I. 2), nous avons déterminé la quantité des flavonoïdes présents dans les 23 extraits aqueux en équivalent de la rutine. Les résultats sont résumés dans le (Tableau II . 3) .

Figure II . 2 : La courbe d'étalonnage de la rutine.

42

Le dosage des flavonoïdes dans les 23 extraits aqueux des 20 plantes étudiées a donné des teneurs en flavonoïdes qui varient de 0,041 mg /g de matière sèche celle dans la plante « Trigonella faenum » à 11,613 mg /g de matière sèche pour la plante « Salvia offisinalis».

Tableau II . 3 : La teneur en flavonoïdes dans les 23 extraits aqueux.

Nom de la plante

Teneur en flavonoïdes mg / g MS

Taux de flavonoïdes (%)

Ajuja iva

Aloe socotrina

Anthemis arvensis

Berberis Vulgaris

Cistus

Equisetum arvense

? Les grains

? Les feuilles

Erythraea centaurium

Haloxylon scoparium

Helianthemum lipplii

Marubium vulgre

Matricaria pubescens

Ononis angustissima

Oudneya africana

Les gousses

? Les feuilles

Pituranthos chloranthus

Rhamnus alaternus

Rhantherium adpressum

Salvia offisinalis

Teucrium polium

Thapsia garganica

Trigonella faenum

Zygophyllum album

0,66

8,39

0,95

0,53

2,07

0,06

0,50

6,49

1,73

1,35

0,20

0,43

1,16

3,61

6,54

0,91

2,11

1,11

11,61

3,00

2,83

0,04

1,97

36,84

94,16

24,41

7,85

67,26

2,62

26,30

88,66

6,47

97,12

15,01

25,43

60,73

39,40

41,26

25,13

73,26

36,87

72,02

53,51

34,97

22,22

71,22

43

Si on compare les valeurs de ces teneurs en flavonoïdes (Tableau II. 3) à celles des teneurs en composés phénoliques des extraits aqueux bruts ( Tableau II. 2), on remarque qu'elles sont toutes inférieures à ces dernières, ce qui indique que les extraits contiennent d'autres composés phénoliques possédant autres structures chimiques que celles des flavonoïdes (Acide phénoliques, tanins, stilbènnes...). Quelques plantes ont montré leur richesse en flavonoïdes à savoir: Aloe socotrina, Erythraea centaurium, Helianthemum lipplii.

Suivant les résultats obtenus sur le test d'inhibition de l'enzyme décrits dans la partie (3) (des résultats et discussion), nous avons sélectionné six plantes de l'ensemble des plantes investiguées : « Cistus », « Oudneya africana », « Equisetum arvense», «Matricaria pubescens », « Salvia officinalis » et «Thapsia garganica », qui exposent des taux d'inhibition supérieur à 70%. Les six plantes sélectionnées sont soumises à une succession d'extraction par de l'eau distillée et le méthanol. 1 g de la poudre végétale dans 20 ml d'eau distillée a été chauffée pendant 20 min à 75°C. Après filtration, les résidus de la matière végétale sont séchés puis macérés dans 10 mL de méthanol pendant 72 heures. Les filtrats obtenus des deux étapes d'extraction, sont alors évaporés sous vide et les résidus obtenus sont repris dans 5 ml d'eau distillée et 5 ml du méthanol pur pour les extrait aqueux et les extraits méthanoïques respectivement.

La quantification des phénols totaux et des flavonoïdes dans les extraits préparés a été déterminée par les mêmes procédures décrites précédemment. La détermination des constantes et les types d'inhibition de tous les extraits a été achevée suivant le protocole expérimental décrit auparavant. Les teneurs des extraits méthanoliques, les couleurs ainsi que leurs aspects sont regroupés dans le (Tableau II . 4).

Tableau II . 4 : Teneurs, couleurs et aspects des extraits méthanoliques.

Plantes

Aspect et couleur

Teneur mg/g

Rendement

(%)

Cistus

Equisetum arvense (Les grains)

Matricaria pubescens

Oudneya africana (Les gousses)

Salvia offisinalis

Thapsia garganica

Poudre cristalline verte

Poudre cristalline verte

Poudre cristalline verte

Poudre cristalline verte

Poudre cristalline verte

Poudre cristalline verte

33,45

61,41

32,12

67,56

28,24

20,21

2,78

6,14

3,21

6,75

3,39

2,01

44

D'après les résultats mentionnés dans le tableau précèdent, on remarque que les valeurs des rendements d'extraction varient entre 2.01 et 6.75% pour « Thapsia garganica » et les gousses de la plante « Oudneya africana » respectivement. Les extraits présentent un aspect poudreux de même couleur verte sauf pour l'extrait « Equisetum arvense » qui a une couleur Jaune

A l'aide des courbes d'étalonnage de l'acide gallique et de la rutine, nous avons calculé les quantités des phénols totaux et des flavonoïdes présents dans les 6 extraits méthanolique. Les résultats sont résumés dans le (Tableau II . 5).

Tableau II . 5 : La teneur en phénols totaux et flavonoïdes dans les 6 extraits

méthanoliques.

Nom de la plante

Teneur en phénols totaux : mg / g MS

Taux de

phénols

totaux (%)

Teneur en flavonoïdes :

mg / g MS

Taux de flavonoïdes

(%)

Cistus

Equisetum arvense (Les grains)

Matricaria pubescens

Oudneya africana (Les gousses)

Salvia offisinalis

Thapsia garganica

5,71

2,45

3,16

7,06

11,42

1,87

20,48

3,98

9,83

10,44

33,68

9,31

2,03

0

1,04

0,27

0,02

0

35,61

0

32,85

3,86

0,12

0

Le dosage des composés phénoliques dans les six extraits méthanoliques, a donné des teneurs en composés phénoliques qui varient entre 2,45 mg /g et 11,42 mg /g de la matière sèche équivalent en acide gallique pour les extraits de « Equisetum arvense » et « Salvia offisinalis » respectivement.

D'après les valeurs obtenues des teneurs en composés phénoliques (Tableau II . 5) et celles des extraits bruts (Tableau II . 4), on peut déduire que les extraits méthanoliques bruts ne contiennent pas uniquement des composés phénoliques, mais peut être que d'autres composés sont extractibles par le méthanol.

45

Si on compare les teneurs en composés phénoliques des extraits méthanoliques et aqueux des six plantes étudiées, (Tableau II. 5) on constate que les extraits aqueux renferment des teneurs en phénols totaux plus élevées par rapport aux extraits méthanoliques. Une explication simple peut être envisagée dont le fait que, l'extraction méthanolique a été déjà précédée par une extraction aqueuse et elle n'a extrait que le reste qui n'est pas passé dans l'eau distillée. Par contre, l'extrait méthanolique de «Matricaria pubescens  » a présenté une teneur en phénols totaux supérieure à celle de l'extrait aqueux ce qui peut être expliqué par le fait que la plante «Matricaria pubescens » contient d'autres composés phénoliques non extractible par l'eau et qui sont passés dans le méthanol. Egalement, l'eau distillée a la capacité d'extraire d'autres composés polaires que les polyphénols, tels que les alcaloïdes, les protéines, les sucres et d'autres composés qui sont dosables par le réactif de Folin Cioncalteu, ce qui entraîne une augmentation des teneurs en composés phénoliques.

A travers les résultats cités dans le tableau précèdent, on constate que les plantes étudiées renferment un matériel pauvre en flavonoïdes et notamment pour les extraits de "Thapsia garganica" , "Salvia offisinalis" et "Equisetum arvense "(Les grains). Ils présentent tous des teneurs en flavonoïdes inférieurs à 35 %

2. Cinétique de l' -amylase :

En se basant sur la courbe d'étalonnage du maltose (Figure II. 3), nous avons pu déterminer les concentrations du maltose libéré dans le milieu réactionnel pour des différentes concentrations d'amidon. Les valeurs obtenues des concentrations, nous ont permis de tracer la courbe de la cinétique de l'enzyme (Figure II. 4)

46

Figure II. 3 : La courbe d'étalonnage du maltose.

La représentation graphique V = f ([S]) (Figure II. 4), montre que l'enzyme -amylase suit une cinétique michaelienne. D'après ce graphe, on constate que la relation est proportionnelle entre la concentration et la vitesse enzymatique dans un domaine de linéarité qui s?arrête à une concentration de substrat de 0,5 g / l où la courbe dévie, montrant un plateau qui est expliqué par le fait que le site actif de l?amylase est saturé.

Figure II . 4 : La cinétique de l' -amylase.

La représentation de Lineweaver - burk 1 / V = 1 / ([|S]) (Figure VII. 25)  nous a permit de déterminer les différents paramètres cinétiques de l'amylase à savoir la vitesse maximale Vmax et la constante de Michaelis - Menten KM

- 1 / KM

47

Figure II . 5 : Représentation de Lineweaver - burk de l' -amylase.

À partir de la représentation de Lineweaver - burk de l' -amylase, la vitesse maximale est de 107,52 uM / min et la constante de Michaelis ? Menten KM = 1,19 g / l .

3. Tests d'inhibition :

En vue de repérer les plantes ayants une capacité inhibitrices vis-à-vis l' - amylase, des tests d'inhibitions ont été effectués pour une même concentration des extraits. La concentration a été fixée à 0.9 g/l. Les taux d'inhibition ont été calculés et les résultats sont résumés dans le (Tableau II . 6).

Tableau II . 6 : Taux d'inhibition des 23 extrais aqueux.

Nom de la plante

Taux d'inhibition (%)

48

Zygophyllum album

70,31

30,19

61,95

48,17

100

100

32,48

25,69

53,61

43,1/8

8,29

86,90

19,25

100

51,38

43,18

76,75

77,81

51,47

76,75

0

0

D'après les résultats obtenus, on remarque que touts les extraits ainsi préparés inhibent l' - amylase avec différents taux d'inhibition. Les valeurs calculées sont comprises entre 8,29 et 100 %. Les pourcentages d'inhibition les plus importants sont remarqués pour les extraits de « Cistus », les gousses de la plante « Oudneya africana » et les grains de la plante « Equisetum arvense » à l'exception des deux plantes « Zygophyllum album » et « Trigonella faenum ».

D'après l'enquête ethnobotanique effectuée auprès des herboristes qui confirment l'utilisation de la plante « Zygophyllum album »en médecine traditionnelle contre le diabète, on peut expliquer l'action anti - hyperglycémiante de son extrait aqueux, qui est due à l'inhibition de l' -glucosidase, ou il agit à un autre niveau pour diminuer la glycémie élevée en favorisant la sécrétion de l?insuline. Une autre explication est envisagée est que les principes actifs responsables à l'inhibition de l'enzyme ne sont pas extractibles par l'eau distillée.

4. Evaluation de l'effet inhibiteur des extraits sur l' - amylase :

Dans notre étude, l'activité enzymatique de l' - amylase a été mesurée à l'aide du substrat l'amidon. Nous avons néonmoins choisi l'amidon comme substrat essentiellement pour la commodité de réaliser le dosage par les méthodes photométriques.

Dans le but de trouver un inhibiteur naturel de l' - amylase, nous avons donc étudié l'effet des extraits aqueux et méthanoliques sur l'activité de l' - amylase à des concentrations variables d'extraits. Les mesures ont été effectuées avec l'amidon comme substrat de l'enzyme. L'influence du temps d'incubation sur l'inhibition de l'activité enzymatique par les extraits aqueux et méthanoïques a été examiné jusqu'à 4 min.

D"après les tracés (Annexe 2 et 3) figurant la variation de l'inverse des vitesses réactionnelles en fonction des concentrations d'extraits exprimés en g / l et la variation de l'inverse des vitesses réactionnelles en fonction de l'inverse des concentration exprimé en l / g pour différentes concentrations de substrat, nous avons déterminé les types et la constante d'inhibition (Ki) de chaque échantillon.

Les constantes d'inhibition (Ki) sont calculées à partir de ces graphes, par la projection du point d'intersection des droites sur l'axe des abscisses, tendis que le type d'inhibition est déduit à partir du point de rencontre de ces tracés. Le tableau II. 7 regroupe les différents résultats obtenus.

49

Tableau II. 7 : Inhibition l' - amylase par les extraits aqueux et méthanloniques.

Ki : constante d'inhibition; K'i : constante d'inhibition par rapport aux phénols totaux.

Nom de la plante

Type d'inhibition

Ki (g/l)

K'i (ppm)

Extraits aqueux

Cistus

Equisetum arvense (Les grains)

Matricaria pubescens

Oudneya africana (Les gousses)

Salvia offisinalis

Thapsia garganica

Inhibition compétitive

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive

0.24

0,21

0,35

0,37

0,07

0,39

50,36

8,88

3,17

18,69

8,07

13,47

Extraits méthanoliques

Cistus

Equisetum arvense (Les grains)

Matricaria pubescens

Oudneya africana (Les gousses)

Salvia offisinalis

Thapsia garganica

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

Inhibition compétitive mixte

0.22

0,21

0,36

0,13

0,02

0,58

45,67

8,64

36,09

13,58

8,08

54,65

L'ensemble des résultats obtenus montrent que la totalités des extraits aqueux et méthanoliques de nos plantes ont la capacité d'inhiber l'activité de l' - amylase avec des valeurs des Ki de l'ordre de ppm par rapport aux phénols totaux, en présentant des inhibitions de type : Inhibition compétitive mixte et Inhibition compétitive. Ces deux derniers types d'inhibition peuvent être expliqués par le fait que, les extraits aqueux et méthanoliques possèdent des composés portant des groupements fonctionnels proches de ceux du substrat qui est l'amidon, ce qui l'a déplacé du site actif de l'enzyme.

Les valeurs de Ki par rapport aux concentrations d'extraits bruts, déterminée des deux représentation de Dixon et de Lineweaver - burk  varient de 0,074 g/l à 0,393 g/l , et de 0,024 à 0,587 g/l pour les extraits aqueux et méthanoliques respectivement.

50

On remarque que la plante «Salvia offisinalis  » pressente un Ki faible pour les deux extraits aqueux et méthanoliques ce qui prouve que c'est un bon inhibiteur. Par contre par rapport aux phénols totaux c'est la plante " Matricaria pubescens" qui montre la plus faible valeur par rapport au phénols totaux pour les extraits aqueux, mais parcrapport au phénols totaux pour les extraits méthanoliques c'est la plante «Salvia offisinalis»

Les figures ci-dessous montrent les représentations de Lineweaver - burk et Dixon de la plante «Salvia offisinalis»

Figure II. 6 : Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait aqueux la plante

«Salvia offisinalis »

51

Figure II. 7 : Représentation de Dixon de l'extrait aqueux de la plante «Salvia offisinalis »

Figure II. 8 : Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante

«Salvia offisinalis»

52

Figure II. 9 : Représentation de Dixon de l'extrait méthanolique de la plante «Salvia offisinalis »

53

Conclusion

Plusieurs raisons ont mené au retour de l'usage des plantes médicinales, la découverte des puissances curatives des plantes et les principes actifs qui agissent de façon non violente, en profondeur sans agresser l'organisme, en stimulant ses défenses plutôt que de se substituer à elles, en sont les meilleurs arguments.

Dans ce contexte et pour enrichir les banques de donnés de référence de la phytothérapie, nous nous somme intéressés à six plantes de différentes familles à savoir : Equisetum arvense, Cistus, Matricaria pubescens, Oudneya africana, Salvia officinalis et Thapsia garganica, en tenant en compte leur importance en thérapeutique traditionnelle. Le chois tactique de ces plantes est basé sur des tests préliminaires vis-à-vis l'activité -amylasique, indiquant leur possession d'un pourcentage d'inhibition supérieur à 70 %.

Dans un premier temps, nous avons réalisé une extraction aqueuse et méthanolique pour les six plantes médicinales choisies. Dans un second lieu, nous avons procédé à la quantification des composés phénoliques par des méthodes spectrophotométriques. Le dosage des phénols totaux a été réalisé par la méthode de folin - Ciocalteu, en utilisant l'acide gallique comme étalon. Tandis que l'évaluation des composés flavonoïdiques par rapport à la rutine a été effectuée par dosage compléxométrique avec le trichlorure d'aluminium.

Les résultats montrent clairement que les teneurs en phénols totaux varient entre 1,71 et 16,12 mg/g et de 1,87 et 11,42 mg/g équivalent en acide gallique pour les extraits aqueux et méthanoliques respectivement. L'analyse quantitative du contenu en flavonoïdes nous a conforté dans l'idée que ces plantes étaient en possession d'un matériel relativement faible en flavonoïdes . A partir des valeurs des quantités des flavonoïdes qui sont comprises entre 0,06 et 11,61 mg/g et de 0 et 2,03 mg/g équivalent en rutine, on peut conclure que la majorité de ces plantes présentent des pourcentages en flavonoides inférieurs à 50 % par rapport à la masse des phénols totaux.

55

Nous avons pu mettre en évidence pour la première fois in vitro, l'effet inhibiteur de certains extraits de plantes sur l' - amylase. Les résultats obtenus à travers ce test montrent que la majorité de ces plantes présentent des effets inhibiteurs importants. Les valeurs des constantes (Ki) ainsi obtenu, indiquent que ces plantes peuvent être investiguées à des fin pharmacothérapeutique, et notamment, la plante "Salvia officinalis" qui a présentée les plus faibles valeurs de constante d'inhibition pour les deux extraits aqueux et méthanolique.

L'ensemble de ce travail a permis de mieux connaître l'intérêt de ces plantes vis-à-vis leur activité anti-amylasique, ce qui nous encourage à approfondir la recherche pour caractériser les molécules responsables à cette inhibition. De même, il est envisageable d'élargir le panel des tests d'inhibition, en utilisant d'autres substrats ou d'autres types d'enzymes. Il reste encore d'autres plantes locales utiles qui n'ont pas été analysées et qui mériteraient de déterminer leur potentialité dans le domaine étudié.

56

Bibliographie

Baba Aissa Farid, 2000, Encyclopédie des plantes utiles, flore d'Algérie et du Maghreb, substances végétales d'Afrique d'orient et d'occident, p 228, p 252, p 276.

Bahorun T, 1997, Substances naturelles actives : La flore mauricienne, une source d'approvisionnement potentielle, Food and Agricultural Research, pages 83 - 94.

Baron. A, Bertheau. y, Brillquet. J. M, Cassagne. C, Coleno. A, Gripon. J. C, Hoebler. C, Kotoujansky. A, Mercier. C, Odier. E, Rouau. X, Thibault. J. F, Valin. C et Verger. R, 1985, Hydrolases et dépolymérases enzymes d'intérêt industriel, P 113, 114, 116.

Boizot Nathalie et Charpentier Jean-Paul,2006, Méthode rapide d'évaluation du contenu en composés phénoliques des organes d'un arbre forestier, INRA - Amélioration génétique et physiologie Forestières, Laboratoire d'analyses biochimiques, le cahier des technique de l'INRA, P 79, 80.

Caratini Roger, 1985, La médecine, édition Bordas, p 35, p 76, p 100.

Dr Chehma Abdelmadjid, 2006, Catalogue des plantes spontanées du Sahara septentrional algérien, édition Dar elhouda, Ain M'lila, P 14, 18, 38,51, 66, 73, 137.

Dr. Helmi abdel kader, 2004, Les plantes médicinales en Algérie, p 61, p 156

Djelili Farida, Madani Khodir et Chibane Mohamed, 2008, Extraction et analyse quantitative de composés phénoliques de quelques plantes de la région de Beni - Djellil, université Abderrahmane Mira de Bejaia, Séminaire Agriculture, environnement et santé S. N. A. E. S. 2008, pages 159 - 165.

58

Girotti - Chanu Catherine, 2006, Etude de la lipolyse et de la synthése de composés d'un derme sous l'effet de la cirsimarine, flavone extraite de Microtea debilis , Ecole doctorale interdisciplinaire science - Santé, Formation doctorale : Biochimie, p 32, 33, 34, 35 . (Thèse de Doctorat).

Grimaldi. A, 2000, Diabétologie, Université Paris - VI, faculté de médecine Pierre et Marie CURIE, questions d'internat, P 23.

Hadi Milaine, 2004, La quercétine et ses dérivés : molécules à caractère pro - oxydant ou capteurs de radicaux libres ; études et applications thérapeutiques, Université Louis Pasteur Strasbourg l Domaine : pharmacochimie, p 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35. (Thèse de Doctorat).

Hames. B.D, Hooper. N. M et Houghton. J. D, 2000, Biochimie, édition Berti, P 61, 76, 77.

Hong Gao, Yi - Na Huang, Bo Gao, Pei - Yu Xu, Chika Inagaki et Jun Kawabata, 2008, - Glucosidase inhibitory effect bu the flower buds of Tussilogo farfara L , Journal of Food chemistry,  Pages 1195 -1201.

Horn Florian, Lindenmeier Gerd, Grillhosl Christian, Moc Isabelle, Berghold Silke, Schneider Nadine et Munster Birgit, 2005, Biochimie humaine, édition Flammarion, P 65, 66, 76.

Keillor Jeffrey W, 2004, Enzymologie inhibition des réactions enzymatiques, Université de montréal, faculté des arts et des sciences, département de chimie, P 5, 6, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 23, 24.

Laraoui Habiba, 2007, etude phytochimique de l'extrait chloroformique de Bulpleurum atlanticum, Université El Hadj Lakhdar Batna, Option : chimie organique, p 35. (Thèse de Magister).

Lévêque Emmanuel, Haye Bernard et Belarbi Abdel, 2000, l'amidon et ces dérivés applications industrielles, éditions scientifiques et médicales Elservier SAS, P17, 18, 19, 20, 21, 35.

59

Macheix Jean-jacques, Fleuriet Annie et jay - Allemand Christian, 2005, Les composés phénoliques des végétaux un exemple de métabolites secondaire d'importance économique, presses plytechnique et universitaires romandes, p Viii, 1, 3, 5, 7, 10.

Maiza K et Hammiche V, 1993, Pharmacopée traditionnelle Saharienne : Sahara septentrional, Laboratoire de botanique médicale, INSSM / Alger, médicament et alimants : l'approche ethnopharmacologique, pages 169 - 171.

Megh Raj Bhandari, Nilubon Jong-Anurakkn, Gao Hong, jun Kawabata, 2008, - Glucosidase and ? amylase inhibitory activities of Nepalese medicinal herb Pakhanbhed ( Bergenia Ciliata, Haw.), Journal of Food chemistry,  Pages 247 ? 252.

Microsoft Encarta (CD), 2006

Portet Bénédicte, 2007, Recherche bioguidée de molécules antipaludiques d'une plante guyanaise Piper hostmannianum, Université Paul Sabatier Toulouse spécialité : Chimie - Biologie - Santé p 22 (Thèse de Doctorat).

Voet Donald et Voet Judith C, 1995, Biochimie, édition 1998, P 351, 359

Weil Jacques-Henry, 2001, Biochimie générale, 9ème édition Dunod, P 216.

Weinman Serge, 2004, Toute la biochimie, édition Dunod, P 142.

Wikipedia encyclopedia, 2005.

.

60

Annexe

Annexe. 1. Les formules chimiques de quelques polyphénols.

Phénol simple :

Catéchol L'acide gallique

Acide hydrobenzoïque :

p - Hydroxybenzoïque

Acide hydroxycinnamique :

Acide caféique

Naphtoquinone :

62

Juglone

Stilbène :

Le resvératol

Flavonoïde

Flavonol :

Quercétine Rutine

Anthocyane :

63

Cianidine

Flavanols :

Catéchine

Flavanones :

Naringénique

Lignanes :

64

Pinorésinol

Annexe. 2. Les représentations de Lineweaver- burk.

Représentations graphiques de 1 / V = f ( 1 / [S] ) des extraits aqueux des plantes choisis :

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait aqueux la plante

«Cistus »

65

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait aqueux de la plante

«Equisetum arvense »

66

Représentation de Linweaver - burk de l'extrait aqueux la plante «Matricaria pubescens »

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait aqueux la plante

«Oudneya africana »

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait aqueux la plante

67

«Thapsia garganica»

Représentations graphiques de 1 / V = f ( [ I] ) des extraits méthanoliques des plantes choisis :

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante «Cistus »

68

Représentation de Linweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante «Equisetum arvense »

Représentation de Linweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante «Matricaria pubescens »

69

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante «Oudneya africana  »

Représentation de Lineweaver - burk de l'extrait méthanolique de la plante «Thapsia garganica»

70

Annexe. 2. Les représentations de Dixon.

Représentations graphiques de 1 / V = f ( [I] ) des extraits aqueux des plantes choisis :

Représentation de Dixon de l'extrait aqueux de la plante

«Equisetum arvense »

Représentation de Dixon de l'extrait aqueux de la plante «Cistus »

71

Représentation de Dixon  de l'extrait aqueux la plante

«Matricaria pubescens »

Représentation de Dixon  de l'extrait aqueux de la plante

72

«Oudneya africana  »

Représentation de Dixon de l'extrait aqueux la plante

«Thapsia garganica»

Représentations graphiques de 1 / V = f ( [ I] ) des extraits méthanoliques des plantes choisis :

73

Représentation de Dixon de l'extrait méthanolique de la plante «Equisetum arvense »

Représentation de Dixon  de l'extrait méthanolique de la plante «Oudneya africana  »

Représentation de Dixon  de l'extrait méthanolique de la plante «Thapsia garganica»

74

Représentation de Dixon  de l'extrait méthanolique de la plante «Matricaria pubescens »

Représentation de Dixon  de l'extrait méthanolique de la plante «Cistus »

75

ÈÇá. ÊÞáíÏíÇ.

Ç. Ê1.340 / 43.088 / 0.067 / 11.613 / . 2 % 0.041 / 11.613 / 0.0097 / 1.591 / í.

í. (Ki) . 55 . 8 . .

ÇáãÇÊíÍ: - -.

Résumé

Depuis quelques temps, il a eu un intérêt croissant pour la nourriture, l'industrie pharmaceutique et dans les soins préventifs pour la santé, pour le développement et l'évaluation d'inhibiteurs d'enzymes naturelles dérivés de plantes médicinales. En Algérie, la liste des plantes qui rentrent précisément dans ce cadre sont exhaustives et nombreuses d'entres elles sont considérés traditionnellement comme antidiabétique.

Dans le présent travail, nous avons étudié les effets inhibiteurs d'extraits aqueux et méthanoliques de six plantes médicinales Algériennes connues par leurs vertus thérapeutiques contre le diabète. La teneur en composés phénoliques totaux, doser en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu, des échantillons varient de 1,340 mg / g à 43,088 mg / g et de 0,067 mg / g à 11,613 mg / g en équivalent acide gallique (GAME), respectivement. Alors que les concentrations des flavonoïdes détectés en utilisant le chlorure d'aluminium 2% varient de 0,041 mg / g à 11,613 mg / g et de 0,0097 mg / g à 1,591 mg /g en équivalents de la rutine (RE), pour les extraits aqueux et méthanolique respectivement.

La majorité des plantes inhibaient l'activité enzymatique de l' - amylase d'Aspergillus oryzae. Les valeurs des constantes d'inhibition (Ki) ont été déterminées en utilisant deux méthodes de Dixon et de Lineweaver-Burk. Les résultats montrent que les valeurs Ki sont inférieures à 55 ppm pour tous les extraits. Une forte inhibition a été trouvée chez l'extrait phénolique de Salvia officinalis avec un Ki de 8 ppm. Ces résultats nous encouragent à amplifier plus l'investigation biologique et d'identifier les molécules inhibitrices responsable de cette activité.

Mots clés : antidiabètique, polyphénols, - amylase, activité enzymatique ,Salvia officinalis.

Abstract

Since recent times, there is a growing interest in the food and pharmaceutical industry and in preventive health care for the development and evaluation of natural enzyme inhibitors from medicinal plant materials. In Algeria, the list of plants entering precisely in this domain is exhaustive and numerous among of them are considered traditionally as antidiabete.

In the present work, we have studied the inhibitory effects of aqueous and alcoholic extracts of six Algerian medicinal plants known by their virtues therapeutic against the diabete. The total phenolic compounds content, assayed using Folin-Ciocalteu's reagent, of the samples ranged from 0,183 mg /g to 43,088 mg /g and from1,197 mg /g to 7,445 mg /g, expressed as gallic acid equivalent (GAE), for the respectively. Whereas, the total flavonoïds concentrations, detected using 2% of the aluminum chloride ranged from 0,041 mg /g to 11,613 mg /g and from 0,0097 mg /g to 1,591 mg /, expressed as rutin equivalents (RE), for the aqueous and methanolic extracts respectively.

The major plants were found to inhibit enzymatic activitie of Aspergillus oryzae - -amylase in a concentration dependent manner. The values of the inhibition constants (Ki) have been determined according to the Dixon and Lineweaver-Burk methods. the results showed that the Ki values were less than 55 ppm for the all extracts. A strong inhibition was founed in the phenolic extract of Salvia officinalis with a Ki of 8 ppm . These results encourage us to perform further biological investigation and to identify molecule inhibitors responsible of this activity.

Key worlds: antidiabete, phenolic compounds, - amylase, enzymatic activitie and Salvia officinalis.






Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy








"Piètre disciple, qui ne surpasse pas son maitre !"   Léonard de Vinci