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Etude phytochimique et activités biologiques de zygophyllum geslini coss.

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par Houria Medjdoub
université de Tlemcen - Magister 2006
  

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Conclusion

A la lumière des résultats figurés dans ce mémoire, on peut conclure que le Zygophyllum geslini appelée aggaya est très riche en saponosides, en tanins et en flavonoides. Les tests biologiques réalisés sur les rats Wistar ont prouvé l'efficacité de la plante étudiée contre le diabète sucré.

Ce travail reste préliminaire et peu indicatif sur le mécanisme réel par lequel agit l'extrait éthanolique en diminuant l'hyperglycémie. Par conséquent, la réalisation d'une étude postérieure sur des cellules isolées ou sur un autre espèce animale est d'une importance cruciale. Ceci sera enrichissant et peut nous conduire vers la découverte de nouvelles substances à activité antidiabétique.

La réalisation d'une étude toxicologique est une étape substantielle afin de pouvoir cerné tout effet indésirable et de mieux comprendre les sites d'action des substances actives.

La contribution à la recherche de propriétés antioxydants à partir l'extrait éthanolique reste introductive. Celle-ci constitue une estimation d'une éventuelle activité antiradicalaire in vivo qui pourrait, également, prévenir contre plusieurs maladies hors le diabète sucré.

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~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Annexe 1 ~

Tests phytochimiques:

1- Tanins :

A 2 ml de la solution à tester ajouter 2 à 3 gouttes de solution de FeCl3 à 2%. Un test positif est révélé par l'apparition d'une coloration bleue-noire et un précipité (laisser reposer quelques minutes) [Karumi et al., 2004].

2- Saponosides :

Test 1 : 5 ml des trois extraits, étherique, éthanolique et aqueux sont bien mélangés avec 10 ml d'eau distillée pendant 2 mn. La formation d'une mousse persistante après 15 mn confirme la présence des saponosides [Karumi et al., 2004].

Test 2 : Evaporer 10 ml d'extrait éthanolique. Traiter le résidu obtenu avec 10 ml de chloroforme anhydre. Mélanger 5 ml de la solution chloroformique avec 5 ml d'anhydride acétique. Ajouter quelques gouttes d'acide sulfurique concentré. Agiter puis laisser reposer. L'apparition d'une coloration violacée fugace virant au vert confirme la présence des hétérosides stéroidiques [Benmehdi, 2000].

Test 3 : 5 ml de chaque extrait sont mélangés avec 2 ml de chloroforme et 3 ml d'acide sulfurique concentré. Une couleur rouge-marronne de la couche d'interface indique la présence des triterpène hétérosidique [Edeaga, 2005].

3- Flavonoides :

Traiter 5 ml de chaque extrait avec quelques gouttes d'HCl concentré. Ajouter une quantité de tournures de magnésium (Laisser agir). La présence des flavone aglycone est confirmée par l'apparition d'une couleur rouge ou orange [Karumi et al., 2004].

~JlJle,ce8

4- Composés réducteurs :

Ce test est basé sur la réaction de Keller-Kiliani. A 1 ml de chaque extrait ajouter 5 ml d'acide acétique contenant des traces de FeCl3 et 5 ml d'acide sulfurique contenant des traces de FeCl3. La présence des composés réducteurs est confirmé par la formation de deux phases, une colorée en brun rouge (acide acétique) et la deuxième en bleu-vert (acide sulfurique) [Edeoga et al., 2005].


·
· Coumarines :

Placer 1 g d'échantillon de la plante humide dans un tube à essai. Couvrir le tube avec un papier imbibé d'une solution de NaOH et le placer dans un bain marie pendant quelques minutes. Ajouter 0,5 ml de NH4OH (10%). Mettre deux taches sur un papier filtre et examiner sous la lumière ultraviolette. La fluorescence des taches confirme la présence des coumarines [Benmehdi, 2000].


·
· Anthracénosides :

Ce test est réalisé sur l'extrait éthanolique. En premier lieu, prendre 25 ml de l'extrait éthanolique, ajouter 15 ml d'HCl 10%, porter à reflux pendant 30 mn, refroidir la solution et l'extraire 3 foix avec 15 ml d'éther diéthylique afin d'obtenir deux phases, aqueuse et étherique.

Le test de la présence des anthracénosides est basé sur la réaction de Borntrager. Evaporer 8 ml de la phase étherique, récupérer le résidu avec 2 ml d'eau chaude, ajouter quelques gouttes d'NH4OH à 10%. Test positif par l'apparition d'une coloration rouge orangée.


·
· Anthocyanosides :

Doser la phase aqueuse, obtenu auparavant, avec du NaOH, s'il y a un virage de couleur à pH différent, ceci indique la présence des anthocyanosides.

L'apparition d'une couleur rouge à pH< 3 et bleue entre 4 et 6, caractérise les anthocyanosides [Benmehdi, 2000].

5- Alcaloïdes :

~JlJle,ce8

* Réactif de Mayer : 5 g de KI et 1,358 g de HgCl2 solubilisés dans 100 ml d'eau distillée.

* Réactif de Wagner : 2 g de KI et 1,27g d'I2 solubilisé dans 100 ml d'eau distillée.

Sur l'extrait éthanolique : Ce test est fait pour révéler la présence ou l'absence des alcaloïdes sels.

Evaporer 25 ml de l'extrait éthanolique à sec, ajouter 5 ml d'HCl 2N au résidu et chauffer dans un bain marie. Filtrer le mélange et réaliser les tests avec le réactif de Mayer et/ ou de Wagner. La présence de turbidité ou de précipitation indique la présence des alcaloïdes sels.

Sur l'extrait aqueux : Encore, ce test est typique pour les alcaloïdes sels dans un milieu aqueux.

Prendre 25 ml de l'extrait aqueux, ajouter 15 ml d'HCl 10%, porter l'ensemble à reflux pendant 30 mn, refroidir le mélange et l'extraire 3 fois avec l'éther diéthylique. Décanter et effectuer les tests sur les deux phases avec le réactif de Wagner ou de Mayer.

Sur l'extrait étherique : Ce test permet de révéler la présence ou l'absence des alcaloïdes bases. Pour cela, évaporer 10 ml de la solution étherique, dissoudre le résidu obtenu dans 1,5 ml d'HCl 2%. Ajouter quelques gouttes du réactif de Mayer. La formation d'un précipité blanc jaunâtre indique la présence des alcaloïdes bases [Benmehdi, 2000].

6- Amidon :

Traiter l'extrait aqueux avec le réactif d'Amidon. L'apparition d'une coloration bleue violacée indique la présence d'amidon [Benmehdi, 2000].

* Réactif d'Amidon : 1,2 g d'I2 et 2,5 g de KI solubilisés dans 500 ml d'eau distillée.

7- Anthraquinones :

Bouillir 1 g de la plante pendant quelques minutes en présence de 10 ml de KOH 0,5 N et 1 ml d'H2O2 à 5%. Refroidir le mélange, filtrer puis acidifier le filtrat avec l'acide acétique. Extraire la solution acide obtenue avec 10 ml de benzène. Agiter l'extrait benzénique an présence de 5 ml de NH4OH. Une réaction positive est révélée par la formation d'une couleur rouge au niveau de la couche alcaline [Benmehdi, 2000].

~JlJle,ce8

8- Huiles volatiles et acides gras :

Evaporer 20 ml de solution étherique, le résidu ainsi obtenu est dissout dans l'éthanol. La solution éthanolique obtenue est ensuite concentrée à sec (le résidu* qui reste après solubilisation est conservé pour le test d'acides gras). Un test positif est révélé par l'obtention d'un résidu arôme.

Le résidu* est saponifié en ajoutant 10ml de KOH 2 N. Ensuite extraire avec l'éther diéthylique. La phase étherique obtenue est évaporer à sec. Un test positif est révélé par l'obtention d'un résidu gras.

9- Emodols :

Evaporer 3 ml de l'extrait étherique. Ajouter 1 ml d'NH4OH. L'apparition d'une teinte vive variant de l'orangé rouge au violet pourpre, indique la présence des emodols.

~~ ~JlJle,ce8

Composé

Résultat obtenu

Tanins

+ avec l'extrait éthanolique et l'extrait aqueux.

Saponoside

Deux tests de détection et de caractérisation de cette famille de composé ont été réalisés révèlent la présence des hétérosides stéroidiques et triterpénique au niveau des trois extraits.

Flavonoides

+ avec l'extrait éthanolique.

Composés
réducteurs

+ avec l'extrait éthanolique et aqueux.

+ Anthracénosides : + avec l'extrait éthanolique. + Anthocyanosides : - avec l'extrait éthanolique. + Coumarines : + test réalisé sur la plante humide.

Alcaloïdes

- avec l'extrait éthanolique

+ avec l'extrait aqueux ? Alcaloïdes sels

+ avec l'extrait étherique ? Alcaloïdes bases

Amidon

- réalisé sur la plante entière.

Anthraquinone

- réalisé sur la plante entière.

Huiles volatiles

+ réalisé sur l'extrait étherique.

Acides gras

+ réalisé sur l'extrait étherique.

Emodols

- réalisé sur l'extrait étherique.

+ Résultat positif
- Résultat négatif

Tableau n° 1 : Les résultats des tests phytochimique réalisés sur les trois extraits et sur la
plante entière.

e11110,X08

Annexe 2

Dosage des protéines totales :

ces Préparation du réactif de Biuret : Le réactif contient :

· Tartrate de sodium st de potassium 21 mmol/l

· Sulfate de cuivre 7 mmol/l

· Hydroxyde de sodium 1.15 N

· Iodure de potassium 6 mmol/l

Pour la préparation, solubiliser la NaOH, ensuite ajouter les autres composants. ces Droite d'étalonnage :

On prépare différentes concentrations de la sérumalbumine humaine. Dans des tubes à hémolyse, mettre 1 ml du réactif de Biuret, ajouter 20 ul de la solution à doser (ou sérum) agiter et laisser reposer 30 mn. Lire l'absorbance à 540 nm. Le blanc contient que le réactif de Biuret.

0,8

y = 0,0064x
R2 = 0,9951

0,6

0,4

0,2

0

0 20 40 60 80 100

Concentration en protéines (g/l)

eilile«eleS

Annexe 3

Résultats des tests biologiques :

Remarque : les lignes en gris représentent la Moyenne #177; Erreur standard

Tableau 1 : Evolution de la glycémie (g/l) des rats normaux et diabétiques traités et témoins
durant les cinq semaines de traitement par 500 mg/kg d'extrait éthanolique.

Temps (semaine)

0

1

2

3

4

5

 

1,03

0,94

1,09

0,98

1,3

0,75

 

1,11

0,97

1,11

1,05

1,02

0,97

 

1,02

0,92

0,98

 
 
 
 

1,15

0,99

0,83

0,78

1,41

0,81

 

1,17

0,99

1,18

1

1,2

0,83

Normaux témoins

0,91#177; 0,03

0,96#177; 0,02

1,04#177; 0,07

0,95#177; 0,07

1,23#177; 0,1

0,84#177; 0,05

 

0,91

0,97

1

 
 

0,7

 

0,99

1,35

1,23

0,96

1,23

0,95

 

1,11

1,11

1,11

0,87

1,32

1,13

 

0,92

0,93

1,19

0,88

1,01

 
 

0,79

1,13

0,89

0,93

0,96

0,74

Normaux traités

0,94 #177; 0,06

1,10 #177; 0,8

1,08 #177; 0,07

0,91 #177; 0,02

1,13 #177; 0,1

0,88 #177; 0,12

 

5,56

1,13

2,03

1,9

3,82

5,73

 

3,83

2,57

4,34

4,84

4,87

5,69

 

3,32

1,09

1,56

0,83

1,14

2,36

 

4,01

4,16

5,01

4,48

5,93

6,65

Diabétiques témoins

4,18#177; 0,56

2,24#177; 0,84

3,24#177; 0,98

3,01#177; 1,13

3,94#177; 1,19

5,11#177; 1,09

 

3,65

1,36

3,01

1,64

3,05

 
 

3,47

1,29

1,91

1,78

1,85

1,64

 

3,91

3,29

3,91

2,58

4,07

3,69

Diabétiques traités

3,68#177; 0,16

1,98#177; 0,80

2,94#177; 0,71

2,00#177; 0,36

2,99#177; 0,79

2,67#177; 1,45

Tableau 2 : Evolution du poids (g) des rats normaux et diabétiques traités et témoins durant
les cinq semaines de traitement par 500 mg/kg d'extrait éthanolique.

Temps (semaine)

0

1

2

3

4

5

 

255

263

268

273

279

280

 

255

264

276

286

294

299

 

275

281

275

 
 
 
 

227

235

247

258

260

261

 

240

233

233

237

243

248

Normaux témoins

250,4#177; 9,02

255,2#177;10,32

259,8#177;9,5

263,5#177;12,17

269#177;12,85

272#177;12,88

 

235

233

230

234

244

255

 

258

258

265

278

285

290

 

231

231

235

239

242

250

 

267

267

272

277

281

 
 

248

248

248

246

256

262

Normaux traités

247,8#177;7,58

247,4#177;7,80

250#177;9,14

254,8#177;10,58

261,6#177;10,15

264,25#177;10,32

 

200

188

185

185

188

199

 

225

220

232

239

234

233

 

240

233

243

247

239

240

 

230

220

226

220

206

200

Diabétiques témoins

223,75#177;9,84

215,25#177;11,08

221,5#177;14,64

222,75#177;15,95

216,75#177;13,90

218#177;12,46

 

245

246

250

254

244

 
 

210

215

230

227

217

218

 

215

215

205

201

183

186

Diabétiques traités

223,33#177;13,43

225,33#177;12,69

228,33#177;15,99

227,33#177;18,8

214,67#177;21,68

202#177;22,63

Temps (semaine)

0

3

 

0,84

0,52

 

0,11

0,6

 

0,96

 
 

0,66

0,59

 

0,72

0,43

Normaux témoins

0,66#177; 0,16

0,54#177;0,05

 

0,96

 
 

0,84

0,51

 

0,86

0,55

 

0,38

 
 

0,88

0,31

Normaux traités

0,78#177;0,12

0,46#177;0,09

 

0,98

0,59

 

0,9

0,74

 

0,85

0,36

 

0,87

0,89

Diabétiques témoins

0,9#177;0,03

0,64#177;0,13

 

0,83

 
 

0,96

0,88

 

1,21

0,46

Diabétiques traités

1#177;0,14

0,67#177;0,30

Temps (semaine)

0

3

 

0,41

1,06

 

0,47

0,7

 

0,34

 
 

0,43

0,88

Normaux témoins

0,41#177;0,03

0,88#177;0,10

 

0,88

 
 

0,5

0,74

 

0,76

0,91

 

0,46

0,97

 

0,4

0,53

Normaux traités

0,60#177;0,10

0,79#177;0,11

 

1,03

1,42

 

0,77

1,98

 

0,42

1,39

 

1,52

1,42

Diabétiques témoins

0,94#177;0,27

1,55#177;0,16

 

0,53

1,53

 

0,73

0,84

 

1,89

0,45

Diabétiques traités

1,1#177;0,52

0,9#177;0,39

Tableau 3 : Evolution de la cholestérolémie Tableau 4 : Evolution de la triglycéridémie

(g/l) (g/l)

Tableau 5 : Evolution de la protéinémie (g/l).

Temps (semaine)

0

3

6

 

85,46

84,37

69,68

 

80,57

74,06

74,68

 

85,46

 
 
 

80,14

83,9

79,21

 

75,89

76,5

70,78

Normaux témoins

81,50#177;2,02

79,71#177;3,01

73,59#177;2,5

 

85,25

87,8

 
 

81,85

 

80,62

 

78,87

82,34

83,9

 

77,8

72,6

78,43

 

81,42

72,18

68,75

Normaux traités

8 1,04#177;1,45

78,73#177;4,42

77,93#177;3,77

 

82,91

81,56

83,59

 

71,63

86,56

72,34

 

75,25

74,53

73,59

 

89,72

92,8

77,03

Diabétiques témoins

79,87#177;4,67

83,86#177;4,47

76,63#177;2,91

 

82,06

 
 
 

85,04

74,06

83,75

 

81

83,43

75,46

Diabétiques traités

82,7#177;1,49

78,74#177;6,63

79,60#177;5,86

Tableau 6 : Test de réponse des rats traités pendant 5 semaines à 1 g/kg de l'extrait
éthanolique (glycémie en g/l)

Temps (heure)

0

1

3

 

0,83

0,64

0,75

 

0,85

0,82

0,64

 

0,92

0,82

0,52

Normaux témoins

0,87#177;0,03

0,76#177;0,07

0,64#177;0,08

 

1,06

0,69

0,75

 

1,15

0,57

0,68

 

1,17

0,77

0,81

Normaux traités

1,13#177;0,04

0,68#177;0,07

0,75#177;0,05

 

4,76

4,94

5,08

 

3,2

3,41

3,78

 

1,91

1,34

0,81

Diabétiques témoins

3,29#177;1,01

3,23#177;1,028

3,22#177;1,55

 

5,53

4,43

4,1

 

3,17

1,66

0,3

 

3,42

1,32

0,52

Diabétiques traités

4,04#177;0,92

2,47#177;1,21

1,64#177;1,51

Tableau 7 : Test de réponse des rats traités pendant 5 semaines à 1 g/kg de l'extrait
éthanolique (la diminution de la glycémie en %).

Temps (heure)

1

3

 
 
 
 

-3,78

-6,72

 

-6,56

-18,13

 

29,84

57,59

Diabétiques témoins

6,50#177;14,37

10,91#177;28,95

 

19,89

25,86

 

47,63

90,54

Diabétiques traités

42,98#177;15

67,06#177;25.39

Tableau 8 : Evolution de la glycémie (g/l) des rats suivis 7 heures après gavage (ou non) de 1 g/kg d'extrait éthanolique.

Temps (heure)

0

1

2

3

5

7

 

1,01

0,92

0,9

0,96

0,87

0,71

 

0,93

0,96

1,05

1,06

0,93

0,77

 

0,93

0,96

0,7

0,89

0,79

0,79

 

1,27

1,01

0,93

1,05

0,92

0,71

 

1,03

0,92

0,96

0,87

0,77

0,72

Normaux témoins

1,03#177;0,07

0,95#177;0,02

0,91#177;0,06

0,97#177;0,04

0,86#177;0,04

0,74#177;0,02

 

1,02

0,94

0,81

0,82

0,79

0,77

 

0,9

1

0,78

0,85

0,56

1,33

 

0,87

0,98

0,81

0,83

0,69

0,61

 

1,17

0,99

0,84

0,86

0,62

0,79

 

0,77

1,04

0,79

0,9

0,74

0,83

Normaux traités

0,95#177;0,08

0,99#177;0,02

0,81#177;0,01

0,85#177;0,02

0,68#177;0,05

0,87#177;0,14

 

3,8

3,76

3,9

3,78

4,5

3,15

 

4,24

4,39

3,96

3,63

3,88

3,1

 

3,31

3,11

3

2,83

3,76

3

Diabétiques témoins

3,78#177;0,33

3,75#177;0,45

3,62#177;0,38

3,41#177;0,36

4,05#177;0,28

3,08#177;0,05

 

2,95

2,78

2,25

2,03

0,88

0,56

 

2,17

2,1

1,82

1,97

0,79

0,66

 

3,69

3,01

2,92

2,18

 
 

Diabétiques traités

2,94#177;0,54

2,63#177;0,34

2,33#177;0,39

2,06#177;0,08

0,83#177;0,06

0,61#177;0,06

Tableau 9 : Pourcentage de diminution de la glycémie des rats diabétiques traités
(ou témoins) par 1 g/kg d'extrait éthanolique durant les sept heures qui suit le traitement.

Temps (heure)

1

2

3

5

7

 

1,05

-2,63

0,52

-18,42

17,1

 

-3,53

6,6

14,38

8,49

26,88

 

6,04

9,36

14,5

-13,59

9,36

Diabétiques témoins

1,19#177;3,37

4,44#177;4,42

9,80#177;5,66

-7,84#177;10,1

17,78#177;6,18

 

5,76

23,72

31,18

70,17

81,01

 

3,22

16,12

9,21

63,59

69,58

 

18,42

20,86

40,92

 
 

Diabétiques traités

9,13#177;5,73

20,23#177;2,70

27,10#177;11,44

66,88#177;4,65

75,30#177;8,08

Tableau 10 : Test de tolérance chez des rats normaux (glycémie en g/l) traités 1 heure (par 1
g/kg de l'extrait éthanolique) avant gavage de 3 g/kg de glucose.

Temps (mn)

0

30

60

90

120

 

1,21

1,48

1,48

1,24

1,23

 

1,19

1,42

1,5

1,25

1,14

 

1,07

1,17

1,09

1,27

1,17

 

1,04

1,18

1,38

1,04

1,19

 

1,07

1,52

1,18

1,34

1,2

Normaux témoins

1,12#177;0,4

1,35#177;0,08

1,33#177;0,09

1,23#177;0,05

1,19#177;0,02

 

0,74

1,89

1,63

1,61

1,61

 

0,9

1,5

2,15

1,93

1,79

 

0,75

1,36

1,18

1,18

1,35

 

0,96

1,28

1,42

1,09

1,33

 

0,95

2,37

2,15

2,14

2,08

Normaux traités préalablement

0,86#177;0,05

1,68#177;0,22

1,71#177;0,22

1,59#177;0,23

1,63#177;0,16

Sommaire

Introduction . 1

Synthèse bibliographique

I- Phytothérapie 2

I-1. Définition .. 2

I-2. Les chiffres de l'OMS . 2

I-3. Pourquoi le recours à cette forme de médecine ? .... 3

II- Diabète sucré ... 3

II-1. Présentation de la maladie 3

II-2. De l'hyperglycémie chronique aux complications organiques . 4

II-3. Le stress oxydant et les complications de la maladie 4

II-4. Traitement du diabète sucré 5

II-5. Les antidiabétiques : de l'efficacité à la toxicité 6

II-6. Avenir du traitement de la maladie ..... 7

III- Plantes antidiabétiques 7

III-1. Quelques exemples 7

IV- Zygophyllum geslini ..... 9

IV-1. Description botanique 9

IV-2. Usage 10
Matériels et méthodes

I- Etude chimique 11

I-1. Tests phytochimiques 11

I-2. Détermination de la teneur en flavonoides, tanins, et saponosides 11

II. Partie biologique 12

II-1. Préparation de l'extrait éthanolique . 12

II.2 Administration de l'extrait 13

II-3. Les animaux 13

II-4. Induction du diabète sucré chez le rat 13

II-5. Recherche de toxicité 13

II-6. Prélèvement du sang 14

II-7. Techniques analytiques des paramètres sanguins 14

II-8. Chronologie des testes biologiques 15

II-9. Evaluation du pouvoir antioxydant 16

III- Evaluation statistique 17

Résultats et interprétation

I- Partie phytochimique 18

II- Partie biologique 18

II-1. Toxicité de l'extrait éthanolique 18

II-2. Evolution de la glycémie pendant les 5 semaines 18

II-3. Evolution du poids des rats 20

II-4. Evolution des paramètres lipidiques 20

II-5. Evolution de la protéinémie 20

II-6. Test de réponse des rats à 1 g/kg de l'extrait étudié 22

II-7. Evolution de la glycémie à courte durée 22

II-8. Comparaison entre la réponse des rats à 1 g/kg : effet du traitement préalable.... 22

II-9. Test de tolérance au glucose 25

II-10. Evaluation du pouvoir antiradicalaire 26

Discussion 30

Conclusion 36

Références bibliographiques 37
Annexes

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"Ceux qui vivent sont ceux qui luttent"   Victor Hugo