Importance du prélèvement sanguin en hémostase:observations faites au cnhu de cotonou

2- LA PARASITOLOGIE

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Importance de la qualité du prélèvement sanguin en hémostase : Observations faites
au Centre National Hospitalier Universitaire Hubert Koutoukou MAGA de Cotonou

Les appareils utilisés sont entre autres le microscope optique, la hotte, la centrifugeuse, le mixeur. On y réalise les examens suivants : la coprologie parasitaire, le frottis sanguin + densité parasitaire, la goutte épaisse, le sérodiagnostic de Widal, la sérologie HIV, l'examen cytobactériologique des Urines simple, les sérologies rubéole et toxoplasmose.

- Le SéroDiagnostic de Widal (SDW)

C'est un test qui permet de poser le diagnostic biologique des salmonelloses et qui se fait sur du sérum. Le principe consiste en la recherche des agglutinines anti O et anti H dans le sérum du patient, correspondant aux antigènes O et H de Salmonella Typhi et de Salmonella Paratyphi A, B, C.

Pour cela, on utilise des suspensions antigéniques TO ; TH ; AO ; AH ; BO ; BH ; CO ; CH.

On dispose de neuf tubes à hémolyse que l'on numérote respectivement TH, TO, AH, AO, BH, BO, CH, CO et le numéro attribué à l'échantillon.

Dans les huit premiers tubes, on introduit 450 microlitres des réactifs TH, TO, AH, AO, BH, BO, CH, CO.

Dans le dernier tube, on réalise la dilution du sérum au dixième et l'on répartit 50 microlitres de sérum dilué dans chacun des tubes. Après homogénéisation vient la centrifugation puis on passe à la lecture. Une réaction positive se manifeste par une agglutination en flocons de neige persistante que l'on lit contre la lumière du jour en faisant une chiquenaude sur le bas du tube porté au niveau des yeux.

- Anti Strepto Lysine O (ASLO)

On réalise cet examen pour déterminer une infection à streptocoque. Le principe consiste en la recherche d'anticorps anti streptococciques, preuves du passage du streptocoque dans l'organisme.

Pour le faire, on mélange sur une microplaque, 50 microlitres du sérum et 50 microlitres du réactif ASLO. On mélange puis on agite la microplaque pendant deux minutes. Une réaction positive est traduite par une agglutination au fond de la microplaque.

3- LA BANQUE DE SANG (BDS)

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La BDS est le premier bâtiment situé juste à droite à l'entrée du CNHUHKM et comporte :

- le laboratoire où se font les examens de routine

- la salle de prélèvement des donneurs de sang

Au nombre des examens de routine, nous pouvons citer : le groupage sanguin ; le test de comptabilité ; la CRP (Protein C Reactive) ; la sérologie HBs ; la sérologie HCV ; le typage des CD4-CD8.

Tous ces examens se font sur du sang prélevé dans un tube sec sans gel.

- Le Groupage Sanguin et Facteur Rhésus (GSRh)

Cet examen est réalisé dans le but de déterminer le groupe sanguin des individus, ce qui est très important en cas de transfusion sanguine et comprend deux épreuves indissociables et complémentaires.

L'examen est résumé dans les schémas et le tableau ci-dessous :

Sérum test anti-A Sérum test anti-B Sérum test anti-AB Sérum test anti-D (Rhésus)

(bleu) (jaune) (incolore)

. . . .

Culot globulaire Culot globulaire Culot globulaire

Figure 1 : Schéma résumant l'épreuve globulaire du groupage sanguin et la détermination du Facteur Rhésus

Hématie test A Hématie test B Hématie test O Culot globulaire

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. . . .

Sérum Sérum Sérum Sérum

Figure 2 : Schéma résumant l'épreuve sérique du groupage sanguin

Tableau 1: Exemples de quelques résultats et commentaires de groupage sanguin possibles

Sujets	Epreuve globulaire Anti-A Anti-B Anti-AB	Facteur Rhésus	Epreuve sérique Hématie test A B O	Groupe sanguin
1	+++ --- +++	+++	- + -	A+
2	--- +++ +++	---	+ - -	B-
3	--- --- ---	+++	+ + -	O+
4	+++ +++ +++	+++	- - -	AB+

- La CRP (Protein C Reactive)

Cet examen se fait pour diagnostiquer une infection ou une inflammation de toute nature. On fait le test qualitatif et le test quantitatif (en cas de positivité).

Le test qualitatif se fait en mélangeant 50 microlitres du sérum et cinquante microlitres du réactif CRP OMEGA Avitex. Lorsqu'il y a agglutination, on passe au test quantitatif en vue du titrage de l'infection. Pour ce faire, on réalise des dilutions successives au demi, au quart, au huitième, ...

La CRP se fait sur une microplaque rectangulaire à fond noir ou blanc.

4- LA BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE

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Il existe deux paillasses à savoir la paillasse des diverses analyses et celle des urines.

A la paillasse des divers, se font les examens tels que :

- les prélèvements vaginaux + antibiogramme

- la spermoculture - le spermogramme - l'hémoculture

- l'étude du LCR

- l'étude du crachat

- les colorations (Gram spécifiquement)

C'est un service très sensible car les germes y sont régulièrement manipulés. La particularité dans ce service est l'utilisation des milieux de culture.

- Le prélèvement vaginal

Les prélèvements vaginaux permettent de différencier les différents types d'infections vaginales qu'elles soient d'origines parasitaires, mycosiques ou bactériennes.

Le matériel utilisé pour sa réalisation est constitué d'un spéculum stérilisé, de paires de gants, d'écouvillons stériles, de lames et lamelles.

Le mode opératoire est le suivant :

· La patiente est allongée sur une table gynécologique et plie les genoux en écartant les cuisses.

· Le spéculum est introduit verticalement, tout doucement dans le vagin. Lorsqu'il est introduit au 3/4, le retourner délicatement afin de le mettre en position horizontale.

· Presser légèrement le spéculum avec la main pour écarter les parois afin de chercher le col de l'utérus. Lorsqu'il est repéré, commencer à visser doucement.

· Effectuer deux prélèvements à l'aide d'écouvillons stériles au niveau de l'endocol et du cul-de-sac postérieur.

· Juste après le prélèvement, noter les résultats de l'examen macroscopique à savoir l'aspect du col (normal, saignant, inflammatoire, glaireux) ; l'aspect des leucorrhées (crémeux, caillé, purulent, mousseux, jaune, autres)

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· Faire l'état frais à la recherche de parasites (Trichomonas vaginalis, levures bourgeonnantes, filaments mycéliens, ...) Préciser l'aspect des leucocytes.

· Colorer les frottis du col de l'utérus et du vagin au Gram et rechercher à l'objectif X100, les coccobacilles, les bacilles de Doderlein et autres germes. Préciser leur importance (rares, assez nombreux, indénombrables)

· Conclure (flore normale, intermédiaire, anormale).

- La coloration de Gram

Elle est réalisée pour différencier les bactéries Gram+ des bactéries Gram- et se fait sur frottis confectionné. Le mode de réalisation est le suivant :

· Nettoyer le poste de coloration

· Réunir le matériel

· Fixer le frottis séché en passant trois fois le dos de la lame à la flamme

· Recouvrir la lame avec le violet de gentiane pendant une minute

· Rincer à l'eau de robinet

· Recouvrir la lame avec le lugol et attendre une minute

· Rejeter le lugol et rincer à l'eau de robinet

· Recouvrir la lame avec l'alcool à 95° pendant 45 secondes

· Rincer abondamment à l'eau de robinet

· Recouvrir la lame avec la solution de fuchsine et laisser agir pendant 20 secondes puis rincer et sécher

· Lire la lame colorée à l'objectif à immersion (X100)

5- L'HEMATOLOGIE

Ce service est le second bâtiment situé juste à droite à l'entrée du CNHU. Il est composé de deux unités : la clinique appelée Centre Universitaire des Maladies du Sang (CUMAS) et le laboratoire. Ce dernier se situe juste à côté de

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la clinique et est divisé en deux sections : la cytologie et l'hémostase. On y utilise les appareils comme les microscopes, les automates de la Numération Formule Sanguine, le coagulomètre (automate pour l'hémostase), la centrifugeuse, le spectrophotomètre.

En cytologie, se font les examens tels que la numération formule sanguine complète ; la numération des éosinophiles ; le dosage de l'hémoglobine ; la mesure de l'hématocrite ; les biopsies médullaires ; le médullogramme, ...

En hémostase, se font le Taux de Prothrombine (TP) ; le Temps de Saignement (TS) ; le Temps de Coagulation (TC) ; la Vitesse de Sédimentation (VS) ; le test de grossesse, le Temps de Céphaline Kaolin (TCK) ...

En ce qui concerne l'hématologie, on prélève le sang dans les tubes suivants :

- tubes avec anticoagulant (EDTA) pour tous les examens pratiqués en cytologie

- tubes avec anticoagulant (citrate) pour la VS

- tubes avec anticoagulant (citrate de sodium) pour tous les examens pratiqués en hémostase (TP, TCA, ...)

- tubes secs avec gel pour le test de grossesse. Ce test peut également se faire sur les urines.

- Numération des plaquettes sur frottis sanguin coloré

Les plaquettes sont des éléments très importants en hématologie et en hémostase. La méthode de comptage est la suivante :

- Bien homogénéiser le sang

- Tirer un frottis assez fin

- Faire une bonne coloration en évitant les dépôts de colorants

- Faire la mise au point à une partie du frottis où les globules rouges ne se chevauchent pas

- Compter par champ microscopique le nombre de globules rouges et le nombre de plaquettes et noter le nombre de plaquettes trouvé pour mille (1000) hématies.

Le calcul se fait de la manière qui suit :

Soit N le nombre de plaquettes trouvé pour 1000 globules rouges (GR) :

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Le nombre de plaquettes/ mm³ de sang = N X Nombre de GR/ mm³ de sang

1000

- Temps de Saignement (TS)

C'est un examen qui se fait directement sur le patient et il permet d'apprécier l'activité des plaquettes. On évalue ainsi le temps de formation du clou plaquettaire après un bris vasculaire.

Pour cet examen, on dispose de :

- tensiomètre

- chronomètre

- tampon

- vaccinostyle

- papier buvard

A l'aide du tensiomètre, on maintient la tension artérielle du patient à 40 millimètres de mercure. On choisit une partie non vascularisée du bras que l'on nettoie correctement avec le tampon d'éther ou d'alcool à 70°. A l'aide du vaccinostyle, on pique trois fois. On démarre le chronomètre dès les piqûres faites et on le stoppe à l'arrêt du sang. A l'aide du papier buvard, on absorbe le sang : c'est la méthode IVy 3 points. Le temps de saignement normal est inférieur ou égal à six minutes.

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II- Méthode d'étude 1- Echantillonnage

La partie technique de notre travail s'est déroulée au laboratoire d'hémostase du Centre National Hospitalier Universitaire Hubert Koutoukou Maga (CNHU-HKM).

Nous avons réalisé des prélèvements sanguins sur trente (30) individus de deux manières différentes.

Dans un premier temps, nous avons effectué les prélèvements de manière idéale, telle que décrite dans le présent document ; c'est-à-dire en utilisant la méthode Vacutainer (prélèvement sous vide). L'anticoagulant utilisé est le citrate de sodium à 3,8%.

Dans un second temps, nous avons réalisé, sur les mêmes individus, les prélèvements en ne respectant pas le rapport volume sang/ anticoagulant. L'anticoagulant utilisé est le citrate de sodium à 3,8%.

Nous avons donc deux (02) lots d'échantillons (Lot 1 : Prélèvements bien réalisés ; Lot 2 : Prélèvements mal réalisés) sur lesquels nous avons pratiqué les examens suivants à savoir le Temps de Céphaline Activé (TCA) et le Taux de Prothrombine (TP).

2- Procédure de réalisation des examens 2-1- Temps de Céphaline Activé (TCA)

C'est un test global qui explore la coagulation intrinsèque par le temps de recalcification du plasma pauvre en plaquettes en présence de céphaline (substitut plaquettaire) et d'un activateur (kaolin ; acide ellagique).