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Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21

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par Ghaith Ben Messaoud
Institut supérieur des technologies médicales de Tunis - Licence appliquée en biotechnologies médicales 2013
  

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VIII.2. Diagnostic indirect

VIII.2.1.Centrifugation en gradient de saccharose

L'ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose a permis la séparation des immunoglobulines (IgG et IgM) et de résoudre le problème chez la femme enceinte ayant en début de grossesse une suspicion de contamination rubéoleuse (signes cliniques et/ou anticorps à titre élevé). La présence d'IgM spécifique de la rubéole dans le sang du sujet indique qu'il y a une affection récente, alors que leur absence est en faveur d'une réponse du type secondaire chez un individu anciennement protégé. En plus des IgM, il y a habituellement présence d'IgG à titre supérieur.

La valeur de cet examen apparaît certaine, mais les IgM n'étant pratiquement plus décelables après un mois, dans le sang de la femme ne doit pas excéder cette valeur si on veut disposer de résultats interprétables ( Maurin et al., 1973).

VIII.2.2. Mesure de l'avidité spécifique des IgG

La mesure de l'avidité des IgG peut aider à dater l'infection (Picone et al., 2005).

On a montré que le test d'avidité des IgG est utile pour différencier entre une récente ou ancienne infection de la rubéole ou une réinfection, elle est particulièrement utile pour étudier la rubéole chez les femmes enceintes (Mubareka et al., 2007).

VIII.2.3. ELISA (Enzyme-Linked-Immuno Sorbent Assay)

Les techniques d'ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) sont des techniques sensibles et faciles à réaliser. La stabilité du virus (stabilité génétiques) fait que ce test sérologique est fiable (Ellakhdi et al., 2009).

La technique a été appliquée avec succès pour la détection des anticorps spécifiques de la rubéole.

? Presque les kits ELISA IgG spécifiques pour la détection de la rubéole sont tous disponibles dans le commerce et de type indirect, en utilisant l'antigène (Ag) de la rubéole fixé à une phase solide (microplaque de polystyrène des plaques ou des billes en plastique). La source de l'antigène (peptide, l'antigène du virus recombinant ou entier) affecte la sensibilité et la spécificité du test. Après le lavage et l'élimination des antigènes non liés, le sérum dilué est ajouté et incubé avec l'antigène immobilisé. Les anticorps spécifiques de la rubéole présents dans le sérum se lient à l'antigène. Ensuite, les anticorps non liés sont éliminés par lavage

ISTMT-IPT 2012-2013

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et un anti-IgG humain conjugué à enzyme est ajouté pour l'incubation. La quantité du conjugué qui se lie à chaque puits est proportionnelle à la concentration de l'anticorps de la rubéole spécifiques présents dans le sérum du patient. Les plaques sont ensuite lavées et le substrat est ajouté, il en résulte un développement de la couleur. La réaction enzymatique est arrêtée après une courte période d'incubation, et la densité optique est mesurée par un instrument lecteur ELISA.

? Les kits ELISA IgM disponibles dans le commerce pour la détection des IgM contre la rubéole spécifiques sont principalement de deux types:

A. ELISA indirecte: Le principe de l'essai a été décrit ci-dessus pour la rubéole IgG, sauf pour l'utilisation de l'enzyme et l'anti-IgM humain étiqueté comme conjugué. Dans cet essai, des résultats faux négatifs peuvent se produire en raison d'une concurrence dans le dosage entre les anticorps IgG spécifiques avec une forte affinité, tandis que l'IgM spécifiques à une plus faible affinité pour l'antigène.

B. ELISA IgM de capture: Dans ces essais l'anticorps anti IgM humain est fixé à la phase solide pour la capture des IgM sériques. L'antigène du virus de la rubéole est lié à un anticorps marqué par une enzyme pour détecter le complexe anticorps-antigène. Ce type d'essai permet d'éliminer la nécessité d'un prétraitement de l'échantillon avant le dosage (Mendelson et al., 2006).

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