Confession, coloration et examen des frottis

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D'ABOMEY-CALAVI (UAC)

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ECOLE POLYTECHNIQUE D'ABOMEY-CALAVI (EPAC)

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DEPARTEMENT DE GENIE DE LA BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

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2^ème ANNEE D'ETUDE

CONFESSION, COLORATION ET EXAMEN DES FROTTIS

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Réalisé par: Sous la direction du :

Christ AMOU Dr SONON Jules Arès

Année académique : 2012-2013

Sommaire

Introduction 3

1. CONFECTION DES FROTTIS SANGUINS 4

a. Conditions à observer pour confectionner un bon frottis sanguin 4

b. Qualités d'un bon frottis sanguin 5

c. Les frottis sur les lamelles 6

2. COLORATION PANOPTIQUE 6

a) Coloration MGG 6

b) Les résultats de coloration panoptique 7

Conclusion 10

Introduction

Le sang, liquide noble de l'organisme, baigne plusieurs types de cellules (hématies, globules blancs etc...) et les nutriments utiles au bon fonctionnement de l'organisme. Bon nombre d'entre ces cellules interviennent dans la défense de l'organisme contre les agents pathogènes ou corps étrangers (bactéries, virus, etc...). L'étude du sang peut donc nous apporter de nombreux renseignements sur notre état de santé par la détection de ses affections.
Pour une bonne étude du sang, il est nécessaire de réaliser un frottis sanguin, de procéder à sa coloration au MGG pour distinguer aisément les différents types globules par l'observation au microscope. La confection d'un bon frottis sanguin et la coloration panoptique feront donc l'objet de notre présent exposé.

Quelles sont les conditions à respecter pour la confection d'un bon frottis sanguin ? quelles sont les qualités d'un bon frottis sanguin ? Qu'est que la coloration MGG ? Et quels sont les résultats des colorations panoptiques ?

1. CONFECTION DES FROTTIS SANGUINS

Un frottis sanguin est un étalement d'une goutte de sang sur une lame de verre, dans le but d'observer les cellules qui y sont présentes et de les dénombrer. Il permet également de repérer d'éventuels parasites dans le sang comme l'agent du paludisme, Plasmodium falciparum. Pour atteindre ce but, le frottis doit subir une coloration pour révéler certaines cellules qui sans cela seraient transparentes, donc non visibles.

Le principe de confection d'un frottis consiste donc à étaler une goutte de sang uniformément sur une lame de verre, de manière à obtenir une seule couche de cellules, qui après coloration et fixation, pourra permettre d'effectuer l'étude morphologique des éléments figurés du sang, et de déterminer s'il y a anomalies de présence, d'aspect ou de nombre de cellules.

a. Conditions à observer pour confectionner un bon frottis sanguin

La réalisation ou la confection d'un frottis sanguin de bonne qualité ou d'un bon frottis sanguin doit suivre une procédure précise avec un minimum d'entrainement et une maitrise parfaite de la manipulation des produits sanguins. La réalisation d'un bon frottis nécessite également la maitrise des manipulations à effectuer en adéquation avec le matériel choisi. Il faut également disposer des équipements de protection individuelle (blouse propre et fermée, gants au moment des gestes à risque), avoir une très bonne approche de gestion des déchets et procéder éventuellement à la désinfection du matériel réutilisable par immersion dans la javel pendant au moins 15 minutes (l'alcool peut être utilisée) et de la paillasse en début et en fin de TP.

v Les matériels utilisés pour la confection d'un frottis sanguin

- Une aiguille stérilisée pour le prélèvement du sang

- Alcool à 90° (ou désinfectant)

- 2 lames de verre ou une lame et une lamelle

- Un microscope

- Eventuellement des colorants

v Mode opératoire

La procédure de réalisation ou de confection d'un bon frottis sanguin doit suivre les étapes suivantes :

- Disposer d'échantillon de sang ou faire le prélèvement du sang capillaire ou du sang veineux du sujet.

- Il faut homogénéiser le prélèvement ou l'échantillon de sang par des mouvements de retournement doux et successifs pour éviter l'apparition de caillot.

- Prélever, à l'aide d'une pipette bien propre et préalablement désinfectée, 10uL de sang

- Déposer la goutte de sang prélevée sur une lame en verre (environ 2cm x5 cm), dégraissée et identifiée à 1 cm environ du bord lame.  

- Placer le bord de la lame rodée ou de la lamelle sur la lame et glisser celle-ci jusqu'à ce qu'elle entre au contact avec la goutte, en maintenant un angle de 45°.

- La goutte de sang se répartir régulièrement par capillarité en une couche mince uniforme le long du bord de la lamelle en quelques secondes.

- Faire glisser alors la lamelle, jusqu'au bout, d'un mouvement assez lent et régulier en maintenant le contact et la pression nécessaire pour que le sang s'étale. Un bon frottis doit être contenu entièrement sur la lame, bords et franges compris.

- Si le frottis est jugé correct, sécher immédiatement le frottis en agitant à l'air par des mouvements d'éventails vifs. Temps de séchage minimum 5 minutes.

- Identifier enfin le frottis.

Le schéma suivant résume les directives sus citées.

b. Qualités d'un bon frottis sanguin

Les qualités d'un bon frottis sanguins sont relatives à sa présentation. Ainsi, un frottis de qualité doit respecter les critères suivants :


· II doit posséder une tête, un corps et une queue en empreinte de pouce


· II ne doit être ni trop mince (sinon pauvre en éléments), ni trop épais (sinon éléments rétractés non identifiables) et régulier avec des bords parallèles à la lame mais distants d'eux avec une extrémité arrondie. En un mot, il doit être sans franges excessives.


· Il ne doit atteindre ni les bords, ni les extrémités de la lame (sinon les éléments les plus volumineux seront perdus)


· II doit être correctement séché (sinon présence d'artefacts et les hématies seront crénelées)


· II ne doit pas présenter de stries verticales ou horizontales (cas où l'étalement est mal rodé) ou des trous (cas où la lame est mal dégraissée).

En un mot, un bon frottis sanguin doit être uniforme

c. Les frottis sur les lamelles

La procédure de réalisation d'un bon frottis sur lamelle est la suivante :

- Déposer une goutte de sang capillaire sur une lamelle couvre objet.

- Poser une deuxième lamelle sur la goutte de sang à 45 degrés de la première.

- Tirer rapidement sur un angle de la lamelle supérieure en maintenant la lamelle inférieure avec l'autre main afin de permettre un étalement homogène du sang suivant l'arête de la lamelle.

- Le frottis, une fois jugé bon, est rapidement séché à l'air a l'abri des poussières.

2. COLORATION PANOPTIQUE

a) Coloration MGG

La coloration permet de réaliser la formule sanguine et médullaire. Le principe de cette coloration repose sur l'action combinée de deux colorants neutres: le May-Grünwald (contenant un colorant acide, l'éosine, et un colorant basique, le bleu de méthylène) et le Giemsa dilué au 1/10 (contenant lui aussi de l'éosine, et un colorant basique, l'azur de méthylène). Il existe deux colorants de Giemsa : le Giemsa rapide (Giemsa R) et le Giemsa lent (Giemsa L). Le Giemsa R est préparé de façon à permettre une action colorante en 10 minutes. Il est utilisé pour les frottis secs et les gouttes épaisses. Le Giemsa L est préparé de façon à permettre une action colorante en 20 minutes. Il est utilisé pour les frottis humides et les coupes.

Le May-Grünwald et le Giemsa anges neutres aux propriétés bien distinctes. Ils ne sont pas actifs en milieu alcoolique et n'agissent de façon sélective qu'au moment de leur libération en solution aqueuse tamponnée de P^H=7. Cette libération provoque la précipitation des colorants neutres. Le May-Grünwald colore les éléments acidophiles ainsi que les granulations neutrophiles des leucocytes. Le Giemsa colore le cytoplasme des monocytes, des lymphocytes et la chromatine des noyaux.

Mode opératoire

Il existe en général deux technique pour faire la coloration du frottis sanguin. Ces deux techniques de colorations se présentent comme suit :

· Technique de Coloration par recouvrement

Elle consiste à :

- Couvrir le frottis avec l ml de May-Grünwald pur pendant 3 minutes

- Ajouter avec précautions 1 ml de solution tampon et réaliser le mélange sans débordement

- Eliminer l'excès de colorant par égouttage ou rinçage rapide.

- Couvrir le frottis avec la solution de Giemsa R dilué dans une solution tampon au 1/30

- Laver rapidement à l'eau courante ou dans une solution tampon

- Laisser la lame sécher à l'air.

- Attendre le séchage complet avant observation au microscope.

· Technique de Coloration par bain

Elle consiste à :

- Faire un bain de May-Grünwald pur

- Faire un bain de Solution tampon

- Faire un bain de Giemsa R dilué dans une solution tampon au 1/20

- Laver rapidement le frottis à l'eau courante ou dans une solution tampon

- Laisser la lame sécher à l'air.

- Attendre le séchage complet avant observation au microscope.

b) Les résultats de coloration panoptique

Lorsque le frottis coloré est bien sèche, on passe à l'observation qui se fait au microscope à l'objectif 40 X ou à l'immersion (100 X et oculaires faibles) afin de voir les résultats et de les interpréter. Si on utilise un grossissement plus puissant on verra mieux les détails des cellules. Il faut déplacer la lame en faisant des "créneaux" pour ne pas repasser au même endroit et compter 100 leucocytes (ou mieux 200) ce qui donne immédiatement le résultat. Au laboratoire on utilisera un compteur de cellules pour le comptage. A cause de la coloration MGG les cellules pourront se distinguées aisément car chaque type de cellules a sa couleur spécifique et ses caractéristiques propres. Ainsi nous avons :

v LES ERYTHROCYTES

Les érythrocytes sont dépourvus de noyau (chez les vertébrés, seuls les globules rouges des mammifères n'ont pas de noyau). Leur forme typique est celle d'un gâteau affaissé au centre. Vus au microscope, ils ressemblent à des disques roses plus pâles au centre. Ils sont parfois empilés comme des pièces de monnaie.

v LES PLAQUETTES

Les plaquettes ne sont pas de véritables cellules. Ce sont des disquettes de petite taille ayant un diamètre d'environ 3 um. Après la coloration au Giemsa, elles prennent une couleur pourpre plus intense que les globules rouges.

v LES LEUCOCYTES

Contrairement aux globules rouges, les leucocytes (globules blancs) ont un noyau. Celui-ci est facile à observer au microscope, mais seulement après la coloration du frottis. Le noyau de ces cellules peut révéler des lobes multiples, ou il peut être indenté ou en forme de rein (réniforme). Habituellement, la forme du noyau des différents types de leucocytes est variable. Conjointement aux différentes couleurs des granules, la forme du noyau aident à reconnaître ces cellules. Les leucocytes se divisent en granulocytes et en cellules lymphoïdes.

ü Les granulocytes

Leur cytoplasme est riche en granules qui prennent des couleurs particulières les rendant faciles à reconnaître. Le noyau est condensé en petites masses, ou lobes. On compte trois types de granulocytes : les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles.

- Les neutrophiles sont les leucocytes qui présentent un cytoplasme clair, acidophile et des granulations neutrophiles violettes régulières très fines et nombreuses. Leur noyau est divisé de 2 à 5 lobes reliés par un mince filament nucléaire.

- Les éosinophiles sont assez rares dans le sang. Leur taille est la même que celle des neutrophiles. Leur noyau comporte généralement deux lobes. Leur cytoplasme est clair, acidophile presque pas visible et rempli de nombreuses granules rondes qui prennent une couleur rose orangée caractéristique.

- Les basophiles sont les leucocytes les plus rares qui présentent un cytoplasme acidophile clair avec de très nombreuses granules qui prennent une couleur pourpre foncée pouvant recouvrir le noyau anguleuses bleu-violet foncé.

ü Les cellules lymphoïdes (ou agranulocytes)

Elles ont un noyau compact et un cytoplasme transparent. Il existe deux types de cellules lymphoïdes : les lymphocytes et les monocytes. Leur apparence est semblable, mais leur origine est différente. En fait, alors que les lymphocytes proviennent des organes lymphatiques, les monocytes ont la même origine que les granulocytes.

- Les lymphocytes sont de petits leucocytes, mais quand même un peu plus gros que les globules rouges ayant un cytoplasme transparent. Le noyau est gros et arrondi en comparaison de la cellule et en occupe la majeure partie. Selon la quantité de cytoplasme, les lymphocytes se divisent en petits et grand.

· Les petits lymphocytes présentent un noyau rond et dense et un cytoplasme basophile bleu clair et sans granulations.

· Les grands lymphocytes présentent un noyau rond ovale ou en drapeau, un cytoplasme bleu très clair et quelques rares granulations azurophiles en paquet.

- Les monocytes sont les plus gros leucocytes : ils mesurent de 16 à 20 um. Ils ont un grand noyau rond ou encoché ou réniforme ou en forme de fer à cheval, dans certains cas à deux lobes. Le cytoplasme est basophile clair, mais à l'apparence du verre dépoli avec des granulations azurophiles très fines et très nombreuses.

Conclusion

La confection d'un frottis consiste à étaler une goutte de sang uniformément sur une lame de verre, de manière à obtenir une seule couche de cellules. C'est donc un acte qui nécessite beaucoup de délicatesse. Pour confectionner un frottis sanguin de bonne qualité ou d'un bon frottis sanguin il est impératif de suivre une procédure précise avec un minimum d'entrainement et une maitrise parfaite de la manipulation des produits sanguins et des matériels choisis, de disposer des équipements de protection individuelle, de bien gérer les déchets et de procéder à la désinfection du matériel et de la paillasse en début et en fin de TP.

Un bon frottis sanguins doit être sans franges excessives, pas trop épais, ni présenté des stries verticales ou horizontales, ni de trous mais uniforme et ne doit pas toucher les bords de la lame. Lorsque que le frottis est jugée bon, on le passe à la coloration MGG qui permet de distinguer aisément les différents types de cellules afin de les dénombrer par une observation au microscope.