Memoire Online - Développement d'une technologie en bactériologie : l'aromatogramme

La réalisation d'un AG est semblable à celle d'un antibiogramme : on ensemence un milieu de culture gélosé, puis on y dépose des disques imbibés d'huile essentielle, à l'aide de micropipettes de 5 et de 10 uL. Les géloses sont ensuite retournées et mises à incuber à 37°C. La lecture des résultats se fait après 18 à 24h d'incubation. Le diamètre du halo d'inhibition pour chaque huile essentielle testée est ensuite mesuré.

Dans cette étude, nous cherchons un protocole qui permette de comparer les effets antibactériens in vitro de différentes huiles essentielles sur un même germe, comme on le ferait pour les antibiotiques avec un antibiogramme : il permettrait d'observer des halos d'inhibition autour des disques, plus ou moins grands selon les huiles essentielles. Nous utiliserons un témoin négatif, c'est-à-dire un disque seul ou un disque imbibé d'huile végétale (HV), ici de l'huile de sésame, qui nous permettra de confirmer que les halos d'inhibition observés, et donc les effets antibactériens, sont bien dûs à l'effet de l'huile essentielle et non à une contamination des disques, ou encore une inhibition par la phase huileuse. La répétabilité du protocole est également un critère : avec un même protocole, des germes et des HE identiques, on doit obtenir le même résultat.

Nous avons considéré plusieurs paramètres nous permettant d'optimiser notre protocole : le milieu de culture utilisé, les disques utilisés et le volume déposé sur le disque, la composition déposée sur le disque (utilisation ou non d'un dispersant, dilution de l'HE ou non), la condition de dépôt de l'HE et enfin la quantité de disques à disposer sur une même plaque. Nous nous sommes appuyés pour cela sur des articles de la littérature (34) (35) (38) (41) (44) (47) (48) (49) ainsi que sur des informations issues de laboratoires pratiquant les AG, comme LABOVET CONSEIL, VEBIO ou BACTOLAB.

Nous avons utilisé des milieux gélosés Mueller-Hinton (voir Annexe IX), le milieu standardisé recommandé pour les antibiogrammes : celui-ci est non sélectif et permet la culture de l'ensemble des bactéries peu exigeantes. Néanmoins, celui-ci ne permet parfois pas la culture de certaines bactéries particulièrement exigeantes (Haemophilus ssp. par exemple) : nous avons donc également testé l'utilisation d'une gélose Mueller-Hinton enrichie au sang.

Différents disques ont été testés : des disques de papier buvard classique de 4 mm de diamètre, ces mêmes disques utilisés en double épaisseur (superposition de deux disques) et des disques en cellulose de 6 mm de diamètre (DUTSCHER ref 074074), classiquement utilisés pour les antibiogrammes. Des volumes de 10 uL et de 5 uL d'HE ont été testés.

Nous avons considéré différentes compositions de solution à déposer sur le disque : HE pure ou HE diluée (à des dilutions 4/5, 3/5, 2/5 et 1/5), en utilisant de l'huile végétale (HV) de sésame pour effectuer ces dilutions. Nous avons également testé l'utilisation d'un dispersant, le Diméthylsulfoxyde (DMSO), permettant la solubilisation des huiles et ainsi potentiellement une meilleure diffusion de celles-ci sur la gélose.

Deux conditions de dépôt de l'HE ont été testées : le dépôt de l'HE sur le disque alors que celui-ci n'avait pas encore été déposé sur la gélose, et le dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la gélose.

Enfin, nous avons testé divers nombres de disques imbibés d'HE sur une même plaque : 3, 5, 6 et 10.

Le protocole exact de chaque AG réalisé est décrit en Annexe V. Les diamètres des halos d'inhibition ont ensuite été mesurés à la règle directement sur la boîte de Pétri ainsi que via le logiciel ImageJ, suite aux photographies réalisées. L'échelle a été faite en se basant sur le diamètre des disques, qui était connu pour chaque AG, et offrait une meilleure précision que la taille de la boîte de Pétri.

Figure 3 - Aromatogramme n°8, réalisé avec Staphylococci en utilisant une double épaisseur de disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 10 uL ou de 5 uL d'HE d'origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E), après une incubation de 18h à 37°C.

Nous observons notamment ce phénomène au niveau des disques imbibés d'HE d'Origan vulgaire (voir Figure 2).

Au contraire, les géloses Mueller-Hinton non enrichies permettent une bonne lisibilité des halos d'inhibition.

Figure 4 - Aromatogramme n°12, réalisé avec Klebsiella en utilisant des disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 5 mL d'HE d'Origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E) ou disque seul (1), après une incubation de 18 h à 37°C

Figure 5 - Aromatogramme n°5, réalisé avec Klebsiella et Escherichia coli, en utilisant des disques de papier buvard de 4 mm de diamètre, imbibés d'un volume de 10 mL d'HE de Tea Tree (T) et de Lavande (L), ou disque seul (1), après une incubation de 18h à 37°C

Lors de l'utilisation de disques de papiers buvard classiques de 4 mm, nous avons constaté que peu importe le volume utilisé, celui-ci est trop important, et l'huile déborde autour du disque (voir Figure 3 et 4).

Au contraire, l'utilisation d'une double épaisseur de ces mêmes disques a permis une imprégnation des disques de manière homogène, sans que l'huile ne déborde sur la gélose, et ce peu importe le volume utilisé. Nous observons alors des halos réguliers, bien identifiables. Nous observons par ailleurs des halos d'inhibition plus nettes et plus larges pour un volume de 5 uL, montrant une meilleure diffusion de l'huile sur la gélose.

L'utilisation de disques de cellulose de 6 mm a permis une absorption optimale de l'huile. Néanmoins nous observons parfois des halos d'inhibition peu nets, montrant une moins bonne diffusion de l'huile qu'avec l'utilisation d'une double épaisseur de disques. Nous ne remarquons pas de différence significative entre un dépôt de 5 uL ou de 10 uL.

L'utilisation d'HE diluée n'a donné que peu de résultats : nous n'observons alors que des halos faibles voir inexistants.

Les dispersants utilisés, disposés seuls (savon liquide ou DMSO), n'ont pas montré d'action antibactérienne (on n'observe aucun halo d'inhibition autour du témoin négatif). Néanmoins, leur utilisation n'a pas donné de différences au niveau des résultats. Au contraire, leur utilisation avait pour effet une concentration moins importante d'HE dans le disque, et ainsi des halos d'inhibition moins importants.

Lorsque le dépôt de l'HE sur le disque est réalisé avant que le disque ne soit déposé sur la gélose, nous observons alors que l'huile/la solution déposée a tendance à transpercer, laissant des traces sur le plan de travail : on ne peut alors plus quantifier de manière précise la quantité d'HE contenue par le disque une fois celui-ci déposé sur la gélose.

Nous n'avons observé aucune différence entre les plaques sur lesquelles étaient disposées 3, 5 ou 6 disques d'HE, qu'il s'agisse de la croissance bactérienne ou des halos d'inhibition. Néanmoins, au niveau des géloses sur lesquels 10 disques d'HE ont été déposés, nous observons parfois une croissance bactérienne moindre. De plus, les halos d'inhibition étant parfois confondus, la lecture des résultats est difficile (voir Figure 5).

Figure 6 - Aromatogramme n°9, réalisé avec Escherichia coui en utilisant une double épaisseur de disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 10 uL ou de 5 uL d'HE d'origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E), après une incubation de 18h à 37°C.

Via l'utilisation des différentes techniques énoncées, nous avons pu mesurer des diamètres de halos d'inhibition. Vous trouverez dans le tableau suivant ces différents diamètres. La mention « > 15 mm » est indiquée lorsque le halo d'inhibition est trop grand et se confond avec ceux des autres HE, ce qui empêche une mesure plus précise. La mention « Æ » est indiquée lorsqu'aucun halo n'est observé. Les photographies des AG correspondants sont visibles dans l'Annexe VI.

Figure 7 - Diamètres des halos d'inhibition pour chaque HE testée et pour chaque germe testé.

HE testée Bactérie testée	Achillée millefeuille	Eucalyptus globuleux	Origan vulgaire	Pin sylvestre	Tea Tree
Staphylococcus pseudointermedius 1 (A8, A10)	8 mm	9 mm	22 mm	0	12 mm
Staphylococcus pseudointermedius 2 (A13)	12 mm	11 mm	21 mm	10 mm	16 mm
Staphylococcus pseudointermedius 3 (A14, A16)	12 mm	17 mm	28 mm	14 mm	17 mm
Staphylococcus pseudointermedius 4 (A18)	0	0	27 mm	10 mm	0
Klebsiella ssp. 1 (A12)	10 mm	8 mm	27 mm	0	23 mm
Klebsiella ssp. 2 (A19)	16 mm	> 15 mm	> 15 mm	> 15 mm	> 15 mm
*Escherichia coli* (A9, A11)	8 mm	9 mm	22 mm	0	12 mm
*Pasteurella multocida* (A15, A17)	0	12 mm	40 mm	10 mm	14 mm
*Corynebacterium pyogenes* (A19)	12 mm	18 mm	> 15 mm	14 mm	14 mm

Les disques de papiers buvards de 4 mm de diamètre ne disposent pas d'une capacité d'absorption suffisante pour la réalisation d'AG. L'utilisation d'une double épaisseur de ces disques permet de résoudre ce problème, alors l'absorption de 10 uL ou de 5 uL est possible et donne de bons résultats. De même, les disques de cellulose de 6 mm ont une absorption suffisante pour 5 uL et pour 10 uL, et sont plus pratiques d'utilisation, mais donnent lieu à des résultats moins nets. Ces deux techniques pourront donc être utilisées pour la réalisation d'AG. En ce qui concerne la littérature, d'après CUNTZMANN A. (48), FONTANAY S. et al. (11), TOURE D. (38) et DE BILLERBECK V-G. (46), les disques de cellulose de 6 mm sont les plus utilisés. Il pourrait être intéressant de tester l'utilisation de disques de 6 mm d'une plus grande

épaisseur, qui pourrait permettre une diffusion de l'HE plus homogène et ainsi des résultats plus nets. Le volume déposé des études précédentes est variable : 20 uL pour TOURE D. (38), 15 uL pour GUINOISEAU E. (39), 10 uL pour FONTANAY S. et al. (11), CUNTZMANN A. (48), VEBIO et BACTOLAB, 8 uL pour CHABENAT H. (41) et enfin 5 uL pour LABOVET CONSEIL. En effet, tant qu'on dispose de disques avec une absorption suffisante, la quantité déposée semble importer peu sur les résultats obtenus. Ces différences entre les études empêchent par contre une comparaison rigoureuse entre elles : cela justifie à nouveau la nécessité de la mise en place d'un protocole standardisé.

Contrairement à ce que l'on retrouve dans la littérature, où il est fait usage de DMSO comme dispersant, permettant de pallier à des difficultés de diffusion des huiles (BOUTABIA L. et al. (47), TOURE D. (38), GUINOISEAU E. (39), FONTANAYS S. et al. (11), CHABENAT H. (41)), nous avons obtenus de meilleurs résultats via l'utilisation d'une solution d'HE pure. Cela permet d'éviter de possibles interactions entre l'HE et le dispersant, qui inhiberaient le pouvoir antibactérien (le Tween 80, un dispersant, était par exemple recommandé par CRÉMIEUX A. et al. en 1981 comme neutralisateur des désinfectants phénoliques (41)). Il s'agit d'ailleurs de la procédure utilisée par les laboratoires VEBIO, LABOVET CONSEIL et BACTOLAB (Annexe I, II, III et IV).

Grâce à l'utilisation de l'AG, nous avons pu quantifier et observer l'effet antibactérien de certaines HE sur des souches bactériennes spécifiques. Néanmoins, il est important de savoir que ces résultats ne sont pas généralisables. En effet, les HE sont des composés complexes (voir la notion de chémotype explicitée précédemment), qui peuvent avoir une composition sensiblement différente selon différents paramètres. De même, différents variants chez les

bactéries peuvent expliquer leur résistance ou leur sensibilité plus ou moins accrue à certains composés (comme on peut l'observer avec les antibiogrammes). Il est difficile d'affirmer qu'une HE en général est efficace sur une espèce bactérienne en général. L'AG est donc plutôt une technique à utiliser au cas par cas, dans le but de trouver la (ou les) HE adaptée(s) à un patient, et non pas de définir des cas généraux. Cette limite est soulignée par ZITI-FREVILLE N. (34) et DA SILVA F. (45).

Par ailleurs, nous avons pu observer que l'HE d'Origan vulgaire est efficace sur l'ensemble des germes testés, tandis que l'HE de Pin sylvestre n'est que très peu efficace. Ces résultats sont à nuancer : en effet, ils peuvent être dûs à une différence de pouvoir antibactérien, mais également à une différence de capacité de diffusion. L'AG en milieu solide favorise les HE ayant une grande capacité de diffusion en milieu solide, au détriment d'autres HE diffusant moins bien mais pouvant être tout autant efficaces, limite énnoncée par DA SILVA F. (45) et FONTANAY S. et al. (11).

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2. MÉTHODES