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Activité anti-oedémateuse de l'extrait aqueux des feuilles de petiveria alliacea ; de moringa oleifera et de ocimum gratissimumpar Dona Géraud Enock Gbedinhessi Université d'Abomey-Calavi - Licence Professionnelle 2017 |
II.3.2. Répartition géographiqueO. gratissimum se trouve dans les régions tropicales et subtropicales, sauvages et cultivées. Sa plus grande variabilité se produit dans l'Afrique tropicale (d'où elle provient probablement) et en Inde. En Asie du Sud-Est, il est cultivé principalement comme culture de jardin domestique, mais seul au Vietnam, il est cultivé à l'échelle commerciale [41]. II.3.3. Usages O. gratissimum est cultivé à cause de sa contenance en l'huile essentielle (feuilles et tiges). En Indonésie (Sumatra), un thé est fabriqué à partir de feuilles, tandis qu'en Thaïlande, les feuilles sont appliquées comme arôme. En Indonésie, le type Eugenol de O. gratissimum est utilisé dans le lavage cérémonial des cadavres et est planté dans les cimetières. En Inde, O. gratissimum, nommé «ram tulsi », est largement utilisé dans les cérémonies et les rituels religieux. La plante entière et l'huile essentielle ont de nombreuses applications en médecine traditionnelle, en particulier en Afrique et en Inde. La décoction de la plante est utilisée pour le traitement des troubles d'estomac, des maux de tête et de la grippe. Les graines ont des propriétés laxatives et sont prescrites contre la gonorrhée. L'huile essentielle est appliquée contre la fièvre, les inflammations de la gorge, des oreilles ou des yeux, la diarrhée et les maladies de la peau. Il est testé comme antibiotique. L'huile essentielle est également un insectifuge important [41]. La revue documentaire minutieusement effectuée nous a permis de constater que Petiveria alliacea, Moringa oleifera et Ocimum gratissimum ont été objet de plusieurs études scientifiques mais très peu sur l'activité anti-oedémateuse. HYPOTHESES & OBJECTIFS 18 Hypothèses La réponse à la problématique posée dans cette recherche nous amène à émettre les hypothèses suivantes : - les feuilles du Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum sont faiblement toxiques. - les feuilles du Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum ont un effet anti-oedémateuse ; Objectif Général : La présente étude a pour objectif de donner des bases scientifiques à l'utilisation des feuilles du Petiveria alliacea; de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum. Au cours de l'étude, l'activité anti-oedémateuse des décoctions issues des feuilles ont été évaluées sur le rat wistar. De façon spécifique, il s'agit de : - déterminer la toxicité aigüe de l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum ; - vérifier l'activité anti-oedémateuse des feuilles du petiveria alliacea, de moringa oleifera et de Ocimum gratissimum. MATERIEL & METHODES 20 I. CADRE DE L'ETUDE Il s'agit d'une étude transversale de type expérimentale. Elle a été réalisée : Au laboratoire de physiologie de l'effort de l'INJEPS (LA.P. EF), Porto-Novo. A l'annexe du laboratoire de pharmacognosie de la FSS et la FAST situé dans l'enceinte du Centre Béninois de Recherche Scientifique et Technique (CBRST), annexe de Porto-Novo. PRESENTATION DE LA ZONE D'ETUDE
Figure 3. Carte de la ville de Porto-Novo [42] situé au sud du Bénin à 30 km de Cotonou, la ville de Porto-Novo est localisée entre 6°30 de latitude nord et 3°30 de longitude Est. Elle est limitée au Nord par la commune d'Avrankou, au Sud par la commune de Sèmè-kpodji, à l'Est par la commune d'Adjarra et à l'Ouest par la commune des Aguégués. Porto-Novo a gardé, malgré les aléas de l'histoire et l'ascension de la ville de Cotonou, son statut de « Capital du Bénin ». Elle couvre une superficie de 52 km2 soit 0,05% du territoire national et compte 223.551 habitants [43]. 21 Le climat est subéquatorial où l'année se divise en quatre saisons dont deux saisons sèches (mi-Novembre à mi-Mars et mi-Juillet à mi-Septembre) et deux saisons de pluie (mi-Mars à mi-Juillet et mi-Septembre à mi-Novembre) qui sont d'ailleurs des périodes favorables pour la récolte des plantes [44]. Sur le plan pluviométrique, une moyenne de 1200 mm est enregistrée à Porto-Novo durant ces dernières années, le niveau le plus élevé de tout le pays. De Décembre à Janvier, souffle l'harmattan, un vent froid et sec qui crée une forte amplitude thermique pendant la journée. La municipalité de Porto-Novo a un relief très peu accidenté et dispose de trois types de sol : les sols des plateaux, les sols de bas de pente et les sols des bas-fonds [44]. Ville du 17è siècle créée autour de trois chasseurs yoruba, elle est devenue progressivement la cité au trois noms : « Hogbonou », « Adjatchè » et « Porto-Novo ». Cinq arrondissements y sont installés : Houèzoumè, Attakê, Djassin, Houinmè et Ouando. De nos jours, il existe une mosaïque d'ethnies qui cohabite à Porto-Novo. Les Goun et fon sont majoritaires (66%), suivis des Yoruba (25%) et des Adja, Mina et Toffin (4%). Les autres ethnies sont composées de Bariba, Dendi, Yom-Lokpa, Otamari et Peulh etc (5%). Ce brassage ethnique est aussi à la base de la diversité des activités économiques de la ville. En effet, les commerçants Yoruba ont développé l'activité commerciale alors que les Goun et les Fon s'investissent beaucoup dans l'agriculture et le transport. Quant aux autres ethnies, elles se retrouvent dans la fourniture des services, dans les buvettes et restaurants et dans les divers [44]. La vie spirituelle de la municipalité de Porto-Novo est animée par plusieurs religions. Chacune d'elles prêche pour la culture de la paix, de la tolérance mutuelle et de la cohésion locale et nationale. Trois catégories de religions peuvent être distinguées : la religion traditionnelle (29,20%), la religion chrétienne (45,70%) et l'islam (25,10%). L'identité culturelle propre à la ville de Porto-Novo repose sur le triptyque des croyances ancestrales et le syncrétisme religieux que constituent la croyance en Dieu suprême, créateur de l'univers et le culte des ancêtres connu sous l'appellation « Vodoun » en Goun ou « Oricha » en Yoruba. II. MATERIEL II.1. MATERIEL VEGETAL Le matériel végétal est constitué des feuilles de Petiveria Alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum qui ont été séchées pendant trois semaines à l'abri du soleil et de l'humidité à l'annexe du laboratoire de pharmacognosie de la FSS et la FAST située dans l'enceinte du Centre Béninois de Recherche Scientifique et Technique (CBRST), annexe de Porto-Novo. Ensuite, elles ont été pulvérisées par broyage. La poudre obtenue a servi à la préparation des extraits. II.2 Matériel animal Des rats wistar de masse corporelle de 190 #177; 12 g (Photo 4) ont été obtenus à l'animalerie du Laboratoire de Cytogénétique de l'ISBA à Cotonou. Ils ont été nourris au son de blé, au tourteau de maïs et à l'eau courante de robinet. L'enceinte d'élevage a été régulièrement nettoyée pour garantir un développement optimal des animaux à l'abri de toute infection. Les animaux ont été gardés dans des cages métalliques grillagées de dimension (50 x 30 x 20 cm3), munies de mangeoires et d'abreuvoirs. Le fond des cages est constitué par un système de tiroir amovible garni de copeaux de bois recueillant les fèces et les urines au travers d'une base en treillis.
22 Photo 4. Rat wistar Source: Kiki, 2017 23 II.3. EQUIPEMENTS-CONSOMMABLES-REACTIFS La liste des équipements, consommables et réactifs est disponible en annexes 2. III. METHODE Nos travaux se sont déroulés en trois phases : une phase préparatoire, une phase expérimentale et l'analyse statistique des données. III.1. PHASE PREPARATOIRE Elle consiste en : Récolte, séchage, broyage et obtention de l'extrait aqueux. III.1.1. Récolte, séchage, broyage Ces feuilles ont été récoltées en février 2017 à djavi dans la Commune d'Adjara et séchées pendant plusieurs jours dans un endroit sec et à l'abri des rayons solaires à l'annexe du laboratoire de pharmacognosie et des huiles essentielles (LAPHE) de la FSS et la FAST. Elles ont été broyées par des broyeurs « Of flour mills Nigeria, de type EL MOTOR N 1827 ». Cela a permis d'obtenir une poudre qui a servi à l'obtention de l'extrait aqueux à chaud de chacune d'elles. III.1.2. Obtention des extraits aqueux à chaud Les extraits sont obtenus par décoction de 50g de poudre de feuilles dans 500mL d'eau distillée bouillante pendant 30 minutes grâce à une plaque chauffante. Le mélange refroidi est ensuite filtré deux fois successivement avec du coton hydrophile. Le filtrat est enfin soumis à une évaporation à 50°C à l'aide d'un Rotavapor de marque Stuart type RE300 puis placé dans une étuve Memmet à une température de 50°C pour fignoler l'évaporation. Enfin, les extraits sont conservés à 4°C dans un réfrigérateur avant l'utilisation. III.2. ANALYSE PHYTOCHIMIQUE (SCREENING) Le screening phytochimique est basé sur les réactions (coloration et précipitation) différentielles des principaux groupes de composé chimiques contenus dans la feuille selon la méthode de Houghton et Raman [45]. Le protocole est en annexe 2. Tableau II. Récapitulatif des réactions spécifiques de chaque classe de composé chimique lors du screening phytochimique. Classe de Principe actif Réactifs Spécifiques Réactions (Observations) Alcaloïdes Tanins catéchiques Tanins galliques Flavonoïdes Anthocyanes Leucoanthocyanes Dérivés quinoniques Saponosides Triterpenoïdes Stéroïdes Cardénolides Dérivés cyanogéniques Mucilages Composés réducteurs Coumarines Dérivés anthracéniques Stupéfiants Opium Oses et holosides Dragendorff (iodobismuthate de potassium) Mayer (iodomercurate de potassium) Réactif de stiasny Saturation d'acétate de Na+ quelques gouttes de FeCl3 à 1% Shinoda (réaction à la cyanidine: HCL+Mg) Acide chlorhydrique à 5% + quelques gouttes d'ammoniaque diluée au demi Shinoda (alcool chloridrique) Born-Trager (réaction entre cycle quinoniques en milieu HNO3) Détermination de l'indice de mousse Liebermann-Buchard (anhydride Kedde (acide dinitrobenzoique 2% dans l'éthanol + NaOH (1N) Dinitrobenzène 1% dans éthanol + NaOH 20% Gugnard (papier imbibé d'acide picrique) Etude de la viscosité des infusés et décoctés. Alcool absolu Liqueur de fehling à chaud Ammoniaques à 25% Chloroforme + ammoniaque intense Hydroxyde de potassium à 5% dans l'alcool (réaction de Beam positive) Chlorure ferrique (FeCl3) à 25% Acide sulfurique + alcool saturé au Thymol Précipité rouge Précipité jaune Précipité rose Coloration bleue ou noire Coloration: orangée, rouge et violette Coloration rouge qui vire au bleue violacée ou verdâtre Coloration rouge cerise Coloration rose ou rouge violacée Positive si IM = 1cm Coloration violette à bleue ou verte Coloration rouge pourpre ou rouge au vin Coloration bleue Coloration orange ou marron Précipité floconneux après une dizaine de minutes Précipité rouge-brique Fluorescence intense sous UV à 365 nm Coloration rouge plus Coloration violette Précipité rouge Coloration rouge 24 25 III.3. ETUDE DE LA TOXICITE AIGUE Tableau III. Échelle de toxicité aigüe des produits chimiques [46]. DL50 pour le rat ou la souris mg/kg
Tableau IV. Echelle de toxicité aigüe de Hodge et Sterner [47]. Classe de toxicité DL50 rat, sourismg/kg Dose pour un enfant de 12,50 kg Extrêmement toxique < 1 8 mg le fait d'en gouter Très 1 à 50 500 mg le fait d'avaler une
petite Moyennement 50 à 500 5 g le fait d'avaler une cuillerée à café Faiblement 500 à 5000 60 g le fait d'en consommer
un Pratiquement non 5000 à 15 000 180 g Relativement sans danger >15 000 >180g III.4. PHASE D'EXPERIMENTATION Seul l'extrait aqueux à chaud est utilisé pour la suite des travaux afin de nous conformer aux méthodes de préparation de la pharmacopée béninoise. 26 Evaluation de l'activité anti-oedémateuse Protocole expérimental Test de l'activité anti-oedémateuse L'oedème est provoqué par l'injection, dans l'aponévrose de la plante de la patte gauche des rats, de 0,1 mL de solution de formol à 1%. Par la méthode de l'immersion avec le dispositif de Bhatt [47] modifié, les mesures du volume de la patte gauche sont effectuées à 0, 30, 60, 120, 180, 240, 300 et 360 minutes après l'injection [48]. Trente minutes avant l'induction de l'oedème, les animaux à traiter reçoivent par voie orale 300 mg/kg et 500 mg/kg de poids corporel d'extrait de Petiveria alliacea, Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum sous un volume constant de 7 mL d'eau distillée. L'indométacine, à la dose de 100 mg/kg, est utilisée comme produit de référence. Les rats répartis en 6 lots de 5, ont été pesés puis mis à jeun 12 heures avant l'expérimentation. Le volume de la patte est déterminé par la méthode d'immersion ce qui provoque une augmentation du niveau d'eau. Ce niveau est ramené à sa position initiale dans la grande seringue 3 à l'aide d'autres seringues 1 et 2. Le volume de la patte qui correspondant à la quantité d'eau déplacée est directement lu sur la seringue 1. Les différents traitements ont été administrés par gavage : - Lot 1 : eau distillée à raison de 10 mL/kg (contrôle) ; - les lots 2, 3 et 3 : solution respective d'extrait aqueux de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum à la dose de 300 mg/kg ; - les lots 4, 5 et 6 : solution d'extrait aqueux de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum à la dose de 500 mg/kg ; - le lot 7 : solution d'indométacine à 100 mg/kg. ? Le volume de l'oedème VT à un temps tf donné est : VT = Vtf - Vt0 Vt0 = le volume initial de la patte Vtf= le volume de la patte au temps tf ? Le pourcentage d'augmentation P du volume de la patte est donné par la formule : 27 P = 100 x VT / Vt0 ? L'activité anti-oedémateuse a été évaluée par le calcul du pourcentage d'inhibition PI de l'oedème selon la formule : PI = 100 (Vte - Vtt) / Vte Vte = Volume de l'oedème chez les rats témoins Vtt = Volume de l'oedème chez les rats traités III.5. ANALYSES STATISTIQUES Nous avons fait dans un premier temps, un test ANOVA, pour comparer les valeurs. Dans un second temps, le test "t" de Student-Fischer avec un logiciel SPSS. Les différences sont hautement significatives, si t> 1,96 ; elles sont calculées par rapport aux témoins. Les chiffres qui figurent dans les tableaux représentent les moyennes des valeurs et les erreurs Standards Moyennes (EMS).
RESULTATS 29 I. RESULTATS DE LA PHASE PREPARATOIRE I.1. Etude phytochimique Les résultats des analyses phytochimiques sont consignés dans le tableau V ci-dessous. Il ressort de l'analyse phytochimique des feuilles de Petiveria alliaccea, Moringa oleifera et Occimum gratissimum qu'elles renferment plusieurs composés chimiques tels que : Stérols, triterpènes, tanins hydrolysables, tanins condensés, non hydrolysables (composés polyphénoliques), mais aussi des hétérosides, flavonoïdes et des alcaloïdes. Tableau V. Résultats des analyses phytochimiques
Aucun effet indésirable patent et aucun décès n'ont été enregistrés pendant les 14 jours d'observation clinique régulière des deux lots de dose séquentielle de 300 mg/kg et de ceux de 2.000 mg/kg de poids corporel de l'animal, ceci pour les extraits aqueux de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum. Lors du déroulement de l'expérimentation, l'absence d'effets indésirables à la dose séquentielle de 2000 mg/kg du poids corporel de l'animal a entrainé la fin de l'essai. 31 II. RESULTATS DE LA PHASE EXPERIMENTALE II.1. Evaluation de l'activité anti-oedémateuse Effet de l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum sur l'oedème de la patte de rat induit par le formol 1% L'administration de l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea à la dose de 300 mg/kg prévient de manière significative (p<0,05) l'oedème de la patte de rat induite par le formol 1%. L'augmentation du pourcentage de l'oedème inflammatoire de la patte est de 22,9#177;3,1 ; 30,8#177;7,2 et 46,6#177;12,0 comparée au groupe contrôle traité avec l'eau distillée dont l'augmentation de l'oedème est de 28,1#177;2,0 ; 69,7#177;1,1 et 95,2#177;6,0 respectivement aux temps T1h, T3h et T6h après injection du formol 1%. A la dose de 500 mg/kg per os, l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea montre une meilleure prévention de l'oedème de la patte induite par le formol 1% comparée à la dose de 300 mg/kg. Les pourcentages d'augmentation de l'oedème inflammatoire de la patte sont moins importants, ils sont de : 16,7#177;2,0 ; 20,3#177;1,1 et 17,1#177;0,01 respectivement aux temps T 1h, T 3h et T 6h après injection du formol 1% (Tableau VII). L'administration de l'extrait aqueux des feuilles de Moringa oleifera à la dose de 300 mg/kg prévient de manière significative (p<0,05) l'oedème de la patte de rat induite par le formol 1%. L'augmentation du pourcentage de l'oedème inflammatoire de la patte est de 23,9#177;4,1 ; 31,80#177;7,2 et 47,7#177;13,1 comparée au groupe contrôle. A la dose de 500 mg/kg per os, l'extrait aqueux des feuilles de Moringa oleifera montre une meilleure prévention de l'oedème de la patte induite par le formol 1% comparée à la dose de 300 mg/kg. Les pourcentages d'augmentation de l'oedème inflammatoire de la patte sont moins importants, ils sont de : 17,7#177;2,0 ; 21,2#177;1,1 et 28,25#177;0,2 respectivement aux temps T1h, T3h et T6h après injection du formol 1% (Tableau VII). L'administration de l'extrait aqueux des feuilles de Ocimum gratissimum à la dose de 300 mg/kg prévient de manière significative (p<0,05) l'oedème de la patte de rat induite par le formol 1%. L'augmentation du pourcentage de l'oedème inflammatoire de la patte est de 24,10#177;4,1 ; 32,1#177;3,2 et 48,8#177;13,2 comparée au groupe contrôle. A la dose de 500 mg/kg per os, l'extrait aqueux des feuilles de Ocimum gratissimum montre une meilleure prévention de l'oedème de la patte induite par le formol 1% comparée à la dose de 300 mg/kg. Les pourcentages d'augmentation de l'oedème inflammatoire de la patte sont 32 moins importants, ils sont de : 18,10#177;3,0 ; 21,3#177;2,1 et 28,4#177;0,3 respectivement aux temps T1h, T3h et T6h après injection du formol 1% (Tableau VII). Tableau VII. Effet de l'extrait aqueux des feuilles de : Petiveria alliaccea, Moringa oleifera et Ocimum gratissimum sur l'oedème de la patte de rat induit par le formol 1%. % d'augmentation du volume de la patte induite par le formol 1%
Les données sont exprimées en moyenne #177; erreur standard à la moyenne (e.s.m.). Significativité à *P<0,05 par raort au contrôle. n=5 EAPA = Extrait aqueux de Petiveria alliaccea EAMO = Extrait aqueux de Moringa oleifera EAOG = Extrait aqueux de Ocimum gratissimum
DISCUSSION 34 L'objectif de notre travail était d'établir une base scientifique de l'utilisation de Petiveria alliacea, de Moringa Oleifera et de Ocimum gratissimum en médecine traditionnelle. La présente étude a prouvé que les décoctés des feuilles de ces trois plantes possèdent des propriétés pharmacologiques anti-inflammatoires. Selon l'échelle de toxicité de Hodge et Sterner [45] et de l'OMS [50], nos extraits sont faiblement toxiques et sont classés dans la classe III des substances chimiques. Les résultats du criblage chimique ont montré que les feuilles de : Petiveria alliacea, Ocimum gratissimum et Moringa oleifera renferment de stérols et triterpènes, de tanins hydrolysables et de tanins condensés, non hydrolysables (composés polyphénoliques), mais aussi des hétérosides, flavonoïdes et des alcaloïdes. Ces résultats sont également conformes à ceux obtenus par Akinmoladun et al. [26], Aissi et al. [51], Folkard et al. [52], Kpètèhoto et al. [39]. Les terpènoïdes sont potentiellement doués de propriétés anti-inflammatoires, antimycosiques et parfois analgésiques [53]. Les flavonoïdes, de par leurs activités antiradicalaires et chélatantes, sont doués de propriétés antioxydantes, antihypercholestérolémiantes, anti-aggrégant plaquettaires [52]. Les tanins sont des antimicrobiens, des antifongiques [53]. Ces composés, notamment les flavonoïdes, possèderaient une action inhibitrice sur l'inflammation [54,56] qui passerait par l'inhibition de la formation des principaux médiateurs pro- inflammatoires du métabolisme de l'acide arachidonique via l'inhibition des cyclo- oxygénases et lipooxxygénase [57,58]. La présence d'alcaloïdes, des polyphénols révélés dans les différents extraits de la plante serait à l'origine de leurs utilisations comme anti inflammatoire [40]. Ces résultats permettent de valider l'usage de ces plantes dans le traitement des inflammations. L'oedème induit par l'injection du formol 1% est un modèle animal largement utilisé pour évaluer l'activité anti-inflammatoire des substances. L'injection du formol 1% provoque la libération de plusieurs médiateurs chimiques qui sont responsables du processus inflammatoire. Cette réponse inflammatoire est biphasique. La phase initiale qui dure environ une heure est due à la libération de l'histamine et de la sérotonine. La bradykinine est libérée au cours de la seconde phase et la biosynthèse des prostaglandines intervient au-delà de la troisième heure [54]. L'administration per os des extraits aqueux des feuilles s'est révélée efficace, de façon dépendante à la dose (300 et 500 mg/kg), dans la prévention de l'oedème inflammatoire au formol 1%. Toutefois, cet effet anti-oedémateuse est faible sur la phase initiale de l'oedème mais important dans la phase tardive (6 h). 35 Les décoctés des feuilles ont inhibé l'oedème de manière dose-dépendante et à toutes les phases. Ainsi, les décoctés des feuilles pourraient avoir une action antagoniste à l'histamine, à la bradykinine, à la sérotonine et à la biosynthèse des prostaglandines. La forte inhibition de l'oedème a été observée à la troisième heure pour les différents extraits aqueux à la dose de 500 mg/kg. Cela suggère que l'action inhibitrice du décocté des feuilles s'exercerait davantage sur les cyclo-oxygénases qui sont responsables de la synthèse des Prostaglandines. Nos résultats et la nature biphasée de l'oedème de la patte induit par le formol 1% observés, permettent de proposer que l'activité significative dans la suppression de la deuxième phase de l'inflammation puisse être due aux médiateurs impliqués dans la phase tardive de l'oedème de la patte de rat. Ceci suggère une probable implication des voies de la cyclo-oxygénase et de la lipooxygénase dans l'activité de l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea, Ocimum gratissimum et Moringa oleifera.
CONCLUSION & PERSPECTIVES 37 Cette présente étude a montré que l'extrait aqueux des feuilles de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum sont faiblement toxiques et ont un effet anti-inflammatoire sur le modèle de l'oedème inflammatoire induit par le formol 1% chez le rat. Cette activité serait plus importante à dose élevée et pourrait être lié à l'inhibition des cyclo-oxygénases et lipoxygénases dans la phase tardive de l'oedème inflammatoire au formol 1%. Ces résultats justifient l'utilisation de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum en médecine traditionnelle africaine dans la prise en charge du processus inflammatoire. Les résultats obtenus lors de cette étude sont intéressants, mais des études complémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de ces effets. Ces études doivent être aussi orientées vers la détermination des principes actifs dans les extraits de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum et l'évaluation de leurs effets sur les signalisations impliquées dans le processus inflammatoire, ainsi que les enzymes impliquées dans la production des espèces oxygénées réactives. L'extrait aqueux de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum a des propriétés anti-inflammatoires. Les effets, dose et temps dépendant de ces extraits d'origine naturelle permettent de conclure qu'elle a également des propriétés anti-sérotoniques et antihistaminiques. Les propriétés anti-inflammatoires de Petiveria alliacea, de Moringa oleifera et de Ocimum gratissimum seraient liées à la présence de flavonoïdes et de saponines présents dans ces extraits qui ne sont pas toxiques. Les flavonoïdes sont en effet des antioxydants tandis que les saponines sont des inhibiteurs des prostaglandines. Selon la littérature, plus la DL50 est élevée, moins les extraits de la plante sont toxiques. Selon l'échelle de Hodge & Sterner [4 3], nos extraits sont faiblement toxiques et sont de la classe IV des substances chimiques. Toutefois, d'autres investigations devraient être entreprises pour garantir leur qualité, valider leur innocuité et leur efficacité. Une purification de l'extrait aqueux de la feuille la plus efficace pourrait permettre d'isoler le ou les principes actifs responsable (s) de ces effets. Et plus tard, la détermination des mécanismes moléculaires impliqués devrait suivre. En conséquence, des expériences ultérieures utilisant des fractions riches en saponosides et en flavonoïdes sont envisagées pour confirmer cette hypothèse et comprendre le mécanisme d'action des principes actifs de ces plantes.
REFERENCES
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40 personnes âgées, La Presse Médicale, 24 juin 2000, 29, n° 22
41 oleifera Lam in high-fat diet fed wistar rats. Journal of Ethnopharmacology. January 2000, Volume 69, Issue 1, Pages 21-25
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TABLE DES MATIERES 47 1 1E'TJI?4 IEE 4 I. CLARIFICATION DES CONCEPTS 5 1.1. Plante médicinale..............................................................5 1.2. La Phytothérapie...............................................................5 1.3. La décoction...................................................................5 1.4. L'infusion.......................................................................5 1.5. La macération..................................................................6 1.6. La trituration.......................................................................6 1.7. L'inflammation 6
INFLAMMATOIRE ............................................................. 11.1. FE TI VERIA ALLIA CEA............................................................10 11.2. MORINGA OLEIFERA.............................................................13 11.3. OCIMUM GRATISSIMUM................................................15 48 HYPOTHESES ET OBJECTIFS . 18 MATERIEL ET METHODES 20 I. CADRE DE L'ETUDE 21 II. MATERIEL . 23
III. METHODOLOGIE 24 III.1. Phase préparatoire 24 III.1.1. Récolte, séchage, broyage 24 III.1.2. Obtention des extraits 24 III.2. Analyse phytochimique (Screening) 24 III.3. Etude de la toxicité aigüe . 26 III.4. Phase d'expérimentation 26 III.5. Traitement statistique 28 RESULTATS . 29 I. RESULTATS DE LA PHASE PREPARATOIRE 30
II. RESULTATS DE LA PHASE EXPERIMENTALE 32 49 II.1. Evaluation de l'activité anti-inflammatoire . 32 DISCUSSION 34 CONCLUSION ET PERSPECTIVES . 37 REFERENCES 39 TABLE DES MATIERES . 45 ANNEXES a
ANNEXES b Annexe 1 : Equipements, consommables. Appareils utilisés au cours de nos expérimentations : Balance automatique de type METTLER 3000, Rotavapor R2000, Réfrigérateur (WESPOINT), Agitateur (VOLTEX), Agitateur va et vient, Plaque chauffante, Etuve (MEMMERT), Agitateur magnétique (KILA-WERKE), Extracteur de type Clavenger, Distillateur, Ultrason, Pléthysmomètre (APELEX 05-7150, Allinde, Bagneux, France). Instruments utilisés : Eprouvette, Tubes à essai stériles, Flacons en verre, Etiquettes, Marqueurs, Coton, Pipettes, Erlenmeyer, Bécher. Annexes 2 : Equipement utilisé au laboratoire et protocole expérimentale du screening Appareil et instruments : Erlenmeyer, Ballon à fond rond, Tubes à essais, Pipettes graduées, Plaque chauffante, Balance électronique, Eau de mer provenant de l'océan atlantique, Béchers pour recueillir le filtrat, Bocaux pour conserver les extraits, Chronomètre, Broyeur à couteau pour pulvériser les feuilles Réactifs : Acide chlorhydrique, Réactifs de Meyer, Ammoniaque 5%, Ether chloroformique, Chlorure ferrique à 1%, Réactif de STIASNY, Acétate de sodium, Poudre de magnésium, Alcool chlorhydrique, Chloroforme, Alcool éthylique, Acétate de plomb, Solution aqueuse de phosphate sodique, Sulfate de sodium anhydre, Acide acétique, Acide sulfurique, acide 2-[2-(2,6-dichlorophenyl) amnophényl] éthanoïque (diclofenac), formol 1%, d'acide acétylsalicylique. Protocole expérimental ayant trait au screening phytochimique 1) Recherche des alcaloïdes Elle s'est faite grâce à deux tests : a. Test général en milieu acide On mélange 5g de la poudre à 25ml d'acide chlorhydrique dilué à 5%. Le mélange est macéré pendant 24heures. On recueille 1mL du filtrat auquel on ajoute 5 gouttes de réactif de MAYER. En cas présence d'alcaloïdes, on observe un précipité jaune ou louche dans le tube. C b. Extraction des alcaloïdes On met 5g de poudre dans 5mL d'ammoniaque dilué au demi. A ce mélange, on ajoute 25ml d'éther chloroformique et on laisse macérer pendant 24heures dans un flacon bouché. Le filtrat est séché sur du sulfate sodique anhydre et ensuite épuisé avec 5mL d'acide chlorodrique à 5% deux fois de suite. Au filtrat épuisé, on ajoute 5 gouttes de réactif de MAYER. En cas de présence d'alcaloïde, le filtrat précipite ou devient dans le tube. 2) Recherche des composés polyphénoliques Dans un erlenmeyer, on met 5g de poudre auxquels on ajoute 100mL d'eau bouillante. Le mélange infusé est laissé 15 minutes sous agitation continue, puis filtré. Ce filtrat réparti en 2 portions servira aux recherches ci-après :
Nous additionnons quelques gouttes d'acide chlorhydrique à 5% à 1mL de la deuxième portion. Ce mélange est ensuite alcalinisé par ajout de quelques gouttes d'ammoniaque dilué d au demi. Une coloration rouge qui s'accentue et vire au bleu-violacé ou verdâtre indique la présence d'anthocyane. d) Recherche de leuco-anthocyane A 5mL de la deuxième portion, nous ajoutons 5mL du réactif de SHINODA. Le mélange est ensuite chauffé pendant 15 minutes au bain-marie à 90°C. L'observation d'une coloration rouge cerise ou violacée indique la présence de leuco-anthocyane.
Pour cette recherche, nous ajoutons à 1g de poudre 10mL d'alcool éthylique à 70°C et nous agitons pendant 30 minutes. A ce mélange, nous ajoutons 10mL d'eau distillée puis 2mL d'acétate de plomb à 10% à volume égal V/V. Après 15 minutes de repos, nous ajoutons au filtrat 2mLde solution aqueuse de phosphate disodiquephosphate disodique à 10%. Après 15000 minutes de repos, le filtrat est recueilli dans une ampoule à décanter et extrait à trois e reprises avec 5mL de chloroforme (CHCL3). Les solutions chroniques sont séchées sur du sulfate de sodium anhydre puis divisées en trois portions et évaporées à siccité (bain de sable).
Réaction de RAYMOND pour les cardénolides : elle consiste à ajouter à troisième portion successivement 2 gouttes d'une solution alcoolique à 1% de métadinitronenzène et 2 gouttes de NaOH à 20%. Une coloration bleue indique une réaction positive.
A 20mL d'éther on ajoute 1g de poudre puis boucher immédiatement dans un petit erlenmeyer et laisser en macération pendant 24 heures. Le filtrat a été ajusté à 20mL avec l'éther. 5mL de filtrat ont été évaporés dans une capsule à l'air libre. Au résidu obtenu, nous avons ajouté 2mL d'eau chaude et partagé la solution dans deux tubes à essai. Dans l'un des f tubes, nous avons ajouté 0,5mL d'ammoniaque à 25%. Le second tube représente le témoin. Nous observons la fluorescence des deux tubes à essai sous UV à 365nm. Une fluorescence intense dans le test indique la présence de coumarines. Ou 10g de poudres sont mis dans un erlen de 500mL. On y verse 180mL d'éthanol et 20mL d'eau distillée. On met l'erlen sous agitation magnétique pendant une nuit. Après filtration, la solution est concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à siccité. L'extrait hydro-éthanolique concentré est traité, dans une capsule de porcelaine, avec une goutte de solution saturée de chlorhydrate d'hydroxylamine 10% et une goutte de solution alcoolisée de KOH (7,5% de KOH dans l'éthanol). Ce mélange est chauffé pendant 2 minutes. Après refroidissement, on ajoute une petite quantité d'HCI 0,5N et de FeCL3 1%. Un test positif consiste en une coloration violette.
A 1g de poudre, on ajoute 10mL de chloroforme et on chauffe prudemment pendant 3 minutes au bain-marie. Après filtration à chaud, le mélange est complèté à 10mL avec le chloroforme. 1mL de l'extrait chloroformique est additionné de 1mL d'ammoniaque dilué à 1/2 puis agité. L'apparition d'une coloration rouge plus ou moins intense indique la présence d'anthracéniques libres. g b) Anthracéniques combinés O-hétérosides A une partie du résidu épuisé par le chloroforme, on ajoute 10mL d'eau distillée et 1mL d'acide chlorhydrique concentré. Le tube à essai maintenu au bain marie bouillant pendant 15 minutes est ensuite refroidi sous un courant d'eau. L'hydrolysat est obtenu après filtration et ajustement à 10mL. On prélève 5mL de l'hydrolysat qu'on agite avec 5mL de chloroforme. La phase organique soutirée est introduite dans un tube à essai et additionnée de 1mL d'ammoniaque dilué au Y2 puis agité (on garde la phase aqueuse). La présence d'anthracénique est révélée par la coloration rouge plus ou moins intense. Si la réaction est négative ou faiblement positive, on recherche les O-hétérosides à génines réduites. Pour ce faire on prélève 5mL d'hydrolysat qu'on additionne de 3 à 4 gouttes de FeCl3 (chlorure ferrique) à 10%. Le mélange chauffé au bain-marie pendant 5 minutes est ensuite refroidi sous courant d'eau puis agité avec 5mL de chloroforme. A la phase chloroformique soutirée et introduite dans un tube à essai, on ajoute 1mL d'ammoniaque au 1/2 puis on agite. Une coloration rouge plus ou moins intense signe la présence des O-hétérosides à génines réduites. C-hétérosidesA la phase aqueuse conservée plus haut, on ajoute 1mL de FeCl3 à 10%. Le mélange est porté à ébullition au bain-marie bouillant pendant 30 minutes puis refroidi. Après agitation avec 5 minutes de chloroforme, la phase chloroformique est soutirée et recueillie dans un tube à essai. On y ajoute 1mL d'ammoniaque dilué à Y2 et on agite. Une coloration rouge plus ou moins intense signe la présence de génines de C-hétérosides. |
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