Chapitre II : Matériel et méthodes
Cétyl Trimétyl Ammonium Bromide (CTAB). Pour ce
faire, 20 à 30 mg de feuilles sèches a été
pesé à l'aide d'une balance (figure 10 B) et mis dans un tube
eppendorf de 2 ml auquel ont été ajoutées 3 billes
stériles. Le tube a été ensuite placé sur le
portoir du broyeur à bille (figure10, A) pour le broyage pendant 30 s.
Cela nous a permis d'obtenir une poudre bien fine. Ensuite, nous avons
retiré les billes et y ajouté 1,5 ml du tampon d'extraction CTAB
(2% CetylTrimetyl Ammonium Bromide (CTAB), 1,4 M NaCl, 0,2 % beta mercapto
éthanol, 20 mM Etylene Diamine Tetra acetic Acid (EDTA) et 100 mM
Tris-HCl ou Trizma base, pH8) préchauffé à 60°C au
bain-marie. Après vortexage, nous avons incubé
l'échantillon à 60°C au bain-marie sous agitation douce
(toutes les 10 min) pendant 60 min. Après une centrifugation à
12000 rpm pendant 15 min, 1 ml du surnageant a été
prélevé et transféré dans un nouveau tube eppendorf
de 2 ml. Un égal volume de mélange de chloroforme et d'alcool
isoamylique (CIA ; 24:1) a été ajouté au surnageant suivi
d'une agitation douce pendant 5 min. Une deuxième centrifugation
à 12000 rpm pendant 15 min a été réalisée en
vue de concentrer les phases. Cela pour se débarrasser des débris
en suspension dans la phase aqueuse. Après cette opération, 800
tl du surnageant ont été transféré dans un tube
eppendorf de 1.5 ml auquel nous avons ajouté 0.8 de volume d'isopropanol
(640 tl) pour permettre la précipitation des acides nucléiques.
L'échantillon a été ensuite incubé à
-20°C pendant 30 min et centrifugé à 12000 rpm pendant 15
min. Le surnageant a été jeté et 500 tl d'éthanol
70% ont été ajouté au culot pour le lavage. Après
vortexage, l'échantillon a été laissé à
température ambiante pendant au moins 20 min. L'échantillon a
été centrifugé une nouvelle fois à 12000 rpm
pendant 15 min et l'éthanol a été vidé
soigneusement. Nous avons ensuite procédé à un
séchage à température ambiante pour éliminer
l'éthanol. Les ADNs obtenus ont été suspendus dans 100
ìl d'eau distillée stérile puis gardés à
4°C pour dissoudre les ADNs. Cet ADN total a été dosé
au Nanodrop pour vérifier sa qualité (bonne qualité avec
un ratio DO260/DO280 ~1,8-2,0) et sa concentration (en ng/tl) puis
conservés à -20°C pour les analyses.
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