Chapitre II : Matériels et méthodes
2.1. Matériels
a) Matériel biologique
Les urines humaines ont été choisies comme
matériel biologique dans l'optique de déceler une exposition
interne de deux métaux (Al et Hg).
· :* Choix des matériels
biologiques
La voie d'élimination de loin la plus importante de
certains métaux comme l'aluminium et le mercure présents dans le
sang est assuré par l'excrétion urinaire (PILETTE, 2008).
Cependant, l'aluminium et le mercure urinaires sont moins
influencés que leurs formes sériques par le fait que le
prélèvement se soit déroulé à jeun ou
après le repas (PILETTE, 2008). Il a aussi été
suggéré que l'excrétion urinaire soit
considérée comme un meilleur indicateur d'exposition car elle
reflète principalement l'exposition récente (RÖLLIN et al,
1996) ou la charge corporelle.
b) Matériel de prélèvement et de
laboratoire
Les prélèvements des échantillons dans
notre population cible a nécessité l'utilisation des
matériels ci-après :
· Paires de gant
· Flacons en polyéthylène stériles
· Ouate.
Les analyses au laboratoire pour le dosage de l'aluminium et du
mercure ont exigé un appareillage spécial :
· ICP-MS Agilent 7500 pour l'Al
· CETAC M-6000 A Automated Mercury Analyser (AAS) pour le
Hg. Le choix de ces deux méthodes est dicté par les avantages
qu'elles offrent dans la détermination des micropolluants (CHAPPUIS,
1995).
2.2. Méthodes
a) Prélèvement des échantillons et
Conservation
· 110 personnes âgées de 6 ans et plus ont
été sélectionné aléatoirement pour
recueillir environ 10 cc d'urines directement dans des flacons stériles
en polyéthylène de 125 ml sans ajout de préservatif ;
· Ensuite tous les échantillons
récoltés ont été acheminés endéans 6
heures au laboratoire en vue d'être conservées dans un
congélateur à -20°C. Ceci en attendant les analyses
proprement dites dans un laboratoire de Toxicologie Industrielle et
Environnementale de l'Université Catholique de Louvain en Belgique ;
b) Questionnaire
Le profil des styles de vie des participants a
été établi à l'aide d'un questionnaire. Ces
informations nous ont paru essentielles pour l'interprétation des
résultats. Les sujets proposés dans le questionnaire rempli par
les participants sont : âge, sexe, habitude alcoolique, tabagique et
alimentaire, origine linguistique (voir le questionnaire en Annexe II). Chaque
personne participant à l'étude a dûment rempli le
formulaire d'enquête avant de fournir les urines.
c) Méthode de laboratoire
1°) Dosage d'Aluminium urinaire
Le couplage torche à plasma-Spectromètre de
masse (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer ou ICP-MS) est une
technique permettant de doser en quelques minutes plus de 50
éléments du tableau périodique sur les solutions à
des teneurs très inférieures à 14 ig/l ou (ppb).
Cette technique est la plus utilisée en raison de sa
très bonne limite de détection et des faibles
interférences ; elle est en outre particulièrement adaptée
à l'analyse toxicologique (KAMOUN, 1997).
Principe :
L'échantillon est amené jusqu'à la torche
à plasma par une pompe péristaltique. Au contact de l'argon,
l'échantillon est alors atomisé puis ionisé dans sa
totalité sous forme de cations monovalents. Une interface
composée de deux cônes de nickel et d'une série de
lentilles permet de stopper les photons et focaliser les ions pour les amener
au quadripôle pour la séparation en masse. Cette séparation
est effectuée pour chaque ion en fonction du rapport masse
atomique/charge (m/e-). Le faisceau ionique est amené sur un
détecteur de type multiplicateur d'électrons. L'ensemble du
système est dirigé par informatique (KAMOUN, 1997).
Mode opératoire :
L'appareil ICP-MS Agilent 7500 Ce Octopole Reaction System
(ORS) a été utilisé pour doser l'aluminium urinaire.
Brièvement, 500 pl d'urine ont été ajoutés à
4500 pl de diluant [HCl 0,5% (v/v) ; HNO3 1% (v/v) et 50 pl de solution de
chaque standard interne à ppm (Se, Ge, Rh, In, Ir)]. La solution de
calibrage a été préparée en additionnant 50 pl de
la solution avec 450 pl de l'acide et 4500 pl de diluant pour obtenir des
solutions multiéléments à 0 ; 10 ; 50 ; 250 ; 500 ; 5000
ppb. La limite de détection de 1,57 ug/l.
2°) Dosage du mercure urinaire
La spectrométrie d'absorption atomique permet de doser
dans pratiquement toute sorte d'échantillon, un ou plusieurs
éléments prédéfinis choisis dans une liste en
contenant environ 70.
Cette technique présente plusieurs avantages tels qu'un
emploi plus général et une bonne spécificité. Elle
est aussi utilisée en toxicologique pour le dosage de divers
métaux y compris le mercure (KAMOUN, 1997).
Principe :
Pour comprendre le principe d'absorption atomique, on peut se
reporter à une expérience due à Kirkho~~, vieille de plus
d'un siècle, dans laquelle il a montré que les gaz incandescents
absorbent aux mêmes longueurs d'onde que celles qu'ils peuvent
émettre. Le mercure contenu dans l'échantillon est réduit
sous forme métallique à l'aide de solution SnCl2-CdCl2 et les
vapeurs de Hg métallique produites sont orientées vers le
faisceau d'une lampe en Hg. Le dosage dépend de l'absorption par
l'échantillon des radiations du faisceau issues de lampe en Hg.
L'appareil affiche l'absorbance en faisant le rapport des intensités
transmises en absence puis en présence de l'échantillon (KAMOUN,
1997 ; ROUESSAC et al, 2004).
La concentration du mercure est déterminée par la
relation :
A = k.c
où
A : absorbance
c : concentration de l'élément
k : coefficient propre à chaque élément pour
la longueur d'une d'onde choisie.
Mode opératoire :
L'appareil CETAC M-6000 A automated Mercury Analyser a
été utilisé pour le dosage du mercure. Brièvement,
2 ml de la solution fraîche d'acide trichloroacétique (TCA)
contenant L-cystéine ont été ajoutés à 1 ml
d'urine. Le tout a été mis en contact avec la solution de
SnCl2-CdCl2 avec un débit de 0,8 ml/min dans un puits pour produire des
vapeurs froides. La solution de calibration a été
préparée à partir de la solution 2 mg/l de Hg
diluée à 100 ml avec le réactif TCA de rinçage pour
obtenir des solutions à 0 ; 5 ; 10 ; 20 ppb. Le seuil de
détection est de 0,8 ug/l.
d) Méthode statistique
Les logiciels NCSS 2004 et Prism Padgraph version 3.0 ont
été utilisés pour les traitements statistiques des
résultats. Les distributions ont été examinées et
les percentiles 50è, 75è,
90è, 95è déterminés. La
mesure de la tendance centrale a été calculée par la
moyenne géométrique. Cette dernière a été
calculée seulement lorsque de résultats détectables est
supérieur à 60%. Pour ce calcul, les résultats individuels
sous la limite de détection ont été remplacés par
une valeur égale à la moitié de cette limite. Le test de
Student et l'analyse de la variance ont été appliqués pour
tester les différences entre les groupes (GRAIS, 2000 ; ANCELLE,
2002).
e) Description de la population étudiée
v La population étudiée est
constitué de 110 volontaires de 6 ans et plus en tenant compte d'un
équilibre entre les deux sexes.
Pour un nombre total de 41.058 habitants (Bureau du Quartier,
2007), chaque sujet avait une chance de 0,27% de constituer
l'échantillon.
v La période de récolte des
échantillons biologiques s'est étendue du 22 avril au 23 mai
2008. Etant donné que le Bureau du quartier Matadi n'avait aucune liste
recensant ses habitants, il nous a été impossible de
réaliser une présélection des sujets comme l'exige
l'échantillonnage aléatoire simple (EAS). La population
d'étude a été sensibilisée au préalable puis
le recueil des urines s'est déroulé une seule fois par les
volontaires eux-mêmes pour toute l'étude.
I) Cartographie du milieu d'étude
Sur base des informations recueillies au Bureau du quartier
concernant ses limites. Nous sommes nous même descendus sur terrain pour
vérifier les frontières réelles de la zone
d'étude.
Ensuite grâce aux images satellitaires Ikonos (4 m de
résolution spatiale en composition colorée et 1 m en
panchromatique), nous avons pu réaliser les deux cartes ci-dessous ayant
des limites plus ou moins précises, en utilisant le logiciel ArcGIS
d'ESRI.
Ainsi, les coordonnées géographiques du quartier
Matadi sont les suivantes:
· Aunord: 15°17'03»Eet-4°22'19»N
· Ausud: 15°17'19»Eet-4°22'51»N
· A l'Est : 15°17'29»E et -4°22'27»N
· A l'Ouest: 15°16'58»E et
-4°22'44»N
En définitive, le quartier Matadi occupe une superficie
d'environ 634506 m2
Fig.3 : Carte représentant les limites du quartier Matadi
dans la commune Bumbu
Fig.4 : Spatiocarte représentant l'image
satéllitaire de la zone d'étude
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