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BioTechWorld 2007Colloque International sur les
Biotechnologies"Quelles biotechnologies pour les pays du sud ?"24-25
Novembre 2007, Oran, Algérie
CARACTÉRISATION BIOCHIMIQUE D'ISOENZYMES
D'ESTÉRASES AU COURS DU PROCESSUS GERMINATIF DES GRAINES D'ESPECES
ANNUELLES DU GENRE MÉDICAGO POUR LA TOLÉRANCE AU STRESS
SALIN.
AMOURI A**, FYAD-LAMECHE F.Z** et ABDELGUERFI
A*. Laboratoire de Génétique et d'Amélioration des
plantes. Département de Biologie. Faculté des Sciences.
Université d'Oran-Es-Sénia. Oran**. INA El Harach. Alger*.
amouriaa@yahoo.fr
Résumé.
L'activité des estérases qui est liée au stade
physiologique et métabolique de la cellule, peut être
affectée par les facteurs environnementaux tels que le stress
salin. Pour cela, une étude a porté sur
l'électrophorèse native et la révélation
spécifique des isoenzymes d'estérases, chez deux écotypes
appartenant à deux espèces différentes du genre
Medicago, l'une tolérante (Tru 42) appartenant
à l'espèce M.truncatula, et l'autre sensible (Pol
248) appartenant à l'espèce M.polymorpha.
L'étude de la synthèse des isoenzymes d'estérases durant
le processus germinatif des graines en conditions normales et durant le stress
salin à différentes concentrations de salinité (0.4 %, 0.6
% et 0.8 %), a mis en évidence des variations quantitatives et
qualitatives pour la synthèse de ces isoenzymes , entre
ces deux écotypes, avec une cinétique d'apparition
différente des nouvelles bandes, ce qui permettra la possiblité
de localiser les QTLs en question.
Mots clés : Medicago -
stress salin - germination - isoenzymes - estérases.
Abstract. The activity of the
esterases wich is related to the physiological and metabolic stage of the cell,
can be affected by the environmentals factors such as the salt stress. For
that, a study was carried on the native electrophoresis of the isoenzymes of
the esterases, on two ecotypes from two different species of Medicago,
the tolerant (Tru 42) from M.truncatula and the sensitive one
(Pol 248) to M.polymorpha. The study of the synthesis of the
esterases isozymes during the germinatif process of seeds under normal and
stress condition with different salt concentration (0.4?, 0.6 ? and 0.8 ?),
showed a relationship between quantitative and qualitative variation of
isoenymes patterns of the two ecotypes and the stress variation application,
with a different apparition of new bands. This study will allow the possibility
to locate the QTLs in question.
Keys words: Medicago - salt stress
- germination - isoenzymes - esterases.
Introduction
L'activité des estérases qui est liée au
stade physiologique et métabolique de la cellule, peut être
affectée par les facteurs environnementaux tels que la
température de culture, le stress hydrique, le stress salin et les
agents polluants. Les estérases (E.C.3.1.1.2)
EST, appartiennent au groupe des hydrolases. Au cours de la
germination des graines (oléagineuses, amylacées et
protéagineuses), il y a mobilisation des
réserves par différentes hydrolases, lipases et
/ou protéases dans une chronologie qui reste à déterminer
(Khemiri.H et al., 2004). Le présent travail,
a pour but de rechercher un éventuel marqueur isoenzymatique pour la
tolérance au stress salin chez deux écotypes appartenant à
deux espèces différentes du genre Medicago, l'une
tolérante (Tru 42), et l'autre sensible (Pol 248). Le
choix de ces deux écotypes n'est pas fortuit car ces résultats
ont été obtenus après une étude biométrique
(germination des graines et croissance de jeunes plantules) parmi six
écotypes appartenant à des espèces différentes de
Medicago (M.truncatula, M.polymorpha et
M.ciliairis), sous différentes concentrations de
salinité (0.4 %, 0.6 % et 0.8 % NaCl) (Amouri A et Fyad-Lameche
F.Z., 2005).
Matériels et
méthodes:
Matériel végétal :
Un lot de graines de deux écotypes appartenant à
des espèces annuelles du genre Medicago (Tru 42 et Pol
248) fournis par l'INA El Harach (Alger), sont désinfectées,
scarifiées puis ensemencées dans quatre boites de petri,
tapissées de papier filtre. Les graines de la boîte témoin
pour chaque écotype sont imbibées d'eau distillée et les
graines des trois autres boites traitées sont imbibées d'une
solution NaCl à différentes concentrations (0.4, 0.6 et 0.8 %).
la germination des graines des boites témoins et traitées se
déroule à l'obscurité et à 27°C #177; 1,
après neuf jours d'imbibition.
Préparation des extraits isoenzymatiques
d'estérases
En conditions normales, l'extraction est faite d'une
façon journalière pendant les neuf jours d'imbibition. Pour les
graines traitées, l'extraction est faite directement après neuf
jours sous différentes concentrations en NaCl (0.4, 0.6 et 0.8
%). L'extraction est menée à froid dans un mortier
en présence de
sable et de tampon Tris-Kcl, pH=7, les extraits sont soumis ensuite à
une centrifugation à froid (4°C) pendant 20 mn, à une
vitesse de 13000 tours/ mn. La conservation des extraits a lieu dans un
cryoconservateur contenant de l'azote liquide.
Electrophorèse native sur gel de
polyacrylamide :
La migration s'effectue sur un gel continu de polyacrylamide
à 8%, dans du tampon Tris Borate EDTA (TBE) pH= 8.3. Le tampon cuve est
constitué de tampon gel dilué 10 fois. La migration se
déroule à 5°C pendant 6 h sous une intensité
constante de 30 mA et une tension de 150 V. La révélation
s'effectue dans une solution contenant du Na2HPO4, 0.1M à pH=6.2,
après l'ajout d'un substrat á naphtyl butyrate 1%
mélangé avec de l'acétone et du Fast Blue RR salt.
Après révélation les gels sont séchés et
conservés.
Résultats
Analyse des profils
électrophorètiques d'isoenzymes d'estérases :
Les figures 1-a et 1-b,
représentent les zymogrammes du système
Estérase chez l'écotype tolérant
(Tru 42) sous différentes
concentrations en NaCl. Les différents dépôts de j1
à j9 correspondent à des extraits de jeunes plantules
témoins après un jour d'imbibition jusqu'au neuvième jour
après imbibition. Les dépôts T1, T2 et T3 correspondent
à des extraits de plantules traitées durant neuf jours sous
différentes concentrations en NaCl (0.4, 0.6 et 0.8 %) respectivement.
Les figures 2-a et 2-b,
représentent aussi les zymogrammes du même système
enzymatique chez l'écotype jugé sensible (Pol
248) sous différentes concentrations
en NaCl citées ci dessus.
Les bandes sont identifiées par leur Rf
respectif, ainsi que leur intensité. Chaque écotype
possède son propre profil et des bandes qui lui sont
spécifiques
Chez l'écotype tolérant (Tru
42) :
Afin de faciliter l'interprétation de ces
différents profils eléctrophorètiques, nous avons
notés les bandes comme suit :
Bande 1 : rf (0.35-0.4), Bande 2
: rf (0.47-0.5), Bande 3 : rf (0.60), Bande
4: rf (0.65-0.67), Bande 5: rf (0.85-0.90).
Chez l'écotype sensible (Pol 248) :
Nous avons aussi notés les bandes comme suit :
Bande 1 : rf (0.15), Bande 2 : rf
(0.22), Bande 3 : rf (0.27-0.3), Bande
4: rf (0.4), Bande 5: rf (0.5), Bande
6: rf (0.7), Bande 7: rf (0.8),
Bande8:rf (0.85).
Discussion
Après analyse des résultats, des variations
qualitatives et quantitatives apparaissent dans la synthèse des
isoenzymes d'estérases chez ces deux écotypes. D'après les
figures (1-a et 1-b) et (2-a et 2-b), les
zymogrammes du système Estérase chez
l'écotype tolérant (Tru 42) et
l'écotype sensible (Pol 248), montrent une
cinétique de synthèse variable pendant les neuf jours de
développement. Effectivement, on remarque l'apparition de certaines
bandes et leur disparition dans certaines phases de développement, avec
des variations de leur intensité, donc on s'attend à des
variations quantitatives et qualitatives dans la synthèse des
estérases. Nous supposons que chaque bande représente un
isoenzyme, afin de faciliter l'interprétation de la cinétique de
l'apparition de ces isoenzymes. Chez l'écotype (Tru
42), on remarque une synthèse d'isoenzymes après 24
h d'imbibition, avec apparition de trois bandes. Pendant les deux jours qui
suivent (J2 et J3), on note deux bandes avec une disparition
de la bande 4 représentant l'isoenzyme
synthétisé durant le premier jour, cette disparition de cette
dernière et la stabilité de la synthèse d'isoenzymes avec
seulement un changement qualitative, représente une phase de repos, la
même chose est observé chez l'écotype (Pol
248), avec apparition d'une seul bande au premier jour
(J1) et sa disparition au deuxième jour
(J2) et la stabilité de synthèse de deux
isoenzymes, l'une appartenant a celle du premier jour (bande
1 ) et l'autre nouvellement synthétisée (
bande 7 ). Le quatrième (J4) et
le cinquième (J5) jour chez les deux écotypes
(Tu42 et Pol 248) respectivement,
représentent les phases de début de croissance intense,
d'où accroissement des niveaux enzymatiques des enzymes du
métabolisme (Turck et al., 2002), cette
différence s'observe d'une façon quantitative
(bandes plus intenses) et qualitative
(apparition de nouvelles bandes). Pour
l'écotype (Tru 42), cette croissance intense
dure deux jours (J5 et J6), et se stabilise jusqu'au
neuvième jour (J9), par contre chez l'écotype (Pol
248), la croissance intense dure trois jours (J5, J6 et
J7) ensuite elle se stabilise pendant le huitième
(J8) et le neuvième jour (J9).
Pour le traitement T1 :
Chez les deux écotypes tolérant (Tru
42) et sensible (Pol 248), on
note l'apparition de deux bandes avec une seule qui est intense, donc à
cette concentration, on constate surtout une variation qualitative
et quantitative pour (Pol
248) par rapport à (J8 et J9), et
seulement qualitative pour (Tru
42) par rapport à (J7, J8 et
J9). Chez l'écotype Tru 42, il y a un ralentissement
métabolique de 4 jours, aussi bien chez Pol 248, sauf que cette
dernière présente des modifications quantitatives ce qui prouve
sa sensibilité à ce niveau.
Pour le traitement T2 :
Chez l'écotype (Tru
42), il y a un ralentissement métabolique de 5 jours avec
des modifications qualitatives, et que (j 5) rappelons- le est
la phase de croissance accélérée, d'où la
nécessité de synthèse d'un nombre élevé
d'isoenzymes. On peut on déduire que l'isoenzyme nouvellement
synthétisé (bandes 3) est probablement
une isoenzyme de stress qui appartient à une famille
d'enzymes détoxifiantes. Chez l'écotype sensible
(Pol 248), un ralentissement
métabolique de 4 jours a été enregistré avec plus
de variations quantitatives par rapport à Tru42 et des
modifications qualitatives par l'apparition de la bande
4 qui représente un nouvel isoenzyme
synthétisé.
Pour le traitement T3 :
Chez (Tru 42), il y a un
ralentissement métabolique de 9 jours, alors que chez la
variété (Pol 248), il y a un
ralentissement de 4 jours, mais on remarque une disparition d'un isoenzyme
(bande 4) par rapport à T2 et une diminution
quantitative de la synthèse d'isoenzymes , ce qui explique que cet
isoenzyme est responsable du maintien du pouvoir germinatif à T2 et que
sa suppression à T3 inhibe cette germination, car d'après
l'étude biométrique, l'indice de tolérance de la
germination pour cette dernière, est nul, alors que
pour Tru42, l'écotype le plus
tolérant, il est de 0.13
(Amouri A et Fyad-Lameche F.Z., 2005). Durant le
processus germinatif, en condition normales, les profils des zymogrammes du
système (EST) chez les deux écotypes Tru
42 et Pol 248 , montre deux zones d'activités distinctes
A et B, l'une a migration lente et l'autre à migration
rapide, représentant probablement deux locus (EST 1) et
(EST 2) contrôlant l'expression de ces isoenzymes, qui
sont très variables en fonction des espèces et des population, et
beaucoup plus en fonction des stades de développement
(Fyad-Lameche F.Z., 1999). On remarque que dans la
majorité des cas que les bandes monomorphiques sont situées dans
la zone à migration rapide, et les bandes polymorphiques sont plus
lentes.
Conclusion
L'étude de la synthèse des isoenzymes
d'estérases durant le processus germinatif et pendant le stress salin, a
mis en évidence des variations quantitatives et qualitatives pour la
synthèse des isoenzymes de stress, entre les deux
variétés, tolérante et sensible, avec des ralentissements
métaboloiques et une apparition différente d'isoenzymes
de stress, due à des différences dans la synthèse
de ces isoenzymes au cours du stress salin. En repérant ces marqueurs de
tolérance inductibles par ce stress, il est possible de localiser les
QTLs en question.
Références bibliographiques
Amouri A ., Fyad-Lameche F.Z., 2005.
Comparaison entre le gamétophyte et le sporophyte chez des
écotypes d'espèces annuelles de Medicago pour la
tolérance au stress salin.. Colloque euro-méditerraneen en
biologie végétale et environnement. Annaba, Algérie, 28
-29 et 30 novembre 2005.
Fyad-Lameche. F-Z., 1999. Polymorphisme des
isoenzymes et des protéines de réserves des graines de population
naturelles d'espèces annuelles de Medicago en relation avec le
système de reproduction. Thèse docteur D'état en
Amélioration des plantes. Université d'Oran-Es-Sénia. 194
p.
Khemiri.H, Belguith.h, Jridi.T, Ben El Arbi et Ben
Hamida.J., 2004. Caractérisation biochimique d'une amylase
active au cours du processus germinatif des graines de colza (Brassica
napus L). Congrès International de biochimie. Marrakech, Maroc, 3-6
Mai 2004. pp : 146-149.
Turk.N,Gallardo.K,Job.C,Job.D., 2002.
L'analyse protéomique de la réponse au déficit hydrique
dans la feuille de maïs en croissance. Congrès de la SFEAP, 16,
17,18 Octobre 2002, Lille. p : 6.
Témoin ( T0 )
Traités
J1 J 2 J3 J4 J5 J6 J7
J8 J9 T1 T2 T3
+
-
Figure 1-a : Zymogramme du système
Estérase chez Tru 42
Figure 1-b : Zymogramme du
système Estérase chez Tru 42
 : Flèche indiquant une isoenzyme
de stress
Témoin T0
Traités
J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
J8 J9 T1 T2 T3
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T0
J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
J8 J9 T1 T2 T3
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Figure 2-a : Zymogramme du système
Estérase chez Pol 248 -
Schéma 2-b : Zymogramme du système
Estérases chez Pol 248
 : Flèche indiquant une isoenzyme de stress
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