II.2. Méthodes
II.2.1. Identification du Mycosphaerella fijiensis sur les
échantillons récoltés
Sur
les échantillons, l'identification du M. fijiensis a
été rendue possible grâce à la méthode de
scotch suivant les étapes ci-après :
- A
l'aide d'un binoculaire, bien observer la surface du tissus malade ;
-
Poser un morceau de scotch sur l'échantillon, gratter
légèrement et retirer doucement le scotch de manière
à prélever les structures observées à la loupe
binoculaire ;
- Sur
une lame porte-objet, déposer une goutte de bleu lactophenol et
déposer le morceau de scotch contenant les structures
prélevées, puis y rajouter une seconde goutte de bleu lactophenol
et couvrir la solution avec la lame couvre-objet ;
-
Chauffer l'ensemble de la préparation à la flamme et
observer la lame chauffée au microscope ;
-
Fixer l'image du champignon sur un microscope et observer les structures
(conidies et conidiospores) du champignon au moyen des fiches
d'identification CMI (Commonwealth Mycological Institute) et des
compendiums d'identification des agents phytopathogènes.
II.2.2. Isolement de M. fijiensis sur milieu PDA
II.2.2.1. Préparation de milieu de culture pour
isolement
Le milieu de culture pour l'isolement était
préparé avec 9,75g de PDA mélangé à 250 ml
d'eau, dans un erlenmeyer. La solution a été autoclavée
à 125°C pendant 15 minutes et 1,4 bar. Après l'autoclavage,
0,025g de streptomycine ont été dissouts dans 250ml de milieu
préalablement préparé. Le mélange a
été secoué et bien mélanger. Sous hotte à
flux laminaire, le milieu de culture a finalement été
coulé sur des boîtes de Pétri et immédiatement
emballer et placer au frigo, à 4°C pour sa solidification pendant
48 heures. L'ajout de la streptomycine sulfate visait à éviter la
contamination du milieu de culture par des bactéries.
II.2.2.2. Ensemencement de Mycosphaerella fijiensis
Après identification du M.
fijiensis, des fragments de feuilles de 1 cm de diamètre
préalablement nettoyés à l'alcool éthylique puis
rincés à l'eau distillée, ont été
déposés sur milieu de culture PDA dans les boîte de
Pétri. Les boîtes de Pétri contenant le milieu de culture
sur lesquelles l'agent pathogène a été isolé, ont
été placées dans un étuve à 30 °C
pendant une semaine en vue de favoriser la croissance mycélienne.
| 
