Bio-écologie des anophèles de part et d'autre de la falaise des Mbô et leur implication dans la transmission du paludisme d'altitude

Amplification de l'ADN

Principe : L'amplification des différents loci est faite suivant la technique de polymérisation en chaîne (PCR) de Scott et al., 1993. Elle consiste à utiliser des amorces qui s'hybrident à des sites complémentaires (séquences flanquâtes) situés de part et d'autre de la séquence d'ADN cible. Cela requiert la présence de composantes regroupées dans un "milieu réactionnel" (Tableau B, Annexe 1).

Protocole : Quatre amorces différentes ont été utilisées pour la réalisation de la PCR : une amorce universelle (UN) et trois spécifiques (GA, AR, et ML) dont la séquence, la taille attendue et la localisation sont présentées en annexe 2. L'amplification se déroule dans un thermocycleur (Applied Biosystems system 2700) selon le programme illustré en figure 6 en 3 étapes :

· la dénaturation de l'ADN à haute température (94°C) pour séparer les 2 brins de l'ADN

· l'hybridation des amorces spécifiques à une température propre au type d'amorce : 56°C,

· l'élongation des brins d'ADN néoformés par l'enzyme de polymérisation à 72°C.

Ces cycles se répètent 35 fois^3(*) et le nombre de copies de la séquence choisie subit une augmentation exponentielle car chaque nouveau brin formé sert de matrice à la synthèse d'un autre brin. De manière théorique, le nombre final de copies devrait être de 2ⁿ (n étant le nombre de cycles), mais le rendement est plus faible en pratique. A la fin de la réplication, la température s'abaisse à 4°C pour éviter toute dénaturation de l'ADN.

94°C94°'30"

4°C8

56°C30"

72°C72°C 20"10'

35 cycles

Figure 7 :Programmation du thermocycleur pour la PCR complexe An. gambiae

Détermination des génotypes : migration électrophorétique

Principe : Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques, de charge négative en milieu basique. Placés dans un champ électrique, ils vont se déplacer vers l'anode, mais leurs charges respectives étant à peu près équivalentes, c'est leur masse moléculaire qui va déterminer la vitesse de migration entre les mailles du gel. Plus ils sont légers, plus ils migrerontvite. Le gel d'agarose permet la séparation de fragments de taille comprise entre 0,5 et 20 kb.

Préparation du gel : Pour un gel d'agarose à1,5%, nous mesurons un volume(V) de tampon TBE 1X (tris-borate-EDTA) correspondant à laplaque (moule) à utiliser (le choix d'une plaque est fonction du nombre de puits qu'elle comporte et donc du nombre d'échantillons à faire migrer). On y ajoute une masse d'agarose (m)proportionnelle à la concentration attendue :

L'ensemble est passé aux micro-ondes jusqu'à ébullition puis refroidi à 50° environet on y ajoute5ul de BET (bromure d'éthidium). Cette solution est coulée dans lemoule auquel on ajoute des peignes pour former les puits. Après la polymérisation à température ambiante (1h), les peignes sont retirés et la plaque est placée dans une cuve de migration remplie de TBE 1X.

Distribution et migration des échantillons :A l'aide d'une micropipette, des gouttelettes de 2ul de bleu de charge (bleu de bromophénol 0,25% + bleu de xylène cyanol 0,25% + sucrose 4% + ED) sont déposées sur un morceau de parafilm.Elles permettront de maintenir l'ADN au fond des puits et faire apparaître les bandes sous UV. Ensuite, 10ul de chaque échantillon d'ADN amplifié sont mélangés au bleu de charge puis déposés au fond de chaquepuits. A ces échantillons sont ajoutés les 3 témoins positifs (An. gambiae s.s., An. melaset An.arabiensis),le témoin négatif, ainsi que le marqueur de taille (5ul de 100bp ladder). La cuve est enfin branchée à un générateur de courant continu (100volts) pendant 1h30min.

Lecture et interprétation : Après migration, le gel est photographié sous lumière ultraviolette. Des bandes correspondant à l'ADN ayant migré sont visibles grâce à la fluorescence des molécules de BET fixées sur l'ADN. La correspondance avec les bandes des témoins positifs et celles du marqueur de taille permet de déterminer l'espèce (en fonction des tailles attendues).

* ³Au-delà de 35 cycles, l'enzyme de réplication (la Taq polymérase) est dénaturée