L'intérêt de l'étalon dans les différents paramètres biochimiques.

CHAPITRE III : L'ETALONNAGE

III.1.Les Etapes De Dosage :

Un dosage par étalonnage consiste à déterminer la concentration d'une espèce chimique en comparant une grandeur physique, caractéristique de la solution, à la même grandeur physique mesurée pour des solutions étalon. La grandeur physique peut être l'absorbance, la conductivité électrique, etc. ...

La détermination de la concentration se fait soit par la lecture sur le graphe de la courbe d'étalonnage, soit par le calcul à partir de l'équation modélisant le graphe. Le dosage par étalonnage est une méthode non destructive, car elle ne met pas en jeu de réaction chimique.

Le spectrophotomètre peut être utilisé pour titrer une solution colorée. Cette méthode de titrage est non destructive.

Si la loi de Béer-Lambert est bien respectée, on obtient une droite passant par l'origine. On trace ainsi une courbe d'étalonnage. Pour effectuer le titrage d'une solution inconnue S, on place la cuve contenant la solution à titrer dans le spectrophotomètre et on relève la valeur de l'absorbance AS.

A l'aide de la courbe d'étalonnage, on peut déterminer la concentration CS de la solution.

Etapes habituelles de l'utilisation d'un spectrophotomètre :

1. Mise sous tension du photomètre ; respecter le temps nécessaire de chauffe (stabilisation de l'intensité lumineuse) avant utilisation.

2. Sélection de la longueur d'onde.

3. Réglage du 0% d'absorbance (facultatif).

4. Réalisation de l'étalonnage.

5. Contrôle de qualité.

6. Dosage des échantillons.

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III.2.L'étalonnage (Calibration) :

En biochimie, il est généralement nécessaire d'étalonner (ou de calibrer) la méthode de dosage. Il s'agit de comparer la DO des échantillons à tester avec celle d'une solution dont on connaît la concentration avec précision et que l'on appelle étalon.

La concentration de l'étalon a été mesurée avec une méthode de référence. On peut utiliser différentes dilutions de cet étalon et ainsi obtenir une « gamme d'étalonnage ». Il est également possible d'utiliser l'eau pure (obtenue par distillation et/ou déminéralisation) comme un étalon de valeur nulle.

III.3.Exemple D'une Gamme D'étalonnage Pour Le Dosage Du Glucose :

- On dispose d'une solution étalon de glucose de concentration Cet = 2g/l

- Dans 1 tube, on prépare une dilution au demi de l'étalon (100 tl étalon + 100 tl d'eau) dont la concentration est donc 1 g/l

- On prépare une galerie de 3 tubes E2, E1 et E0

	Contenu du tube	Concentration (g/l)
E2	50 ul Etalon pur	2,0
E1	50 ul Etalon dilué au 1/2	1,0
E0	50 ul Eau distillée	0,0

- On ajoute dans chaque tube 1 ml de réactif de glucose oxydase (qui contient l'ensemble des éléments nécessaires à la réaction ci-dessus).

- On mesure les DO de chaque tube grâce au photomètre réglé à la longueur d'onde de 505

nm.

- On obtient les DO suivantes :

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.

	Contenu du tube	Concentration (g/l)	DO
E2	50 ul Etalon pur	2,0	1,58
E1	50 ul Etalon dilué au 1/2	1,0	0,88
E0	50 ul Eau distillée	0,0	0,03

Sur du papier millimétré on reporte les valeurs des DO en fonction de la concentration et on obtient la droite d'étalonnage.

Figure 03 : Droite D'étalonnage

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III.3.1.Le Contrôle De Qualité Par Les Sérums De Contrôle :

Un sérum de contrôle est un échantillon de concentration connue, dont la nature est si possible proche de celle des échantillons (plasma ou sérum, urine). Il sert à vérifier que l'étalonnage est correct et garantit donc que les résultats obtenus avec les échantillons seront également fiables.

La concentration des sérums de contrôle est connue mais, à la différence avec l'étalon, elle n'a pas été mesurée avec une méthode de référence mais avec une ou plusieurs méthodes usuelles dont, si possible, celle que l'on utilise. Par conséquent, on n'indique pas «la» valeur exacte d'un sérum de contrôle mais une plage de valeurs acceptables.

Exemple :

On dispose d'un sérum de contrôle dont la valeur est comprise entre [0,9 - 1,1] g/l. On place 50 ul de ce contrôle dans un tube. On ajoute 1ml de réactif. On lit au photomètre et on obtient une DO de 0,84.

On reporte cette valeur de DO sur la droite d'étalonnage tracée précédemment (point rouge ci-dessous) et on obtient une valeur de concentration de 0,98 g/l

Figure 04 : Droite D'étalonnage Et Sérum De Contrôle.

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	Contenu du tube	Concentration (g/l)	DO
E2	50 ul Etalon pur+ 1 ml réactif	2,0	1,58
E1	50 ul Etalon dilué au 1/2+ 1 ml réactif	1,0	0,88
E0	50 ul Eau distillée+ 1 ml réactif	0,0	0,03
Ctrl	50 ul CQI + 1 ml réactif	0,98	0,84

0,98 est compris entre 0,9 et 1,1. La valeur trouvée du contrôle est dans la plage acceptable. Le contrôle est bon, la calibration est acceptée et on peut procéder au dosage du glucose dans les échantillons provenant des patients.