III.4.La Variabilité De La Droite De
L'étalonnage :
Dans le cas d'une méthode de dosage manuelle, il est en
général nécessaire d'étalonner (de réaliser
une gamme d'étalonnage) à chaque série et, quelques soient
les précautions prises par l'opérateur, la droite
d'étalonnage ne sera jamais exactement la même.
Cf. figure ci-dessous :
Un jour, ce sera la droite rouge, le lendemain la droite bleue,
un autre jour, la droite verte, etc.
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[PARTIE THEORIQUE] [CHAPITRE III :
L'ETALONNAGE]
Figure 06 : Variabilité De La Droite
D'étalonnage - Etalonnages Acceptables
Plusieurs facteurs peuvent expliquer cette variabilité
:
L'étalon :
- L'étalon peut « vieillir », s'il est
utilisé et réutilisé pendant plusieurs jours.
- Parfois l'étalon doit être reconstitué
par l'opérateur avec de l'eau distillée ou un autre solvant :
dans ce cas, il est essentiel qu'il soit reconstitué de la façon
la plus précise possible (pipettes de très bonne qualité,
précises et justes) avec l'eau également de la meilleure
qualité possible. Cette étape de reconstitution est toujours
source de variabilité.
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L'ETALONNAGE]
Le Réactif :
- lui aussi est utilisé dans plusieurs séries,
donc il « vieillit » ; il faut donc veiller à ce que les
conditions de conservation des réactifs, comme des étalons,
soient les meilleures possibles ;
- le réactif est parfois préparé par
l'utilisateur (en mélangeant un réactif avec un tampon, par
exemple) ; cela induit également une variabilité.
L'appareil De Mesure (Le Spectrophotomètre) :
- Les performances de l'appareil de mesure
(spectrophotomètre ou photomètre) peuvent également varier
: usure de la lampe, empoussièrement...
- Tous ces facteurs sont autant de variables qui vont
influencer l'allure de la courbe d'étalonnage ainsi que chaque
mesure.
- Au-delà de certaines limites, les droites
d'étalonnage ne sont plus acceptables (droites en pointillé
ci-dessous).
Figure 07 : Variabilité De La Droite
D'étalonnage - Etalonnages Inacceptables
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L'ETALONNAGE]
III.5.Autre Caractéristiques D'un Dosage
Biochimique Photométrique :
III.5.1.Domaine De La Mesure :
Il est important de définir pour ce dosage le domaine
de mesure, c'est-à-dire la limite de quantification, d'une part, et la
limite de linéarité, d'autre part.
? Limite De Quantification :
La limite de quantification correspond à la valeur la
plus basse en dessous de laquelle les résultats ne sont plus fiables,
notamment car non répétables.
La détermination de cette limite fait appel à
des mesures expérimentales dont nous ne donnerons pas le détail
ici. Il faut simplement savoir que cette limite est indiquée dans la
notice des kits commerciaux de réactif. Elle peut être
égale à zéro ou, fréquemment, supérieure
à zéro. En dessous de cette valeur (si elle est non nulle) on ne
peut pas mesurer précisément une concentration. Le
résultat sera alors rendu comme « inférieur à la
limite de quantification ». Il n'y a pas de solution pour rendre un
résultat s'il est inférieur à la limite de
détection, à moins de changer de méthode de dosage (ou de
la modifier). De plus, l'intérêt médical de rendre une
valeur inférieure à la limite de quantification est
généralement faible.
Exemple :
Le fournisseur du kit de glucose oxydase utilisé
indique que la limite de quantification est égale à, 0,1 g/l. Si
la valeur mesurée correspond à 0,07 g/l, le résultat rendu
ne sera pas « =0,07 g/l » mais « <0,1 g/l ».
? Limite De Linéarité :
La limite de linéarité est la valeur de
concentration au-delà de laquelle la relation entre la DO et la
concentration n'est plus linéaire, c'est-à-dire que la loi de
Beer-Lambert n'est plus respectée à cause d'une trop forte
concentration de la molécule à doser.
En général, on fait en sorte que la droite
d'étalonnage comporte un point proche de la limite de
linéarité. La limite de linéarité est
également indiquée par le fournisseur dans la notice des kits
commerciaux de dosage. Sinon, on peut considérer que le point le plus
élevé de la droite d'étalonnage correspond à la
limite de linéarité.
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L'ETALONNAGE]
Si la concentration mesurée est supérieure
à la limite de linéarité, on dilue l'échantillon de
façon à ce que la concentration de la substance à doser
soit comprise entre la limite de quantification et la limite de
linéarité. En général, on peut diluer dans l'eau
distillée ou le sérum physiologique (NaCl 9°/00) qui
présente l'intérêt d'être plus proche du sérum
que l'eau pure. La notice d'utilisation des kits commerciaux indique la nature
du solvant à utiliser pour les dilutions si ce n'est pas de l'eau.
Exemple :
Le fournisseur du kit de glucose oxydase utilisé
indique que la limite de linéarité est égale à 2,0
g/l. La valeur mesurée pour le sérum d'un patient correspond
à 2,4 g/l, résultat qui ne pourra être rendu tel quel. On
effectue une dilution au 1/2 (200 ul sérum + 200 ul eau) dans un tube et
on effectue la réaction sur cette dilution. On obtient une concentration
de 1,35 g/l. On multiplie ce résultat par 2 (facteur de dilution) et on
obtient de concentration de 2,70 g/l.
Le résultat pour ce patient est 2,70 g/l.
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VOLET
PRATIQUE
[PARTIE PRATIQUE] [METHODOLOGIE DE L'ENQUETE]
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