2.3 Techniques d'analyses :
La situation de l'eau présente un risque de contamination
par des bactéries pathogènes (Coliformes, Escherichia
coui...), pour cette raison on fait des analyses basées sur deux
techniques pour détecter ces micro-organismes présents dans l'eau
traitée et l'eau brute. a. Filtration sur membrane (Eau
Traitée) :
v Principe de la méthode :
On procède à une filtration par un appareil de
filtration sur membrane. La membrane est en esters de cellulose, de
porosité 0.45 um, susceptible de retenir les bactéries (Rodier et
al, 1997). Un échantillon de 100 ml d'eau est filtré sur cette
membrane, cette dernière est déposée à la surface
d'un milieu gélosé. Après incubation, on compte le nombre
de colonies.
Figure 24 : Système de filtration sur
membrane
v Matériel utilisé :
· Matériels de stérilisation (autoclave,
four)
· Système de filtration sur membrane
· Etuve ou enceinte thermo statée 37°C #177;
1
· Gélose au « Tergitol » 7 et «
Slanetz et Bartley » (annexe 4, planche photos 1)
· Matériel de microbiologie : boites de pétri
stériles, pipettes 1 ml (usage unique), flacons stériles.
Figure 25 : Autoclave
v Protocol expérimental :
· Nettoyer le robinet avec un tissu propre,
stériliser à la flamme l'embouchure du robinet et laisser couler
l'eau pendant 1 à 2 min.
· Préparer une zone stérile puis placer
autour du bec Bunsen les boites de pétri avec gélose au Tergitol
7 et les pipettes stériles.
· Placer la membrane stérile sur le
système de filtration.
· Mettre en place la pompe à vide.
· Agiter le flacon vigoureusement.
· Verser 100 ml d'échantillon d'eau et filtrer en
aspirant avec la pompe à
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vide.
· En zone stérile, ouvrire le système de
filtration et retirer la membrane avec une pince stérile.
· Mise en culture en déposant la membrane sur la
gélose, les éléments nutritifs de ce dernier traversent la
membrane, ce qui permet le développement des bactéries en
surface.
· Incuber les boites à l'étuve à 37
°C pendant 24 jusqu'à 48h pour la recherche de coliformes. Pour la
recherche de coliformes thermo tolérants, placer les boites à 44
°C pendant 24h.
b. La méthode de NPP (Eau Brute) :
v Principe de la méthode :
La méthode du nombre le plus probable est une estimation
statistique du nombre de micro-organismes qu'on peut trouver dans l'eau d'une
manière aléatoire, elle est applicable sur les eaux brutes ayant
une teneur plus ou moins élevée en MES, elle consiste à
ensemencer trois milieux de culture par dilution, les tubes
ensemencés contiennent un milieu nutritif, milieu Lauryl pour les
coliformes avec introduction de cloche de Durham dans ce dernier, après
incubation on compte le nombre des tubes positifs (dégagement de gaz,
trouble, changement de couleur) pour chaque dilution et on fait la lecture du
NPP correspondant en utilisant la table de Mac Grady. Il s'agit d'une
méthode quantique et non pas énumératif. (23)
v Matériel utilisé :
· 3 tubes contenant 9 ml de diluant (eau
distillée).
· 3 pipettes stériles en plastique de 1 ml.
· Bec bunsen pour garder la stérilité de la
zone de travail.
· 1 vortex.
v Protocole expérimentale :
Ø Coliformes totaux et fécaux :
TEST PRESOMPTIF :
· Stérilisation de la zone de travail
· Ensemencement :
1 ml
0,1 ml
10 ml
Simple
concentration
Double
concentration
Buillon
Lauryl sulfate
de tryptose
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Figure 26 : Schéma désignant
l'ensemencement de l'échantillon à 3 différentes
dilutions
recherchant les coliformes totaux et fécaux. (Annexe 4,
planche photos 1).
· Incubation : à 37°C#177; 1°C pendant
48h
· Dénombrer les tubes positifs : trouble + gaz
· Repiquer les tubes positifs sur les milieux confirmatifs
: BEA.
TEST CONFIRMATIF : (annexe 4, planche photos
1)
Coliformes totaux Coliformes fécaux
Ensemencement des tubes positifs
Vert brillant EC medium
Incubation
37°C #177; 1°C/48h 44°C#177; 0,5°C/24h
·
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Dénombrement des tubes positifs : trouble + gaz
· Choix du triplet ? lecture-table de Mac Grady? NPP/100
ml.
Ø Streptocoques fécaux :
TEST PRESOMPTIF :
· Stérilisation de la zone de travail
· Ensemencement :
0,1 ml
Simple
concentration
1 ml
Buillon glucosé à l'azide de sodium
Double
concentration
10 ml
Figure 27 : Schéma désignant
l'ensemencement de l'échantillon à 3 différentes
dilutions
recherchant les streptocoques fécaux. (Annexe 4, planche
photos 2).
· Incubation : à 37°C#177; 1°C pendant
48h
· Dénombrer les tubes positifs : trouble et/ou
dépôt
· Repiquer les tubes positifs sur les milieux confirmatifs
: Litsky
TEST CONFIRMATIF :
· Dénombrer les tubes positifs : trouble +
pastille violette éventuellement au fond du tube
· Choix du triplet ? lecture-table de Mac Grady? NPP/100
ml (annexe 3).
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