Chapitre II : Matériel & Méthodes
1.4 Les cytokines :
La cytokine recombinante humaine IL-4(Cell signaling) a
été utilisée pour l'induction des cultures de PBMC.
2. Matériel non biologique :
- Dextran sulfate sodium (DSS) (Consultancy AB, Sweden), est
un polymère de polysaccharide sulfatés, de poids
moléculaire varient entre 36 000 Da - 50 000Da.
- Milieux de culture :
? Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma) enrichi par
l'addition de 10% de SVF, 1% d'antibiotique er de L-Glutamine à 1mg/ml
préalablement décomplémenté à +56°C,
pendant 30min.
? RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium/Sigma Aldrich)
enrichi avec 5% de sérum de veau foetal (SVF) préalablement
« décomplémenté » à +56°C, pendant
30 min.
- Antibiotiques : pénicillines10000 UI-streptomycine
10mg/ml (Sigma).
- Griess A (a-naphtylamine) et Griess B (acide sulfanilique).
- EDTA (Ethylène Diamine Tétraacétique).
- PBS: KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4.
- Ficoll 1077 SIGMA Histopaque®-1077 sterile-filtered,
density: 1.077 g/mL
-Pierce High Capacity Endotoxin Removal kit (Life
Technologies)
- Hematoxylin (Sigma Aldrich)
- Eosin (Sigma Aldrich)
- Eukitt® (Fluka analytical, Sigma Aldrich)
II. Méthodes :
1. Préparation de l'extrait de la membrane
lamellaire :
L'extrait brut de la membrane lamellaire hydatique est
préparé selon le protocole décrit par (Amri et al.,
2012). Le liquide hydatique est aspiré à l'aide d'une
seringue, la membrane du kyste est ensuite lavée plusieurs fois au PBS
stérile contenant 300UI de pénicilline et 0.3 mg/ml de
streptomycine et congelée pendant une nuit.
La membrane lamellaire est ensuite séparée de la
membrane germinative dans un environnement stérile ; elle est
lavée plusieurs fois avec un tampon PBS stérile (pH : 7.4)
contenant 4% d'antibiotiques. Elle subit par la suite plusieurs cycles de
sonication de 10s pendant 10min dans du tampon PBS contenant un cocktail
d'anti-protéases jusqu'à l'obtention d'une solution
homogène. Par la suite cette solution est laissé à
décanter à 4°C, le surnageant qui en résulte
représente l'extrait brut de la membrane lamellaire, il est ensuite
récupéré et conservé à -20°C et servira
à l'induction des cultures des PBMC.
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