2.10. Recherche de gènes de résistance par
PCR
La PCR est une technique bien établie qui amplifie, de
façon sélective, certaines régions d'ADN
génomique en fonction de la liaison d'amorces qui sont
propres aux régions en question (Aboura,
2010).
2.10.1. Extraction de l'ADN par Choc thermique
(Perez-Hernandez et al.,2002)
> Mélanger 100ul de l'eau distillée avec une
colonie ;
> Incuber au bain marie à 100°C pendant 10 min
;
> Mettre au congélateur à -4°C pendant 10
min ;
> Ré-incuber au bain marie à 100°C pendant
5 min ;
> Centrifuger le mélange 5min à 12000 rpm ;
> Récupérer le surnageant dans un nouveau
Eppendorf.
38
Matériel et Méthodes
2.10.2. Dosage d'ADN par la
spectrophotométrie
C'est l'une des méthodes les plus répandues pour
le dosage des acides nucléiques. La spectrophotométrie mesure
l'absorbance ou la densité optique (DO) des acides nucléiques
à 260 nm (absorbent dans l'ultraviolet). Parallèlement, nous
mesurons l'absorbance à 280 nm pour le dosage des protéines. Un
rapport R est déterminé pour estimer la pureté de l'ADN
:
R= DO260/DO280
? Pour une solution d'ADN pure : le ratio doit être compris
entre 1,8= R = 2 ;
? Pour une solution d'ADN contaminée par les
protéines : le ratio est inférieur à 1,8 ;
? Pour une solution d'ADN contaminée par les ARN : le
ratio est supérieur à 2. Enfin, la concentration de la solution
d'ADN est calculée par la formule suivante :
C (ng/ul) = DO260 ×50 × D
? D: dilution
2.10.3. Amplification de l'ADN par PCR
La PCR standard est effectuée pour détecter les
â-lactamases de type TEM et VIM.
A. Préparation du mix
Le mélange réactionnel (24 ìl) ou le Mix se
fait dans une pièce spéciale avec le port de gants pour
éviter toute contamination et qui sera par la suite
distribué dans des tubes Eppendorf (Tableau 05).
Les amorces d'oligonucléotides sont
énumérées respectivement sur le tableau
06.
Tableau 06.Produits du mix pour la PCR
|
Produit
|
Réaction pour un échantillon
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|
dNTP(10 mM)
|
0.5ìl
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Tampon 1-10X (MgCl2 20mM)
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2.5 ìl
|
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Taq (5pig/pil)
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0.25 ìl
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Chaque amorce (10 piM)
|
1.5 ìl
|
|
Eau
|
17.75 ìl
|
|
Volume total du mix
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24 ìl
|
39
Matériel et Méthodes
Tableau 07.Les amorces
d'oligonucléotidiques utilisées pour la PCR
|
Gènes cibles
|
Amorces
|
Séquences
|
Taille de l'amplicon (pb)
|
|
blaTEM
|
TEM-F
|
ATGAGTATTCAACATTTCCGTG
|
840
|
|
TEM-R
|
TTACCAATGCTTAATCAGTGAG
|
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BlaVIM
|
VIM-U
|
ATTGGTCTATTTGACCGCGTC
|
382
|
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VIM-L
|
TGCTACTCAACGACTGCGCG
|
Chaque constituant de ce mix est multiplié par le nombre
d'échantillons étudiés, puis 24ul de ce mélange
sont distribués dans chaque tube Eppendorf PCR stériles :
> Témoin négatif : 1ul d'eau
distillé stérile plus 24ul de mix ;
> Témoin positif : 1ul de DNA positif
pour 24ul du mix ;
> Echantillons : 1ul de DNA de notre
échantillon est ajouté à 24ul de mix;
> Volume total : 25ul par échantillon
(les témoins ou les échantillons à analyser).
Le mix et les DNA sont transférés dans des tubes
Eppendorf de type « Master cycler
personnal » et sont introduits dans le thermocycleur.
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