TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle

IV - DISCUSSION

Ces travaux de recherche concernent l'étude du rôle de TLS dans les voies de signalisation de l'acide rétinoïque. TLS est une protéine bi-fonctionnelle dans le mécanisme d'action de l'AR au niveau de la régulation transcriptionnelle et de la régulation post-transcriptionnelle par l'AR. En effet, des expériences de transactivation et de retard sur gel mettent en évidence que TLS participe au complexe transcriptionnel de l'hétérodimère RXR-RAR, appelé RANC permettant d'augmenter la transactivation dépendante de l'AR sur les promoteurs de gènes cibles. Dans un premier temps, des techniques de transfection transitoire dans des cellules Cos-6 et dans les cellules myéloblastiques HL-60 démontrent que TLS est capable d'augmenter l'activité transcriptionnelle du promoteur naturel de RAR sensible à l'action de l'acide rétinoïque en présence d'acide rétinoïque. Il avait été précédemment mis en évidence que TLS possédait une activité transcriptionnelle per se. En effet, la partie N-terminale de TLS impliquée dans la protéine de fusion TLS/ERG est considérée comme un pré-requis pour le facteur de transcription ERG altéré dans son potentiel leucémogène en augmentant son activité transcriptionnelle et/ou en changeant sa spécificité au niveau des gènes cibles (Zinszner et coll., 1994 ; Ichikawa et coll. , 1999). En outre, il a été mis en évidence que la partie N-terminale de TLS fusionnée au domaine de liaison de l'ADN de Gal4 possède une forte activité transcriptionnelle (Uranishi et coll., 2001).

Afin de déterminer si TLS faisait partie du RANC, des expériences de retard sur gel ont été effectuées en utilisant comme sonde oligonucléotidique DR5. A cette fin, des extraits de cellules Cos-6 transfectées par RAR, RXR ou TLS ont été utilisées. Les résultats démontrent que TLS fait partie de RANC. Une autre étude réalisée in vitro montre que cette interaction est directe et indépendante de la présence de l'acide rétinoïque et semble spécifique aux récepteurs à l'acide rétinoïque RXR, aux glucocorticoïdes, aux oestrogènes, et à l'hormone thyroïdienne (Powers et coll., 1998). Cette interaction directe est indépendante de la présence du ligand. Cette observation est due au fait que le complexe se forme entre le domaine de liaison de l'ADN (domaine C) et la région D du récepteur nucléaire avec la partie N-terminale de TLS (Powers et coll., 1998). La région C, composée de 66 acides aminés, est la plus conservée parmi tous les membres de la superfamille des récepteurs nucléaires. Elle contient deux structures de ^« doigt à zinc ^» et correspond au domaine de liaison du récepteur nucléaire à l'ADN. La région D, appelée également zone charnière, se situe entre le domaine de liaison à l'ADN et la région E. Elle est subdivisée en trois sous-régions (D1, D2 et D3) dont la région D1 N-terminale, la plus conservée, contient de nombreux acides aminés basiques qui correspondraient à un signal de localisation nucléaire. La région centrale D2 est plus variable. Il est intéressant de noter que l'interaction de TLS avec le domaine de liaison à l'ADN de RXR n'altère pas la liaison du récepteur nucléaire sur son élément de réponse spécifique.

La fonction co-activatrice de TLS au niveau du complexe transcriptionnel des récepteurs à l'acide rétinoïque pourrait sembler paradoxale dans le fait que l'interaction de TLS avec RXR implique son domaine de liaison de l'ADN. Cependant, cette interaction n'est pas déstabilisatrice du complexe protéine/ADN. Bien au contraire, puisqu'il est établi que cette interaction protéine/protéine soit stabilisatrice du complexe RXR-ADN (Powers et coll., 1998). De plus, cette interaction n'empêche pas le changement de conformation des récepteurs nucléaires. Ainsi, TLS par son action stabiliserait le complexe co-activateur des récepteurs à l'acide rétinoïque. Les principaux complexes co-activateurs des récepteurs nucléaires comprennent le complexe Brg (SWI/SNF), les co-intégrateurs CBP et p300, la famille des protéines p160, la protéine p/CAF et les complexes TRAP/DRIP/ARC.

TLS a déjà été impliquée dans le complexe transcriptionnel d'un autre facteur de transcription, NFB. Ainsi, TLS augmente la transactivation dépendante de NFB induite par des stimuli physiologiques tels que TNF et l'IL-1 (Uranishi et coll., 2001). TLS agit donc en tant que co-activateur de divers facteurs de transcriptions.

Enfin, TLS partage des caractéristiques structurales avec hTAFII68. Ces protéines ont été retrouvées associées avec les complexes TFIID (Bertolotti et coll., 1997 et 1998) et sont impliquées dans l'activation transcriptionnelle (Prasad et coll., 1994 ; Zinszner et coll., 1994 ; Bertolotti et coll., 1999 ; Ichikawa et coll., 1999). TLS interagit in vivo avec TFIID (Uranishi et coll., 2001). De plus, TLS est associée à l'ARN polII via son domaine N-terminal (Yang et coll., 2000). L'ensemble de ces interactions pourrait permettre à TLS de faire le lien moléculaire entre des facteurs de transcription et le complexe d'initiation de la transcription.

L'ensemble de ces études implique de façon indéniable TLS dans la régulation transcriptionnelle au niveau des voies de signalisation des rétinoïdes.

La seconde partie du projet de recherche concerne le lien éventuel entre les voies de signalisation des rétinoïdes et la régulation post-transcriptionnelle à travers la modulation de l'épissage alternatif. En effet, le fait que TLS, facteur d'épissage, soit impliquée dans les voies de signalisation de l'AR à travers son rôle direct dans la coactivation transcriptionnelle dépendante du RANC incite à étudier le rôle de l'acide rétinoïque et de ses récepteurs dans l'épissage.

Les résultats expérimentaux montrent que TLS agit in vivo sur la sélection du sites 5' d'épissage alternatif de l'ARN pré-m E1A dans les cellules hématopoïétiques K562. La sélection du site 5' distal de E1A correspondant à la formation de l'isoforme 9S est favorisée au détriment de celle des sites proximaux 12S et 13S.

Certaines données nous aiguillent sur le rôle de TLS dans la régulation de l'épissage alternatif in vivo. TLS est associée aux RNPs en formant in vivo un complexe avec la hnRNP A1, un facteur d'épissage capable de favoriser la sélection du site 5' distal d'épissage pendant un épissage alternatif de n'importe quel ARN pré-m (Uranishi et coll., 2001). Il a été précédemment montré que TLS agissait sur la sélection du site distal de E1A dans les cellules érythroblastiques de Souris IW1-32 (Hallier et coll., 1998). Les expériences effectuées sur les cellules K562 transfectées par E1A permettent de mettre en évidence une augmentation du taux d'isoforme 9S en présence d'AR et de TLS. L'interférence fonctionnelle entre TLS et l'acide rétinoïque peut être due à des interférences moléculaires, c'est à dire des interactions physiques protéine/protéine. Cette hypothèse peut s'appuyer sur l'interaction directe montrée par des travaux précédents. Par conséquent, ces résultats identifient l'acide rétinoïque en tant qu'acteur impliqué dans la régulation de l'épissage. C'est la première fois qu'il est mis en évidence l'action d'une hormone sur l'épissage. Ces travaux permettent de définir un nouveau niveau de régulation des voies de signalisation des rétinoïdes.

Le fait que TLS interagisse avec RXR, TR et GR permet de raisonnablement penser que ce phénomène se retrouve à un niveau plus général.

L'épissage de l'ARN, étape critique de l'expression des gènes, est de plus en plus considéré comme un événement co-transcriptionnel. Des évidences expérimentales indiquent désormais que les étapes de transcription, le « capping » et la polyadénylation, sont intimement liées à l'ARN polII à travers son association avec les facteurs impliqués dans ces mécanismes moléculaires (Cho et coll., 1997 ; Hirose et coll., 1998). Les protéines de régulation de l'épissage, les protéines SR, sont associées à l'ARN polII. Cependant, les moyens par lesquels cette association s'effectue n'étaient pas identifiés. Le co-activateur transcriptionnel p52 est capable d'interagir avec la protéine SR, ASF/SF2. p52 agit ainsi en tant qu'adaptateur afin de coordonner la transcription et l'épissage (Ge et coll., 1998). TLS interagit aussi avec l'ARN polII et les protéines SR (Yang et coll. , 2000). TLS pourrait donc agir en tant que molécule recruteuse des facteurs de régulation de l'épissage SR vers l'ARN polII, couplant ainsi la transcription avec l'épissage. TLS pourrait aussi agir directement sur l'épissage par son interaction avec l'ARN (Lerga et coll., 2001).

TLS contient trois domaines potentiellement impliqués dans la liaison à l'ARN, RGG1, RRM et RGG2-3. Le mécanisme impliqué dans la reconnaissance de l'ARN par TLS est encore inconnu. La structure secondaire de l'ARN représente une part importante des interactions protéine/ARN. Les séquences sélectionnées se fixent à TLS avec des affinités de l'ordre de 250 nM à 600 nM, le Kd de 250 nM correspondant au complexe ggugARN/TLS (Lerga et coll., 2001). Par conséquent, TLS semble être une protéine possédant une faible affinité pour sa séquence ARN. Ainsi, il n'est pas exclu que le Kd du complexe TLS/ggugARN déterminé in vitro soit éloigné du Kd d'un complexe ARN/protéine au niveau du spliceosome. Cependant, une faible affinité d'un facteur d'épissage pour sa séquence ARN cible pourrait représenter une condition compatible avec l'assemblage du « spliceosome » qui se déroule à travers l'échange et le replacement d'un grand nombre de protéines au niveau du substrat,l'ARN pré-m.

Les fonctions de TLS dans la régulation de la transcription et dans l'épissage permettent d'envisager les conséquences d'une altération de TLS dans certaines pathologies. Dans les cellules leucémiques myéloïdes possédant la translocation t(16;21) et dans les cellules de liposarcome dans la translocation t(12;16), un seul allèle est interrompu alors que l'autre allèle est intact (Crozat et coll. , 1993 ; Rabbitts et coll., 1993 ; Yamamoto et coll., 1997). Ces observations suggèrent un rôle de protéine de fusion générée de type dominante négative. La protéine de fusion TLS/ERG, observée dans la leucémie myéloïde humaine t(12;16), pertuberait l'épissage in vivo de E1A observé dans des cellules HeLa (Yang et coll., 2000). Il est à noter que TLS n'était pas considérée capable d'agir sur E1A dans ces cellules, ce qui semble erroné à partir d'autres observations effectuées (F. Moreau-Gachelin, communication personnelle). Néanmoins, TLS est capable d'inhiber la fonction des TASR sur l'épissage de l'ARN pré-m E1A (Yang et coll., 2000). De plus, il est intéressant de noter que l'épissage de CD44 est altéré par la présence de la protéine de fusion TLS/ERG dans des clones stables générés à partir de cellules de la lignée K562 (Yang et coll., 2000). Le gène CD44 code pour une molécule d'adhésion constituée de dix exons constitutifs et dix exons variables. Différentes combinaisons formées par les exons variables est à l'origine d'une grande variété d'isofomes d'épissage de CD44 qui diffèrent au niveau de leur domaine extracellulaire. L'épissage anormal de l'ARN pré-m CD44 a été retrouvé dans diverses tumeurs solides et des leucémies (Cooper et coll., 1995). En outre, Il a été suggéré que les variations en taux protéique des SR selon les différentes étapes du développement du cancer du sein puissent être directement liées aux variations des diverses isoformes de CD44 (Stickeler et coll. , 1999). Deux mécanismes sont envisagés pour expliquer l'effet dominant négatif de TLS/ERG sur l'épissage de CD44. Le premier considère que TLS s'accrochant aux isoformes spécifiques de CD44, TLS/ERG bloquerait cette voie de régulation, à l'origine d'une dégradation prématurée de l'ARN pré-m de CD44 non épissé complètement. Dans le second mécanisme, si l'une des voies de régulation est bloquée et qu'une autre voie de régulation de l'épissage alternatif existe, l'inhibition de la première voie par TLS/ERG pourrait inciter l'épissage de CD44 à travers une autre voie de régulation, augmentant ainsi le risque de générer un épissage aberrant.

Si TLS est exprimée de façon ubiquitaire, il est intéressant de noter des différences d'expression dans les cellules hématopoïétiques normales et pathologiques. Les cellules souches hématopoïétiques purifiées de sang de cordon ont des taux inférieurs de TLS comparées aux cellules myéloïdes. D'autre part, une expression importante de TLS fut mise en évidence dans des cellules de LAM (Mills et coll., 2000). Il est intéressant de noter que TLS a été également identifiée par son taux d'expression diminué dans les cellules HL-60 traitées par l'acide rétinoïque pendant une heure. De plus, l'expression de TLS est fortement diminuée dans les cellules HL-60 au cours de la granulopoïèse induite par le DMSO ou l'ATRA. Il existe une spécificité à la granulopoïèse puisque la différenciation monocytaire induite par le TPA ou la vitamine D3 n'agit pas sur l'expression de TLS (Mills et coll., 2000). Cette diminution d'expression est associée avec la baisse de la prolifération cellulaire dans les diverses LAM. L'ensemble de ces observations suggère que l'expression de TLS est un régulateur clef de la myélopoïèse où un fort taux d'expression de TLS favorise la prolifération cellulaire au détriment de la différenciation.

Les perspectives de ces travaux s'articulent sur deux axes. Le premier concerne les mécanismes moléculaires fondamentaux qui impliquent TLS dans les voies de signalisation de l'acide rétinoïque. Nous envisageons d'étudier TLS dans la régulation de l'épissage constitutif et l'épissage alternatif en 3' d'épissage. L'effet de l'AR sur l'épissage de E1A sera aussi étudié à travers les rôles de RAR et RXR. Il s'agit aussi de déterminer avec précision l'association de TLS dans le complexe transcriptionnel de l'AR. Ainsi, des expériences d'identification des interactions directes entre TLS et RAR seront effectuées sachant qu'elles ont été mises en évidence avec RXR (GST pull down et co-immunoprécipitation). Nous voulons étudier la coordination de l'épissage et de la transcription pour savoir si ces mécanismes sont dépendants ou indépendants l'un de l'autre (une construction réunissant les gènes E1A et la luciférase sous la dépendance d'un promoteur muté sensible à l'AR, ne permettant pas au RANC de se fixer pour augmenter la transcription). Le rôle biologique de TLS sera déterminé par son invalidation transitoire (RNAi). Le deuxième axe consiste à confirmer le lien entre TLS et la pathologie. Il s'agit de comprendre les conséquences de l'altération de l'expression de TLS et son ciblage dans le cadre d'une nouvelle prospective thérapeutique et diagnostique.