Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur les enzymes alpha amylase, trypsine et lipase

Republique Algerienne Democratique et Populaire

Ministere de 1'Enseignement Superieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE AMAR TELIDJI LAGHOUAT

FACULTE DES SCIENCES ET DE L'INGENIERIE
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE



_4,A^y=k=4;

MEMOIRE DE FIN D'ETUDES
En vue de l'obtention du diphime d'Ingenieur d'Etat en Biologie
Option : Genie Biologique

Thême

Effets des extraits de quelques plantes

medicinales locales sur les enzymes: a-amylase,

trypsine et lipase

Presents par : Encadre par :


· BENAROUS Khedidja YOUSFI Mohamed

n DJERIDANE Amar

Je dedie ce modeste travail a

mes parents, qui m'ont encourage,

mes freres et sours qui m'ont supporte.

Remerciements

Que toutes les personnes m'ayant permis de mener a bien ce travail de these soient assurees de ma gratitude.

Je tiens a remercier M D. Benbertal Directeur du Laboratoire des sciences fondamentales de l'Universite AMAR TELIDJI de Laghouat de m'avoir accueilli et d'avoir mis a ma disposition tout le materiel necessaire.

Je tiens a exprimer mes sinceres remerciements au Dr M YOUSFI, Maitre de conferences a l'Universite de Laghouat, responsable de cette etude, pour avoir accepte de m'encadrer, pour le choix du theme et pour avoir partici* activement a la correction de ce manuscrit afin de realiser cette etude. Ses competences techniques et son efficacite ont fortement contribue a la realisation de cette these.

Mes sinceres remerciements iront egalement a Monsieur A. Djeridane, Co-promoteur de ce memoire. Son aide et sa disponibilite ont ete des atouts precieux.

Tout au long de ce travail de longue haleine qui m' a oblige a consulter une bibliographie consequente, Un grand merci au Dr M OUI1VTEN et a M A. SARIDI pour les efforts consentis de leur part.

Mes profondes reconnaissances a l'ensemble des enseignants du departement de biologie, Universite de Laghouat pour m'avoir appris l'autonomie, la debrouille et l' auto-critique.

Une tendre pens& pour mes parents, pour leur patience, leur presence a mes cotes et leur contribution a l'elaboration de ce manuscrit.

Je tiens a remercier mon oncle M BENAROUS Belabbes pour son aide relatif aux plantes medicinales sahariennes et egalement remercier mon oncle M BENAROUS Kamal pour ses conseils appreciables.

Je remercie egalement mon oncle M LAHDEB Mohamed pour ces precieux conseils durant tout mon cycle universitaire et egalement remercier mon oncle M LAHDEB Hadj pour son soutien.

Une pens& amicale aux collegues etudiants et etudiantes du Departement Biologie pour leur soutien et leur aide.

Un grand merci a toutes les personnes qui m'ont soutenu de pres ou de loin au cours de la realisation de ce modeste travail.

Je voudrai remercier Messieurs les membres du jury d'avoir accepte d'evaluer cette

these.

Liste des figures

Figure II. 1. Squelette de base des flavonoIdes. 28

Figure III. 1. Mecanisme reactionnel de la formation du produit. 35

Figure III. 2. Graphe de Michaelis-Menten: V_o en fonction de [S]. 36

Figure III. 3. Graphe de Lineweaver-Burk: 1/Vo en fonction de 1/[S]. 37

Figure III. 4. Mecanisme reactionnel de la formation du produit en presence 38
d'inhibiteur.

Figure III. 5. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 38
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur competitif.

Figure III. 6. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 39
competitivement decrite dans la Figure 111.5.

Figure III. 7. Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. 39

Figure III. 8. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 40
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur incompetitif.

Figure III. 9. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 40
incompetitivement decrite dans la Figure 111.8.

Figure III. 10. Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. 40

Figure III. 11. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 41
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur non competitif.

Figure III. 12. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 41
non competitivement decrite dans la Figure MA 1.

Figure III. 13. Structure de l'alpha amylase. 43

Figure III. 14. Les inhibiteurs : l'acarbose et l'octapeptide de la reaction catalysee par 44
l'amylase.

Figure III. 15. Structure schematique de la trypsine. 46

Figure III. 16. Voies d'activation des proenzymes et du PAR-2 par la trypsine. 48

Figure III. 17. Structure tridimensionnelle de la lipase pancreatique humaine. 49

Figure IV. 1. La poudre de chaque plante apres le broyage. 54

Figure IV. 2. Le lavage par l'hexane de deux extraits des plantes Zewadet Elkhrouf et 55
Gondale.

Figure IV. 3. Les extraits alcooliques bruts. 56

Figure IV. 4. L'acide gallique. 57

Figure IV. 5. Figure IV. 6. Figure IV. 7. Figure IV. 8. Figure IV. 9. Figure V. 1. 1. Figure V. 1. 2. Figure V. 1. 3. Figure V. 1. 4. Figure V. 1. 5.

Figure V. 1. 6.

Figure V. 2. 1. Figure V. 2. 2. Figure V. 2.3. Figure V. 2. 4.

Figure V. 2. 5.

Figure V. 3. 1. Figure V. 3.2. Figure V. 3.3. Figure V. 3.4.

Figure VI. 1.

Figure VI. 2. Figure VI. 3 Figure VI. 4. Figure VI. 5.

La courbe d'etalonnage de l'acide gallique. 57

Le spectrophotometre UV- visible de Shimadzu 1601. 57

La catechine. 59

La courbe d'etalonnage de la catechine. 59

La teneur en composes phenoliques et en flavonokles des plantes. 61

L'action de l'a- amylase sur l'amidon. 65

La courbe d'etalonnage de maltose. 66

La cinetique enzymatique de l'a amylase. 67

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme a- amylase. 67

Representations graphiques 1/V = f ([polyphenols]) de chaque extrait 68
phenolique tel que 1/V (s/ADO). ([S₃]> [S₂]> [S1]).

Le taux d'inhibition de l'a amylase avec deux concentrations 70
d'inhibiteur croissantes (Rd < [I₂]) et une seule concentration de substrat.

L'action de la trypsine sur le BAPNA. 72

La cinetique enzymatique de la trypsine. 73

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme trypsine. 73

Representation graphique 1N = f ([polyphenols]) de Foulia tel que 74
([S_i] < [S₂] < [S₃] < [S₄] < [S₅]).

77

78

78

79

84

85

86

87 88

Le taux d'inhibition de la trypsine avec une concentration fixe de 75
substrat et d'inhibiteur.

L'action de la lipase sur l'huile de maIs.

La cinetique enzymatique de la lipase.

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne lipase. Le taux d'inhibition de la lipase avec trois concentrations d'inhibiteur croissantes ([I_i] < [1₂] < [I₃]) et une seule concentration de substrat.

.

Piegeage des ERO (R) par les flavonokles.

Elements essentiels pour l'activite antioxydante des flavonokles. La reaction entre le DPPH et l'hydroquinone.

Les graphes PI =f (C) de chaque plante.

Classement croissant des plantes selon leur EC50.

Liste des tableaux

Tableau II. 1. Tableau III. 1. Tableau IV. 1. Tableau IV. 2. Tableau IV. 3. Tableau V. 1. 1. Tableau V. 3. 1. Tableau V. 2. 1. Tableau V. 1. 2. Tableau VI. 1.

Les principales classes des composees phenoliques. Classification des enzymes selon la reaction catalysee. La couleur et l'aspect de chaque extrait phenolique. La teneur en phenols totaux des plantes investiguees.

24 42

56 58 60 69 69 75 81 90

La teneur en flavonoIdes et leur pourcentage des plantes investiguees. Le type d'inhibition et la constante d'inhibition de chaque plante.

Le pourcentage d'inhibition de chaque plante. Le pourcentage d'inhibition de chaque plante.

Le pourcentage d'inhibition de chaque plante. Les EC₅₀ de chaque plante.

Table des matieres

Introduction generale 10

Bibliographie 12

Partie bibliographique 13

I. les plantes medicinales 14

1. La phytotherapie 15

1.1. La phytotherapie, une medecine vieille comme le monde 15

1.2. La definition de la phytotherapie 15

1.3. Avantages de la phytotherapie 15

2. Les plantes medicinales 16

2.2. Importance de l'utilisation des plantes medicinales 16

2.3. Fiches monographiques des plantes investiguees 17

Bibliographie 21

II. Les composes phinoliques 22

1. Les composees phenoliques ou les polyphenols 23

2. Classification des composes phenoliques 23

2.1. Les flavonoides 28

2.2. Les proprietes des flavonoides 29

3. Dans une cellule vegetale oil se trouve chaque compose phenolique ? 29

4. Role et interet des polyphenols 30

5. Quelques exemples d'implication industrielle des composes phenoliques 30

5.1. Utilisation des tanins 31

5.2. Importance des composes phenoliques dans la qualite du bois 31

Bibliographie 32

III. Les enzymes 33

1. Historique 34

2. Definition d'un enzyme 34

3. La specificite enzymatique 34

4. La cinetique enzymatique 35

4.1. L'activite enzymatique 35

4.1.1. Reaction catalysee par une enzyme 35

4.1.2. Linearisation de l'equation de Michaelis-Menten 36

4.2. L 'inhibition enzymatique 37

4.2.1. Les inhibiteurs 37

4.2.2. Les types d'inhibition

4.2.2.1. Les inhibiteurs competitifs

4.2.2.2. Inhibition incompetitive 4.2.2.3. Les inhibiteurs non-competitifs

5. Classification des enzymes

6. Les enzymes etudies

6.1. La a amylase

6.1.1. La reaction specifique

6.1. 2. Interet de l'inhibition de l'alpha amylase

6.2. La trypsine

6.2.1. La reaction specifique

6.2.2. Interet de l'inhibition de la trypsine

6.3. La lipase

6.3.1. La reaction specifique

6.3.2. Interet de l'inhibition de la lipase

Bibliographie

La partie experimentale

IV. Extraction et quantification des composies phinoliques

1. Extraction des composes phenoliques

2. Quantification des composees phenoliques

2.1. Dosage des phenols totaux 2.1.1. La courbe d'etalonnage 2.1.2. Traitement des echantillons 2.1.3. Resultats et discussion

2.2. Dosage des flavonoides 2.2.1. La courbe d'etalonnage 2.2.2. Resultats et discussion

3. Conclusion

Bibliographie

V. Effets des extraits phinoliques sur les enzymes

a- Amylase

1. Principe de la methode

2. Procedure experimentale 3. Resultats et discussion

Conclusion

Ttypsine 71

1. Principe de la methode 72

2. Procedure experimentale 72

3. Resultats et discussion 73

4. Conclusion 75

Lipase 76

1. Principe de la methode 77

2. Procedure experimentale 77

3. Resultats et discussion 77

4. Conclusion 80

Bibliographie 81

VI. Evaluation de l'activite antioxydante 82

1. Les radicaux libres 83

1.1. Les differents types des radicaux libres 84

2. L'activite antioxydante et les antioxydants 85

2.1. L'activite antioxydante 85

2.2. Les antioxydants 85

2.2.1. Les antioxydants synthetiques 85

2.2.2. Les antioxydants naturels 86

3. Test de DPPH 86

3.1. Principe de la methode 86

3.2. Procedure experimentale 86

3.3. Resultats et discussion 87

4. Conclusion 90

Bibliographie 91

Conclusion generale 92

Index des noms latins 94

introduction

La medecine alternative ou la phytotherapie est Part de guerir par les plantes, elle est aussi la connaissance et l'utilisation de leurs proprietes therapeutiques (Philippe Sionneau, 2006). La phytotherapie suscite actuellement un renouveau d'intere^st, son efficacite est prouvee et elle est toujours vue comme un remede surtout utilise par la population rurale a travers le monde.

Les plantes medicinales sont douees de cette efficacite a cause de ses metabolites secondaires ou ses principes actifs : les composes phenoliques, les alcalokles, les huiles essentielles... Notre pays est riche de ce type des plantes qui sont utilisees en medecine traditionnelle.

Les composes phenoliques ont un effet inhibiteur sur les enzymes (M. Yousfi et al, 2006) et ils sont connus par son pouvoir antioxydant ((M. Yousfi et al, 2007), ce qui prouve leur utilisation therapeutique.

Les enzymes qui seront etudiees dans ce travail sont : l'a- amylase qui degrade les polymeres glycosidiques ce qui cause l'augmentation du taux de glucose chez les diabetiques (Myo-Jeong Kim et al, 1999), la trypsine qui coupe les liaisons peptidiques specifiques ce qui active d'autres enzymes dans le pancreas peuvent étre responsables de la pancreatite (D. Page et al, 2000) et la lipase qui degrade les triglycerides en acides gras ce qui permet leur stockage dans le tissu adipeux causant l'obesite (May Faraj et al, 2004).

Les plantes sahariennes utilisees dans cette recherche sont recoltees de la region de Laghouat, elles sont de diverses familles botaniques douees de differentes caracteristiques, apres la connaissance et l'identification de ces sept plantes, nous avons cherche si les extraits phenoliques des plantes possedent le pouvoir inhibiteur de ces enzymes ou non.

Dans ce travail, on commence par quelques connaissances bibliographiques concernant la phytotherapie et les plantes etudiees, dans un deuxieme chapitre on s'interesse aux metabolites secondaires « les composes phenoliques », dans le dernier chapitre nous avons evoque les enzymes etudies et Pinter& de leur inhibition.

L'objectif principal de ce travail est d'evaluer l'effet inhibiteur des extraits des plantes en faible concentration sur l'activite des trois enzymes cites ci-dessus et d'utiliser ces plantes comme une cure de certaines maladies.

Bibliographie

· D. Page, L. Quillien, and G. Duc, 2000, Trypsin inhibitory activity measurement:
simplifications used for pea seed, published in Crop Sci. Volume 40, pp 1482-1485.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, S. Maamri, F. Djireb, P. Stocker, December 2006, Phenolic extracts from various Algerian plants as strong inhibitors of porcine liver carboxylesterase, J Enzyme Inhib Med Chem, Volume 21, No 6, pp 719-726.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, N. Vidal, JF. Lesgards and P. Stocker, April 2007, Screening of some Algerian medicinal plants for the phenolic compounds and their antioxidant activity, J European Food Research and Technology, Volume 224, No 6, pp 801-809.

· May Faraj, Allan D. Sniderman, and Katherine Cianflone, April 2004, ASP enhances in situ lipoprotein lipase activity by increasing fatty acid trapping in adipocytes, Journal of Lipid Research, Volume 45, 657-666.

· Myo-Jeong Kim, Soo-Bok Lee, Hee-Seob Lee, Su-Yong Lee, Jin-Sook Baek, Doman Kim, Tae-Wha Moon, John F. Robyt, and Kwan-Hwa Park, 1999, Comparative Study of the Inhibition of a-Glucosidase, a-Amylase and Cyclomaltodextrin Glucanosyltransferase by Acarbose, Isoacarbose, and Acarviosine#177;Glucose, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume. 371, No. 2, pp. 277-283.

· Philippe Sionneau, 2006, La phytotherapie chinoise moderne, p500.

Var6e

06(ioirapkque

.&so plantes

Macinaies

1. La phytotherapie

La phytotherapie, c'est l'emploi de medicaments vegetaux pour soigner les differents maux dont vous pouvez étre victime.

A travers les siecles, les hommes ont su developper la connaissance des plantes et de leurs proprietes therapeutiques.

Aujourd'hui, l'efficacite prouvee et les bienfaits incontestables de la phytotherapie pour notre sante lui ont permis d'entrer dans nos vies de tous les jours (Gildo Pastor, 2006). 1.1. La phytotherapie, une medecine vieille comme le monde

Les fruits, les racines, les plantes et autres substances naturelles ont toujours ete connues pour leurs proprietes nutritives, mais aussi pour leurs vertus curatives.

Le premier texte ecrit sur la medecine par les plantes est grave sur des tablettes en argile en caractere cuneifonne et date de la civilisation sumerierme, 3000 ans avant Jesus-Christ. Durant des milliers d'armees, la phytotherapie a constitue la principale source de remedes contre de nombreuses maladies (Larousse Encyclopedie MEMO, 1999).

1.2. Avantages de la phytotherapie

L'ethnobotanique est une discipline scientifique dont le but est de mieux cormaitre les pharniacopees traditionnelles utilisees dans certaines regions. L'inventaire partiel etabli dans divers pays par l'organisation mondiale de la sante repertorie environ 20 000 plantes medicinales. Parmi les 250 000 especes de plantes que compte actuellement notre planete, moms de 10% ont fait l'objet d'analyses chimiques fines pour detecter d'eventuels principes actifs. Une etude plus systematique des plantes medicinales pourrait se traduire par la decouverte de nouveaux medicaments utilisables.

Tous les organes d'une plante medicinale ne sont pas forcement actifs ; suivant les especes, on utilise les fleurs, les feuilles, les fruits, les tiges, les ecorces ou les racines. L'epoque et le moment de la cueillette ont une grande influence sur l'activite therapeutique, car les phenomenes biochimiques qui ont lieu dans les cellules vegetales dependent de la photosynthese et de phenomenes hormonaux qui dependent du rythme solaire.

Les substances contenues dans les plantes sont de nature chimique variee ; certaines sont solubles dans l'eau, d'autres dans l'alcool ethylique, d'autres encore dans l'huile. A partir des plantes medicinales, on peut obtenir differentes preparations : infusions, decoction, maceration dans l'alcool (teinture) ou dans l'huile (extraction huileuse, plus rare), etc. Les plantes peuvent aussi étre consommees entieres, fraiches ou seches, reduites en debris plus ou moms fins, eventuellement conditiormees en gelules. Les seves et secretions sont egalement utilisees dans certains cas. Il est enfm possible d'en extraire chimiquement des principes actifs en vue de leur utilisation therapeutique.

Certaines plantes sont inoffensives, mais d'autres, tits nombreuses (digitale, belladone, colchique, etc.), sont toxiques et ne sont utilisees que sous des formes bien contrOlees, exclusivement commercialisees en pharmacie. L'emploi inconsidere de plantes cueilles dans la nature peut aboutir a des intoxications graves, voir mortelles (Larousse Encyclopedie MEMO, 1999).

2. Les plantes medicinales

En botanique et en pharmacie, les plantes medicinales sont reconnues pour offrir, par leur administration, un effet bienfaisant et therapeutique sur l'organisme. Employees depuis la plus haute antiquite, souvent en relation avec des pratiques magiques, leurs proprietes reelles ont, a toute époque, ete exagerees, ou niees, ou deformees selon les croyances en vigueur. A l'epoque moderne, les progits de la biochimie et de l'analyse organique, ainsi que ceux de la physiologie vegetale, ont permis de commencer un tri scientifique dans la masse des actions attribuees aux simples, detruisant certaines legendes, mais etablissant solidement certains usages empiriques anciens. Il est assure que, pour obtenir des resultats utiles, it convient de se documenter au moyen d'ouvrages serieux en vue de l'identification botanique des plantes choisies et de la verification de leurs proprietes : certaines espêces ont des actions parfois differentes, et méme contraires de celles qui leur avaient ete attribuees traditionnellement. Méme pour les plantes medicinales qui repondent bien a leur renommee, le choix des varietes, celui du terrain sur lequel elles poussent, de la saison ou de l'heure du jour oil on les cueille, sont des facteurs tits importants, pouvant modifier jusqu'a 100 p. 100 la teneur en principes actifs physiologiquement (Universalis, 2006).

2.1. Importance de l'utilisation des plantes medicinales

Il est acquit que les plantes medicinales sont en mesure de soigner des maladies simples comme le rhume, ou d'en prevenir de plus importantes comme l'ulcêre, la migraine, l'infarctus en plus de certaines allergies ou affections. Si l'on y ajoute leurs vertus reparatrices, tonifiantes, sedatives, revitalisantes ou immunologiques, on mesure mieux l'aide precieuse qu'elles sont susceptibles de nous apporter au quotidien (Anonyme, 2005).

Chapitre I: les plantes medicinales





2.2. Fiches monographiques des plantes investiguees Atractylis serratuloides

Nom vernaculaire : Serr, j^mall

Famille : Compositae (Asteraceae)

Descriptions Botaniques :

Plante vivace a tiges epaisses dressees de 20 a 30 cm de haut, tres ramifiees a toutes les hauteurs, a rameaux tres feuilles.

Feuilles tres epineuses a epines jaune fonce, les fleurs Carminees.

Habitat : Pfitures semi arides, hauts plateaux, Regs caillouteux et les hamadas.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : partie aerienne (feuilles, fleurs, tiges). Mode d'emploi : Extraction des racines un latex "Loubene".

Intere^st pastoral: C'est une plante broutee par les dromadaires (Dr A. Chehma, 2006).

Astragalus armatus

Nom commun : Astragale,

Nom vernaculaire : Gondale, JI
·l

Famille : Legumineuse

Descriptions Botaniques :

Arbrisseau tres dense a rameaux dresses de taille 50 cm a 1 metre, les feuilles fraiches bien vertes avec de nombreuses petites folioles, les fleurs blanches sont nombreuses.

Habitat : la zone predesertique du Sahara septentrional. Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : racines.

Mode d'emploi : broutee par les dromadaires (Dr A. Chehma, 2006).

Astragalus vogelii fatimensis





Nom vernaculaire : Foulia, ;¹³...9ⁱ

Famille : Fabaceae.

Descriptions Botaniques :

est une plante herbacee, feuilles pennees a folioles ovales. Nombreuses petites fleurs jaunes portees sur une hampe florale. Gousses courtes, globuleuses, en forme de grain de ble et recouvertes de longs poils, la feuille est composee renfermant entre 3 et 8 folioles et terminee par une vrille ramifiee (Sahara-nature).

Habitat : Sahara central et occidental.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : partie aerienne.

Mode d'emploi : alimentation des animaux.

Haloxylon scoparium

Nom vernaculaire : Remth, eLAJ1

Famille : Chenopodiacees

Descriptions Botaniques :

Ce petit buisson dense et sombre, est tres frequent sur les regs a sols gypseux, ses fleurs sont discretes mais a la fin de l'automne, l'extremite de ses rameaux se couvre de fruits.

Habitat : Pfitures semi arides, hauts plateaux.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriennes (fleurs).

Mode d'emploi :

Phannacopee: Ses rameaux, ses feuilles et ses fleurs (en decoction, en maceration, en cataplasme), sont utilises pour les traitements des indigestions, des piqines de scorpion et des dermatoses (Dr A. Chehma, 2006).

Helianthemum lippii, Helianthemum ellipticum





Nom vernaculaire : Reguig, cliki31

Famille : Cistaceae

Descriptions Botaniques :

Arbrisseau vivace de taille 30 a 40 cm, tres rameux a feuilles sessiles couvertes de tres courts poils ce qui donne une couleur blanchfitre a la plante. L'ecorce des rameaux est egalement blanchfitre. Petites fleurs jaunes sessiles a cinq petales en grappes peu fowl-lies.

Habitat : Dans tout le Sahara.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriermes.

Mode d'emploi :

Phannacopee: en poudre ou en compresse, pour les traitements des lesions cutanees.

Intere^st pastoral: Elle tres appreciee par les dromadaires et les chevres (Dr A. Chehma, 2006).

Plantago ciliata

Nom vernaculaire : Lelma, U.1

Famille : Plantaginaceae

Descriptions Botaniques :

Plante herbacee annuelle de petite taille 10 a 15 cm de haut a tige tres courte, les feuilles naissent a la base de la plante, sont lanceolees etroites velues.

Fleurs petites et verddtres en epis globuleux.

Habitat : sur les sols sableux et gravillonnaires, dans les depressions et lits d'oued (Dr A. Chehma, 2006) Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriermes (fleurs).

Mode d'emploi : Elle est utilisee comme cicatrisante des blessures et pour les traitements des inflammations de la gorge et des ulceres (Dr A. Chehma, 2006).

If loga spicata



Nom vernaculaire : Zwadet Elkhrouf, 1-4)&31 U..1) Famille : Compositae (asteraceae)

Descriptions Botaniques :

Petite plante de taille 3 a 10 cm, a tige centrale dressee, emettant de nombreux rameaux couches puis releves. On rencontre plus frequemment la plante sous son aspect sec que vert.

Les rameaux sont couverts de feuilles etroites obtuses couvertes de poils appliqués. Les tres nombreux capitules floraux sont disposes en Mice tres sen-ee ce qui donne a la plante un aspect de boudin (Sahara-nature).

Les fleurs discrêtes blanc-jaunatre sont entourees de bractees devenant jaune pale brillant en sechant. Habitat : Espêce saharo-arabique, commune dans tout le Sahara, dans les sols pierreux (Dr A. Chehma, 2006). Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriennes.

Phannacopee: Ecrasee, elle est utilisee pour le traitement des lesions cutanees.

Inter& pastoral: Elle est broutee par les dromadaires.

Chapitre I: les plantes medicinales

Bibliographie

· Anonyme, 2005, Ministêre de l'Agriculture Et du Developpement Rural, Unite De Conservation et de Developpement - Batna.

· Dr Abdelmajid Chehma, juin 2006, catalogue des plantes spontanees du Sahara septentrional algerien, edition Dar Elhouda, AM mlila, p 22, 32, 66, 73, 81, 104.

· Gildo Pastor, septembre 2006, Précis de phytotherapie, edition Alpen, p 3,4.

· Larousse Encyclopedie MEMO, 1999, l^e" edition Montreal (Quebec), p182.

· Les photos des plantes sont clichees par M. M. Benarous en mai 2007 de la localite

de AM Madhi, Laghouat.

· Les plantes sahariennes sont identifiees par M A. DJERIDANE et confirme par Dr M OUINTEN et M A. SARIDI.

· Universalis Encyclopedia (CD), 2006.

· www.sahara-nature.com.

Chapitre II: les composes phenoliques

Une des originalites majeures des vegetaux reside dans leur capacite a reproduire des substances naturelles tres diversifiees. En effet, a cote des metabolites primaires classiques (glucides, protides, lipides, acides nucleiques), ils accumulent frequemment des metabolites dits « secondaires » dont la fonction physiologique n'est pas toujours evidente mais qui represente une source importante de molecules utilisables par l'homme dans des domaines aussi differents que la pharmacologie ou l'agroalimentaire. Les metabolites secondaires appartiennent a des groupes chimiques varies (alcalokles, temenes, composes phenoliques...) qui sont tres inegalement repartis chez les vegetaux mais dont le niveau d'accumulation peut quelquefois atteindre des valeurs elevees. La notion de « metabolite secondaire » resultait initialement de trois groupes d'observations : d'abord une difficulte a attribuer a ces metabolites une fonction precise dans la physiologie méme de la plante, ensuite une repartition tres inegale selon les vegetaux, quelquefois entre des especes ou varietes a l'interieur d'une méme espece, enfm une certain « inertie biochimique » car ces substances sont rarement remobilisees dans la plante apres qu'elles y ont ete accumulees (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

1. Les composees phenoliques ou les polyphenols

Le terme volyphenols» est frequemment utilise dans le langage courant et méme dans des articles scientifiques ou de vulgarisation pour designer l'ensemble des composes phenoliques des vegetaux. En fait, it devrait étre reserve aux seules molecules presentant plusieurs fonctions phenols. Ce qui exclurait alors les monophenols, pourtant abondants et importants chez les vegetaux. Donc la designation generale «composes phenoliques» concerne a la fois les mono-. di- et polyphenols dont les molecules contiennent respectivement une, deux ou plusieurs fonctions phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

2. Classification des composes phenoliques

Plusieurs milliers de composes phenoliques ont ete caracterises jusqu'a aujourd'hui chez les vegetaux. Bien qu'etant tres diversifies, ils ont tous en commun la presence d'un ou de plusieurs cycles benzeniques portant une ou plusieurs fonctions hydroxyles.

Les composes phenoliques peuvent étre regroupes en de nombreuses classes (Tableau II. 1) qui se differencient d'abord par la complexite du squelette de base (allant d'un simple C6 a des formes tres polymerisees) ensuite par le degre de modifications de ce squelette (degre d'oxydation, d' hydroxylation, de methylation...), enfin par les liaisons possibl es de ces molecules de bases avec d'autres molecules (glucides, lipides, proteins, autres metabolites secondaires pouvant étre ou non des composes phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

Tableau IL1 : Les principales classes de composees phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005)

Les composes phenoliques

Classe

Sous classe

Structure chimique

Caracteristique

Exemple

Les formes simples

Acides hydroxybenzoIques

(p-hydroxybenzoIque. Protocatechique Vanillique, gallique. Syringique, salicylique, gentisique

' OH ·

sont representes chez les gymnospermes et les angiospermes. existent sous forme d'esters.

* epices * fraise

Acides hydroxycinnamiques

Acide cinnamique Acide p-coumarique Acide cafeique Acide ferulique

COOH OH ^le^i ^R3

* souvent lies a d'autres molecules organiques. * existent sous forme d'esters.

* * grains de (pomme, fruits pomme de terre)

Flavonokles

Chalcones

0 ^(S^IIP

* antibacterien * antifongique

divers

Flavanones

' H1

* antioxydant * anti-inflammatoire * anti radicalaire

Agrumes : orange, citron, pamplemousse

Flavonols

CI I-1 ^MS ^111^11 CI H CI I-I

* anti-inflammatoire * anti- allergique

* fruits * legumes * fleurs

Les composes phenoliques

Classe

Sous classe

Structure chimique

Caracteristique

Exemple

Les formes simples

Flavonokles

Flavones

H C

^PO^D ^all^ii _ · H ^1

* anti-inflammatoire * anti- cancer

* celeri, persil * la peau des fruits

Anthocyanidines

-^--1H 1H

0 H

* responsable de la couleur des plantes. * responsable de l'astringence des fruits.

* Aubergine * Cerise * Fraise * Rhubarbe * Choux rouge

Isoflavones

^R3c

-r^-8Ra 1 2^'-'';., _._.4_

* anti cancer * Phytoestrogênes

* haricots de soja * produits de soja

Autres particuliers

Oleuropeine

o cii--L^o II H3C0- C

OH o_cii--oil . OF -- CI+ Cli 0- Glucose

* antioxydantes * antibacteriermes * antivirales.

* olive

vanilline

CHO ^1.^1 OH

OCH 3

* aromatisant

* graines de vanille

Les composes phenoliques

Classe

Sous classe

Structure chimique

Caracteristique

Exemple

Les formes

Tanins

condense

. _ · 1111_,. 110 OH 4111 = 4111111^1 ., 0 ;-i 02-E MS" ^-=41^1-_ IIIII - -

* anti parasitaire (gastro- intestinale chez les animaux). * capable de se Her avec les proteins animales.

* Raisin rouge prune * fraise * the * paume

'H OH OH · ·H OH--. OH '^H OH · H C.^,' 0 1 OH . i OH OH OH O OH OH

* anti parasitaire (gastro- intestinale chez les animaux). * capable de se her avec les prproteinsanimales.

* chén * Chdtaignier * dicotyledon

Polymerisation de 3 sous unites d'alcool : * p-coumarylique * coniferylique * sinapylique

uu HO oqd--E) 110H OM. 10^1 04 HO OH no HO · ^0MO MeO CH4 CM. 99

* hydrophobes * lignification des tissus vegetaux. * role de soutien de la plante.

* boil * noyaux des fruits angiospermes gymnospermes

Les composes phenoliques	Classe	Structure chimique	Caracteristique		Exemple	Les formes bees a des macromolecules non phenoliques
Liees a des glucides	OH OH R CH 2 OH It OH lb OCH 3 OCH OH W 0 o i OH CH 2 OH	* la reticulation de la paroi cellulaire	* la pulpe de la betterave
		* lipophile * defense de la plante contre les attaques biologiques.	* tubercule de pomme de terre * pin * chéne

Parmi les composes phenoliques les flavonokles occupent une large classe.

2.1. Les flavondides

L'ensemble des flavonokles, de structure generale en C15 (C6-C3-C6), comprend a lui seul plusieurs milliers de molecules regroupees en plus de dix classes dont certaines ont une tres grande importance biologique et technologique: les anthocyanes, pigments rouges ou bleus, les flavones et les flavonols, de couleur creme ou jaune clair, les flavanes dont les produits de condensation sont a l'origine d'un groupe important de tannins et les isoflavones qui jouent un role dans la sante humaine.



Figure ILL Squelette de base des flavonokles (Abdelghafour MARFAK, 2003).

C'est d'abord la structure de l'heterocycle central et son degre d'oxydation (Figure II.1) qui pennettent de distinguer les differentes classes de flavonokles. Le cas extreme d'oxydation (le l'heterocycle central correspond aux anthocyanidines, toujours presentes en milieu acide sous forme d'un cation de couleur rouge, dit cation flavylium. Au contraire, dans le cas des flavanes (flavane-3-ols comme la catechine; flavane-3,4-diols (quelques fois denommes leucoanthocyanes car ils peuvent dormer des anthocyanes rouges sous l'action d'un acide), le cycle central est tres fortement reduit. On trouve des situations intennediaires chez les flavanones, les flavones, les flavonols et d'autres groupes. Exceptionnellement, le noyau central de la molecule peut ne pas étre totalement cyclise (chez les chalcones et molecules voisines) ou se presenter sous forme d'un cycle ne presentant que 5 sommets (cas des aurones, de couleur generalement jaune vif).

A l'interieur de chacune des classes, les variations autour du squelette chimique de base en C15 portent principalement sur trois points:

- Le degre d'hydroxylation : des differents cycles: ainsi, le cycle B est mono-hydroxyls chez le kaempferol ou la pelargonidine, di-hydroxyls chez la quercetine ou la cyanidine, trihydroxyle chez la myricetine ou la delphinidine. Il en resulte des differences de spectre d'absorption donc de couleur chez les anthocyanidines et les autres pigments.

- Le niveau de methoxylation : (groupements O-CH₃ a la place des seules fonctions phenoliques) : La methoxylation diminue l'hydrosolubilite des molecules qui, dans des cas extremes, sont alors presentes dans les exsudats de certains bourgeons (peuplier) ou liees a des structures lipidiques comme les cires de feuilles d'eucalyptus.

- Le niveau de glycosylation : en dehors de quelques exceptions (d'une part le groupe des flavanes et d'autre part quelques flavonokles excretes dans les exsudats) les flavonokles des vegetaux sont presque tous lies a des sucres. A ce titre, ils appartiennent au grand groupe des heterosides, la partie phenolique representant ici l'aglycone. Il en resulte une complication dans la nomenclature que nous expliciterons seulement dans le cas des anthocyanes. Ainsi, alors que le terme « anthocyanes » a une valeur generale (designant soit les formes naturelles glycosylees soit la molecule non glycosylee), la partie phenolique seule est designee sous le nom d' anthocyanidines (par exemple la pelargonidine ou la malvidine), alors que l'heteroside (molecule phenolique + sucre associe) prend celui d' « anthocyanine » (la pelargonine ou la malvine). Des regles semblables ou voisines sont adoptees pour les autres flavonokles (par exemple la quercetine designant l'aglycone alors que la quercitrine correspond a ce méme aglycone lie au rhamnose (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

2.2. Les proprietes des flavondides

Une des proprietes majeures des flavonokles est de contribuer a la couleur des plantes et notamment a celle des fleurs. Or, c'est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une &ape fondamentale de sa reproduction. On peut egalement noter que les flavonokles, en repoussant certains insectes par leur gout desagreable, peuvent jouer un role dans la protection des plantes.

Par ailleurs, les flavonokles presentent un intere^st therapeutique qui date de la decouverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l'Universite de Szeged (Hongrie), qui a constate que les symptOmes hemorragiques du scorbut, lies a la fragilite ou l'hyperpermeabilite des vaisseaux, etaient gueris par des extraits de paprika ou de jus de citron, riches en vitamine C et flavonokles. Cette action a ete appelee proprietes vitaminique P (P etant la premiere lettre du mot permeabilite).

3. Dans une cellule vegetale oft se trouve chaque compose phenolique ?

Une des caracteristiques des composes phenoliques, qu'ils partagent generalement avec l'ensemble des metabolites secondaires, est de montrer une repartition tress inegale chez les differentes especes vegetales et, pour une méme espece, selon la variete et le stade de developpement physiologique ; les variations sont egalement considerables selon la nature des tissus et des cellules composant le vegetal.

Les variations chimiques rapportees precedemment ont comme consequence de modifier profondement la solubilite des molecules dans l'eau et d'entrainer des modifications significatives de leur repartition dans la cellule vegetale. On observe ainsi une

compartimentation nette des composes phenoliques avec deux localisations principales bien distinctes:

- D'une part, la vacuole oil sont presents tous les composes ayant un caractere hydrophile plus ou moins marque. Ils correspondent a la plupart des formes simples decrites precedemment et a certaines formes polymerisees comme les tannins. Il faut rappeler que la glycosylation tres frequente des molecules phenoliques augmente considerablement hydrosolubilite.

- D'autre part, la paroi oil sont retrouvees la lignine et les differentes formes liees aux structures lipidiques, Dans les tissus oil la plupart des cellules sont mortes (le bois par exemple), les composes phenoliques, et en particulier les flavonokles, se retrouvent alors adsorbes sur les structures parietales. Par ailleurs, certains flavonokles simples a caractere apolaire (par exemple des formes tres methylees de flavonokles) peuvent egalement étre presents dans des exsudats a la surface de bourgeons ou de feuilles (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

4. Role et interet des polyphenols

Le role des composes phenoliques est maintenant reconnu dans differents aspects de la vie de la plante et dans l'utilisation que fait l'homme des vegetaux. Ils peuvent en effet intervenir:

· dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification. regulation de la croissance, interactions moleculaires avec certains microorganismes symbiotiques ou parasites...).

· dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique (relations avec les bacteries, les champignons, les insectes, resistance aux UV), soit directement dans la nature soit lors de la conservation apres recolte de certains vegetaux.

· dans les criteres de qualite (couleur, astringence, amertume, qualites nutritionnelles...) qui orientent les choix de l'homme dans sa consommation des organes vegetaux (fruits, legumes, tubercules...) et des produits qui en derivent par transformation.

· dans les variations de certaines caracteristiques des vegetaux lors des traitements technologiques (preparation des jus de fruits, des boissons fermentees...) pendant lesquels apparaissent frequemment des brunissements enzymatiques qui modifient la qualite du produit fini.

· dans la protection de l'homme vis-à-vis de certaines maladies en raison de leur interaction possible avec de nombreuses enzymes et de leurs proprietes antioxydantes (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

5. Quelques exemples d'implication industrielle des composes phenoliques

Comme cela vient d'être largement developpe dans les paragraphes precedents, les multiples proprietes chimiques ou biologiques des composes phenoliques donnent a ces molecules et aux plantes qui les contiennent un intere^st economique certain qui est pris en compte par les

industries agro-alimentaires et pharmaceutiques. En outre, dans certains cas egalement três importants d'un point de vue economique, les phenols naturels participent directement au developpement d'activites industrielles dont certaines bien que três anciennes, beneficient des progrês scientifiques et technologiques et de notre meilleure connaissance des proprietes chimiques de ces composes. Nous retiendrons ici deux exemples particuliêrement importants. 5.1. Utilisation des tanins

La fabrication du cuir par tannage des peaux des animaux est une activite humaine traditionnelle, déjà mise en oeuvre it y a plusieurs millenaires dans le bassin mediterraneen. Elle a utilise pendant longtemps des extraits vegetaux riches en tannins: ecorces et bois de differents arbres ou arbustes (chéne, chataignier, eucalyptus, acacia. Quebracho, etc.), fruits de myrobolan ou de differentes Cesalpiniees, feuilles de sumac, galles causees par les attaques d'insectes sur les chénes ou le pistachier... Les tannins d'origine vegetale ont cependant ete progressivement supplantes, au cours du XX^e si&le, par des «tannins» mineraux (en particulier les sels de chrome) et ne sont plus utilises que pour la fabrication de cuirs particuliers d'articles de luxe ou d'orthopedie.

Les proprietes tannantes des tannins (qu'il s'agisse de tannins hydrolysables ou de tannins condenses) sont dues a leur capacite a former des liaisons entre les fibrilles de collagêne du tissu animal, conduisant alors a un ensemble peu accessible a l'eau et en partie protégé de l'action des bacteries. Les mecanismes chimiques du tannage correspondent a une complexation irreversible des tannins avec les proteins animales.

5.2. Importance des composes phenoliques dans la qualite du bois

Une des applications directes des proprietes de la lignine reside dans l'utilisation du bois pour les constructions humaines. En effet, ce materiau presente a la fois une grande resistance mecanique et un caractêre isolant marque vis-à-vis des variations de temperature et d'humidite. Il est ainsi couramment utilise pour la realisation des charpentes, des parquets, des fermetures (portes, volets, fenétres) et des meubles. Par ailleurs, la haute valeur calorifique du bois, exploit& traditionnellement depuis que l'homme a appris a maitriser le feu, est due pour une part importante a la presence de la lignine. Ce compose a en effet une haute teneur en carbone et se revêle plus energetique que les autres constituants du bois, cellulose et hemicelluloses, et une teneur en lignine plus elevee est associee a une chaleur de combustion plus importante.

En plus de la rigidite qu'apporte la presence de lignine, deux proprietes complementaires du bois sont associees a la presence de composes phenoliques: d'une part sa durabilite et d'autre part sa couleur (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

Bibliographie

· Abdelghafour MARFAK, Le 12 Decembre 2003, Radiolyse gamma des flavonokles, etude de leur reactivite avec les radicaux issus des alcools : formation de depsides, p 220. (These de Doctorat), l'Universite de Limoges, Ecole Doctorale Sciences Biologie Sante, Faculte de Pharmacie.

· Borivoj Klejdus, Radka Mikelova , Jitka Petrlova ,David Potesil, Vojtech Adam, Marie Stiborovaa , Petr Hodek, Jan Vacek, Rene Kizek, and Vlastimil Kuban, 06/24/2005, Evaluation of Isoflavone Aglycon and Glycoside Distribution in Soy Plants and Soybeans by Fast Column High-Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode-Array Detector, journal of agricultural and food chemistry, Volume 53, pp 5848-5852

· Jean-Jacques Macheix Annie Fleuriet Christian Jay-Allemand, 2005, les composes phenoliques des vegetaux, un exemple de metabolites secondaires d'importance economique, presses polytechniques et universitaires romandes, p 1, p 67, p viii, p 162.

Les enzymes

Historique

Les premieres demonstrations d'une activite enzymatique dans des extraits naturels remontent au XVII' siecle, quand Reaumur d'abord et Spallanzani ensuite montrent que le suc gastrique des oiseaux est implique dans la digestion de la viande. La mise en evidence de l'activite d'autres « enzymes » se poursuit au XIX' siecle. En 1833, Payen et Persoz isolent a partir du malt une substance qui est responsable de la fermentation et qu'ils nomment diastase. Ce terme sera par la suite utilise pour designer de maniere generale toutes substances responsables de fermentation. Plus tard, le suffixe -ase a ete conserve pour designer la macromolecule responsable d'une activite enzymatique. Par exemple. L'amylase est un enzyme responsable de la degradation de l'amidon. En 1836, alors qu'il etudie les processus digestifs, Schwann isole la pepsine, une substance responsable de la digestion dans l'estomac et le premier enzyme obtenu a partir d'un tissu animal (Athel cornish-bowden et al, 2005).

Definition d'un enzyme

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un role central dans le monde vivant. Les reactions essentielles pour le fonctionnement d'un étre vivant sont trop lentes et sans lu presence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la connaissons aujourd'hui ne serait pas possible. Qu'il s'agisse de reactions simples comme la formation de bicarbonate a partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de reactions complexes comme la replication de l'ADN, chaque reaction chimique se deroulant au sein d'un étre vivant est catalysee par un ou plusieurs enzymes specifiques. Les enzymes sont des macromolecules, des proteins ou des ARN (les ARN catalytiques sont plus correctement denommes ribozymes), qui reconnaissent specifiquement certaines molecules et accelerent les reactions de transformation de ces molecules suffisamment pour que leur vitesse devienne compatible avec le fonctionnement de l'organisme. Un second role essentiel joue par les enzymes est d'assurer le couplage physique entre reactions endergoniques et reactions exergoniques et de permettre ainsi de maintenir les systemes biologiques dans des etats hors d'equilibre, egalement indispensables pour le maintien de la vie (Athel cornish-bowden et al, 2005).

3. La specificite enzymatique

Le probleme de la specificite de l'enzyme pour son substrat est au centre de l'enzymologie. C'est en effet la particularite la plus fondamentale et la plus remarquable de cette catalyse. Les enzymes sont etroitement specifiques d'une reaction chimique donne, realisee sur un type de substrat demi. La configuration spatiale du substrat est donc en quelque sorte reconnue par l'enzyme ; Ce fait est particulierement bien mis en evidence par la specificite d'action vis-à-vis des isomeres optiques. Tres generalement, les enzymes sont capables de metaboliser l'un et non pas l'autre. Une hypothese simple regroupe ces dormees : le site

reactionnel d'une enzyme possede, au moires formellement, une conformation spatiale complementaire de celle du substrat.

Le site catalytique

La fonction des enzymes est liee a la presence dans leur structure d'un site particulier appele le site actif qui a la forme d'une cavite ou d'un sillon. Les molecules sur lesquelles agit une enzyme sont definies comme les substrata de la reaction enzymatique. Chaque enzyme « recormait » specifiquement une ou plusieurs molecules de substrat selon un principe de complementarite de type cle-sen-ure, d'apres le modele statique de Fischer, grace a des sites de reconnaissance et de fixation situes a sa surface.

Le site actif est constitue d'un petit nombre d'acides amines qui le plus souvent ne sont pas contigus dans l'enchainement de la chain polypeptidique. Ces acides amines sont caracterises par une chain laterale dont a la fois la nature chimique (groupement ionisable ou polarisable) et la structure (encombrement sterique) sont particulieres (Anonyme, 2003).

4. La cinetique enzymatique

4.1. L' activite enzymatique

4.1.1. Reaction catalysee par une enzyme (Bernard Offmann, 2003)

Il y a au moires trois reactions simples:

1. Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)

2. Transformation du substrat lie (ES) en produit lie (EP)

3. Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)

k_i k₂ k₃

+s .₄,¹ ES ...₀"- 7P ...₀"- ' + P

k_d k_₂ k_₃

Figure III.1 : Mecanisme reactionnel de la formation du produit.

Leonor Michaelis et Maud Menten ont deduit de ce modele en 1913 une equation qui predit la vitesse initiale (de formation de P) en fonction de la concentration du substrat:

Equation de Michaelis-Menten

Vo = ^Vmax
^· [ S ]

[ S ] + Km

Tel que K_M est la constante de Michaelis- Menten, et V_max est la vitesse maximale de la reaction enzymatique.

Dont sa representation graphique est port& dans la figure. 111.2.

6 5 4 3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure 111.2. Graphe de Michaelis-Menten: vo en fonction de [S]

4.1.2. Linearisation de l'equation de Michaelis-Menten

Il est difficile de placer correctement a la main une hyperbole dans un graphe. On se trompe tres facilement sur la hauteur de V_max. Pour simplifier revaluation des resultats, on utilise une transformation de l'hyperbole en droite. La plus connue est la transformation en doublereciproque de Lineweaver et Burk :

1 / Vo = 1 / V_max + (KM / V_max)
· 1 / [S]

Cette equation represente une droite de pente K_M / V_max

L'intersection sur l'axe vertical est 1 / V_max et sur l'axe horizontal 1 / K_M.

11 v ₀ = ^{1 1 v}max + ^(KM ^{1 v}max ). ^{1 1} [ ^s ]



0 I 2 3 4 5

Figure III. 3. Graphe de Lineweaver-Burk: 1/Vo en fonction de 1/[S].

Cette representation permet d'estimer les constantes a l'aide de papier millimetre et d'une regle. Elle a cependant le defaut de dormer trop de poids aux valeurs experimentales les plus imprecises, celles des plus petites concentrations de substrat.

4.2. L'inhibition enzymatique

4.2.1. Les inhibiteurs

De nombreuses substances modifient l'activite enzymatique en se combinant a elle, ce qui altere la liaison de substrat et/ou son turnover. Les substances qui diminuent l'activite enzymatique de la sorte sont appelees des inhibiteurs.

Beaucoup d'inhibiteurs sont des molecules de structure voisine du substrat de leur enzyme, mais qui soft ne reagissent pas, soient elles reagissent tres lentement. De telle substance sont frequemment utilisees pour elucider la nature chimique ou conformationnelle d'un site de liaison du substrat, afin de determiner le mecanisme catalytique de l'enzyme. De plus, beaucoup d'inhibiteurs d'enzymes sont des agents chimiotherapeutiques efficaces car un analogue de substrat "non naturel" peut bloquer l'action d'un enzyme. Par exemple, le methotrexate (appele aussi l'aminopterine) ressemble chimiquement au dihydrofolate. Le methotrexate se lie fortement a la dihydrofolate reductase, ce qui l'empéche d'assurer sa fonction physiologique, la reduction du dihydrofolate en tetrahydrofolate.

Les inhibiteurs d'enzyme peuvent agir selon des mecanismes varies. Dans cette section, nous allons etudier plusieurs de ces mecanismes parmi les plus simples, et leurs influences sur le comportement cinetique des enzymes qui suivent le modele de Michaelis-Menten (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

4.2.2. Les types d'inhibition :

4.2.2.1. Les inhibiteurs competitifs

Ils se lient de maniere reversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'acces au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]). En general ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme inhibiteurs competitifs reciproques. Les meilleurs inhibiteurs sont souvent en fait des analogues de l'etat de transition de la reaction.

k1 E -1- S k-1 I -1-

K2 ES -Ow E -1- P

k_ilt k__i

El

Figure 111.4 : Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. Dans l'equation de Michaelis-Menten, K_M est remplace par:

Km = K _m
· {-1 + [IFK_I )



Yo
3 --
		v,,,,,/ 2
		,----- ..--
2 --

Oil K₁= k_i/k__i est la constante de dissociation de l'inhibiteur. Le K_M apparent augmente donc, it y a perte apparente d'affinite pour le substrat. Cependant un supplement de substrat peut compenser cette inhibition et la vitesse maximale Vmax reste la méme.

5 --

4 --

,-----------17:: - --

_---------

,

Kri-





Km^.

Kr_i

1

4 5 6 7 13 9

I



1

Figure 111.5. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur competitif.

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a 1/[S] = 0 : 1N _max est donc le méme, mais -1/Km est de plus en plus petit (fleches colorees), alors que la pente augmente.



Figure 111.6. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee competitivement decrite dans la Figure 111.5 Notez que toutes les droites se coupent sur l'axe

1/V₀ a 1 ^/Vmax^.

Exemples de medicaments: Le methotrexate, un analogue structurel du tetrahydrofolate, est un inhibiteur competitif de la dihydrofolate reductase, sur laquelle it se fixe 1000x mieux que le substrat naturel. C'est un medicament anticancereux (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.2. Inhibition incompetitive

Dans l'inhibition incompetitive, l'inhibiteur se lie directement au complexe enzyme-substrat, sans pouvoir se fixer a l'enzyme libre (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

k_{i 2}

E +S _NI^N''' ES -11^.- E + P 1(_{4 +1}

^kil_rt k-js

^PSI

Figure 111.7: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans ce cas, V. et K_M diminuent du méme facteur (1 + [WIC_'s), alors que K_M / V. reste inchange. L'affinite apparente de l'enzyme pour le substrat augmente donc : (Bernard Offmann, 2003).

^Villa; -- ^Vmax ^{i (1} + ^[I]1KIs )

Km = Km i ti + [1]1K_is )



0 4 b 8 10

Figure 111.8. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur incompetitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites paralleles de pente constante K_M / V.

Chapitre III: les enzymes



0

2

- 0_5

0_5

Figure 111.9. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee incompetitivement decrite dans la Figure 111.8 (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.3. Les inhibiteurs non-competitifs

Its se lient de maniere reversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empéchent pas l'acces. Il s'agit donc d'inhibiteurs allosteriques, c'est-à-dire agissant a un autre (allo-) site.

K1 2

E + S ..₄^10
· ES -lo^. E + P

k-1

+ I +I

k_ilt k__i kisif k-is

kli

El ₄₁^11P' ESI

k.11

Figure III.10: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans le cas particulier oil la fixation de l'inhibiteur ne modifie pas la fixation du substrat, ou reciproquement = K_is et K_i = l'inhibiteur (dit "non-competitif pur") diminue [E]_T sans modifier la repartition entre enzyme libre et lie. Dans ce cas, c'est V. qui est remplacee par:

^vmax = ^vmax ^I (¹ + [I]/K_I )

Le K_M reste constant, mais it y a perte apparente de concentration d'enzyme, donc reduction de V..



vo

a 2 3 ! 7 B 9 10

Figure III.1 1. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur non competitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a -1/K_M



1.5

2

Figure 111.12. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee non competitivement decrite dans la Figure III.11 (Bernard Offmann, 2003).

5. Classification des enzymes

Les enzymes sont classees et nominees en fonction de la nature des reactions chimiques qu'elles catalysent. Il y a six classes principales de reactions catalysees par les enzymes (Tableau III.1), ainsi qu'un certain nombre de sous-classes et de sous-sous-classes a l'interieur de chaque classe. Chaque enzyme se voit assignee deux noms et une classification a quatre chiffres (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

Tableau III. 1 : Classification des enzymes selon la reaction catalysee.

Classification Type de reaction catalysee

Oxydoreductases Transferases Hydrolases Lyases

Isomerases Ligases

Oxydoreduction

Transfert de groupes fonctionnels

Hydrolyse

Elimination de groupes et formation de doubles liaisons Isomerisation

Formation de liaison couplee a l'hydrolyse de l'ATP

6. Les enzymes etudiees

6.1. L'a- amylase

L'amylase a ete purifiee en 1835 du malt par Anselme Payen et Jean Persoz. Leur travail les a merles de suspecter que des substances semblables, maintenant connues sous le nom d'enzymes, pouvaient participer dans les processus biochimiques.

Elle est repandue dans tous les organismes vivants. Dans les systemes digestifs des humains et beaucoup d'autres mammiferes, elle est aussi appelee « diastase » (Encyclopaedia Britannica, 2007).

L'amylase hydrolyse l'amidon, le glycogene, et la dextrine pour former le glucose, le maltose et les dextrines.

Une alpha-amylase appelee la ptyaline est produite par les glandes salivaires, tandis que l'amylase pancreatique est secret& par le pancreas dans le petit intestin (Encyclopaedia Britannica, 2007). La Ptyaline commence la digestion du polysaccharide dans la bouche ; le processus est complete dans le petit intestin par l'amylase pancreatique, parfois appelee l'amylopsine (The Columbia Encyclopedia, 2006)

Les Béta-amylases sont presentes dans les levures, les moules, les bacteries, et les plantes, en particulier dans les grains. La 13-amylase attaque l'amylose de chain droite mais ne peut pas attaquer la majeure partie de l'amylopectine de chain en branche (Encyclopaedia Britannica, 2007).



Figure 111.13. Structure de l'alpha amylase pancreatique humaine.

Les trois domaines sont montres : le domaine A est rouge; le domaine B est jaune ; le domaine C est noir. L'ion de calcium (sphere bleue) et l'ion de chlorure (sphere jaune) sont egalement montres a proximite immediate du centre catalytique. Le ligand d'acarbose (bouleet-bdton vert) est lie au site actif. Des ligands de monosaccharide et de disaccharide (dans la representation de boule-et-bfiton) sont attaches aux accepteurs exterieurs (Minxie Qian et al, 1997).

6.1.1. La reaction specifique

Les a-amylases (a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1) sont les enzymes omnipresentes synthetisees dans tous les genres de la vie, de poids moleculaire 50 kDa. Tous les a-amylases lient au moms un ion fortement conserve de Ca²⁺ qui est exige pour l'integrite structurale et pour l'activite enzymatique (Nushin Aghajari et al, 2002).

L'a-amylase pancreatique humaine (APH) catalyse l'hydrolyse de la liaison glycosidique a(1-4) en polymeres de glucose tels que l'amidon. L'APH est composee de 496 acides amines en une seule chain de polypeptide liee aux ions essentiels de chlorure et de calcium. L'hydrolyse de l'amidon ou les substrats se produisent avec la conservation nette de la configuration au centre anomerique de sucre, et sont censes proceder par l'intermediaire d'un double mecanisme de &placement comportant la formation et l'hydrolyse d'un intennediaire de b covalent glycosyle-enzyme (Dr. Anjuman Begum, 2007).

6.1. 2. Interet de l'inhibition de l'alpha amylase

Les amylases sont une partie de la plus large classe des enzymes hydrolytiques appelees les glycosidases, clivent les liaisons glycosidiques de l'amidon dormant les fragments de disaccharide qui sont plus tard decomposes en glucose (Figure III. 14).

OH

0

HO	^HO0 HO Amidon	OH 0 OH ^H000 HO HO	amylase		disaccharicles - glucose
			Les inhibiteurs qui bloquent la reaction hydr olyt ique



OH

HO

HO

H5

HO

(1`

-0

_Ffp,,

OH HN-4

NHO. ^HN

HN_7i

OH N_{o NH2}

NH

HN

Octapeptide lineaire

1-1C

OH

I-10

FIN

HO

HO_o

HO

acarbose

Four le traitement de diabete

Les inhibiteurs

OH

O

N

HN

H₂N

Figure III. 14. Les inhibiteurs : l'acarbose et l'octapeptide de la reaction catalysee par l'amylase (Nicola Pohl, 2005).

Les inhibiteurs des amylases ont déjà montre leur utilite en aidant les diabetiques (Franco, O.L. et al, 2002). Les niveaux de glucose des diabetiques peuvent étre contrOles apres des repas par l'administration d'un inhibiteur d'amylase tel que l'acarbose. Acarbose est un produit naturel obtenu par la fermentation et est structurellement lie au substrat d'oligosaccharide d'amylase, car jusqu'a cinq residus de glucose sont connus pour étre adaptes dans le site actif d'amylase (Machius et al, 1996). Il est interessant que certains plantes et micro-organismes produisent les inhibiteurs d'amylase qui sont bases sur des proteins plutOt que les carbohydrates. Ces proteins inhibitrices, qui s'etendent dans la taille de 32 acides amines avec 3 liaisons disulfures a plus de 19 kDa, regule l'activite d'amylase endogene, par exemple dans les grains des plantes, aussi bien que pour defendre contre les amylases digestives d'autres organismes telles que les insectes (Breuer, 2003).

On a rapporte que l'inhibition des a-amylases induit la tolerance des carbohydrates, la satiete et la perte de poids, et pour prolonger le vide gastrique. Les inhibiteurs d' a-amylase ont ainsi un potentiel therapeutique pour le traitement de l'obesite et du diabete non-insulin (Juliet A. Gerrard et al, 2000).

6.2. La trypsine

Sous le terme de trypsine immun reactive (TIR), on regroupe un ensemble de molecules qui ont en commun d'être reconnues par divers anticorps developpes contre la trypsine humaine cationique ou trypsine-1. Cette protease est issue de l'activation du plus abondant des trypsinogenes produits par le pancreas chez l'homme.

La trypsine est une protein de 201 acides amines d'un poids moleculaire de 23 kDa et qui possede quatre ponts disulfures.

La trypsine est synthetisee par les cellules acines du pancreas sous forme d'une pro-enzyme qui inactive le trypsinogene. Il existe en fait deux trypsines originaires de deux isoformes differentes du trypsinogene mais a capacites catalytiques quasi identiques. Cette activite proteolytique est tres intense ; elle se manifeste au niveau des liaisons carboxyliques de la lysine et de l'arginine.

La plus grande partie de la secretion pancreatique passe dans le duodenum mais une faible partie est retrouvee dans le serum oil elle est amen& par les voies veineuses, lymphatiques et peritoneales. Il existerait egalement une secretion endocrine. La trypsine serique peut donc representer un passage fortuit de l'enzyme dans la circulation mais aussi un recyclage enzymatique ou encore un mecanisme d'autoregulation de la synthese. Une infime proportion du trypsinogene secrete se retrouve dans la circulation sanguine, oil it est detectable par des techniques sensibles.

Le pouvoir proteolytique de la trypsine est trop intense pour qu'elle circule isolement dans la circulation sanguine. Elle se presente donc dans le serum, liee a des inhibiteurs des proteases tels que l'a_i-antitrypsine et l'a₂-macroglobuline. La trypsine developpe son activite dans les voies intestinales (0. Gaillard, 1996).



Figure 111.15. Structure par rayons X de la trypsine bovine.

Dessin de l'enzyme complexes avec son substrat polypeptidique (en vert) dont la chaine laterale d'arginine occupe la poche de specificite de l'enzyme (en pointilles bleu), la chaine des C_a, les pouts disulfures et les chains laterales de la triade catalytique, Serine 195, Histidine 57, et Aspartate 102 sont representees (D. Voet et J. G. Voet, 1995).

6.2.1. La reaction specifique

La trypsine est une enzyme de la digestion synthetisee et secret& par les cellules acinaires pancreatiques, en passant par le canal pancreatique, dans le duodenum (la partie superieure du petit intestin), elle catalyse l'hydrolyse d'une liaison peptidique d'un residu chargé positivement : l'arginine et la lysine (D. Voet et J. G. Voet, 1995).

6.2.2. Interet de l'inhibition de la trypsine

Trypsine-like proteases a serine composent une famille d'enzymes avec une importante activite. Its sont connus pour étre impliques dans beaucoup d'etats physiologiques et desordres pathologiques. Leur activite non contrOlee est nes dangereuse et mene souvent aux maladies serieuses comme emphyseme, fibrose cystique ou developpement et progression de cancer. Par exemple, l'enzyme principale dans la croissance et la metastase de tumeur est activateur plasminogen d'urokinase (uPA) appartenant a la famille de protease a serine (trypsine-type).

Dans des conditions physiologiques normales, cette enzyme joue un role essentiel dans des processus d'angiogenese mais ces resultats non contrOles d'activite dans d'enormes niveaux de la plasmine active, qui facilite le mouvement des cellules de cancer (Marcin Sienczyk et Jozef Oleksyszyn, 2004).

Formes moleculaires multiples d'inhibiteurs de trypsine (TI) et chymotrypsine (CI), qui sont des enzymes digestives typiques des insectes, des mammiferes et des micro-organismes, et subtilisine (SI), une proteinase de beaucoup de bacteries et mycetes phytopathogenique (Alexander V. Konareva et al, 2001).

La grande variete d'inhibiteurs de protease a serine sont fournies par plusieurs sources telles que les tissus, micro-organismes, plantes, etc., jouent un role important en reglant les enzymes proteolytiques. L'analyse des complexes de protease-inhibiteur aide a la comprehension du mecanisme d'action, aussi bien que pour concevoir des inhibiteurs. Les inhibiteurs de protease sont repandus en nature, variant de petites molecules, peptides aux proteins. Jusqu'ici, 18 differents inhibiteurs de protease ont ete classifies et la liste est en croissance continue. Dans la plupart des inhibiteurs de protease la boucle de reactif-site, avec la geometrie specifique, bloque le site actif et la region substrat-liante (B. Syed Ibrahim et Vasantha Pattabhi, 2005).

L'activation inadequate du trypsinogene dans le pancreas mene au developpement de la pancreatite. Une fois que la trypsine est activee, elle est capable d'activer beaucoup d'autres proenzymes digestives. Ces enzymes pancreatiques activees augmentent plus loin l'autodigestion du pancreas. La trypsine active egalement des cellules par l'intermediaire du recepteur de trypsine. Le recepteur de la trypsine est egalement connu en tant qu'un des recepteurs actives par protease, a savoir PAR-2, recemment. Les cellules acinaires et les cellules de conduction expriment PAR-2 abondant. L'activite de la trypsine dans le pancreas est contrOlee principalement par l'inhibiteur pancreatique secrete de la trypsine (PSTI), qui est egalement connu en tant que type 1 de Kazal d'inhibiteur de protease de serine (SPINK1).

PSTI est synthetise dans les cellules acinaires du pancreas et agit en tant qu'un inhibiteur normal efficace de trypsine pour empécher l'occurrence de la pancreatite. Quand le trypsinogene est active a la trypsine dans le pancreas, PSTI lie immediatement a la trypsine pour empécher davantage l'activation des enzymes pancreatiques. PSTI bloque egalement l'activation supplementaire des cellules pancreatiques par l'intermediaire du recepteur de trypsine, PAR-2 (figure III. 16).



Activation des cellules : acinaires

de conduction inflammatoires

a travers le rècepteur de la trypsine (PAR-2)

Kallikreinog6ne f Chymotrypsino gene Proelastase roc arb oxyp eptidase rop hasp holipas e A2



Kallikreine Chyrnotrypsine Elastase Carboxy-peptidase Phospholipase A2

Figure 111.16. Voies d'activation des proenzymes et du PAR-2 par la trypsine.

Une fois que la trypsine est activee, elle est capable d'activer beaucoup d'autres proenzymes digestifs. La trypsine active egalement les cellules pancreatiques et inflammatoires par l'intermediaire de PAR-2. L'activite de trypsine dans le pancreas est contrOlee principalement par PSTI. Quand le trypsinogene est active a la trypsine dans le pancreas, PSTI lie immediatement a la trypsine pour empécher davantage l'activation des enzymes pancreatiques (Masahiko Hirota et al, 2003).

6.3. La lipase

Nous obtenons des lipides de l'ingestion, du stockage, ou de la synthese. Les graisses dietetiques emulsionnees par des sels de bile, digeres par des lipases, absorbees dans le systeme de lymphe, apres elles entrent dans la circulation sanguine (Marcotte, 2005). Les lipases ont ete citees en tant qu'une des plus souples des enzymes par la plupart des scientifiques de recherches du monde. Elles sont employees dans un certain nombre de bioconversions et leurs applications peuvent étre trouvees dans les industries comme pharmaceutique, la laiterie, le detergent, le produit de beaute, le produit oleochimique et d'autres. Selon l'opinion courante de l'industrie et du milieu universitaire, it peut y avoir d'exploitation commerciale a grande echelle de ces enzymes en prochaines annees. Cette base de donnees est une compilation des donnees liees aux lipases.

Les lipases (EC 3.1.1.3, triacylglycerol lipases) sont des enzymes qui ont ete classiquement utilisees pour continuer l'hydrolyse des triglycerides avec la production concomitante des acides gras libres. Cependant ces enzymes montrent egalement l'activite catalytique vers une grande variete d'alcools et d'acides dans des reactions de synthese d'ester a condition que l'activite de l'eau soit tres basse (Dr. P. Gautam, 2006).

L'entite fonctionnelle pour l'hydrolyse des triglycerides alimentaires dans l'intestin, serait un complexe ternaire associant la lipase, la colipase et une micelle de lipides biliaires. La taille, plus que la nature chimique de la micelle serait importante. La destabilisation de l'interface

lipidique pourrait se faire par des peptides obliques de la lipase et de la colipase (Denis Lairon, 2007).



A

Figure III. 17. Structure trois dimensionnel de la lipase pancreatique humaine (Marion Ansorge-Schumacher, 2007).

6.3.1. La reaction specifique

La plupart des lipases agissent a une position specifique sur la molecule de glycerol d'un substrat de lipide (A1, A2 ou A₃). Dans l'exemple de la lipase pancreatique humaine (LPH), qui est l'enzyme principale responsable de decomposer des graisses dans le systeme digestif humain, une lipase acte pour convertir des substrats de triglycerides trouves en huiles de nourriture en monoglycerides et acides gras libres (Princeton University, 2005).

6.3.2. Interet de l'inhibition de la lipase

La lipase pancreatique est l'enzyme la plus importante pour la digestion des triglycerides. L'application d'un inhibiteur de lipase a ete examinee plus tot comme traitement pour l'obesite. Orlistat (RO 18-0647), un derive hydrogens de lipstatine derive du Streptomyces toxitricini, est un inhibiteur efficace de la lipase gastrique et pancreatique, et s'est avers étre efficace pour le traitement d'obesite. L'existence des inhibiteurs de lipase dans divers produits alimentaires a ete recherchee, et la presence de ces inhibiteurs dans les cereales, dans le son de ble, germe de ble et dans le soja a ete rapportee. Des inhibiteurs de lipase ont ete egalement cherches dans les produits naturels tels que les medecines chinoises et les diverses herbes (M Yamamoto et al, 2000). L'obesite est Fun des problemes principaux de la sante publique dans les pays developpes. On le considere comme un facteur de risque lie a la genese ou le developpement des maladies chroniques principales, y compris la maladie cardiovasculaire, le diabete, et le cancer. Aux Etats-Unis, l'obesite augmente a un taux alarmant. Le poids excessif et l'obesite sont les troubles nutritifs les plus communs aux Etats-Unis, affectant la majorite d'adultes dans le pays (Diego A. Moreno et al, 2003).

Bibliographie

· Anonyme, 28/10/2003, Cours notions de base Enzymologie Licence Angers, source: F. Chapeville, H. Clauser, 1974, Biochimie Par Chapeville Et Clauser.

· Athel cornish-bowden, Marc Jamin et Valdur Saks, 2005, cinetique enzymatique, p 7, p 55, first published in 2004 by Portland Press, Ltd, London, second published EDP sciences, 2005.

· B. Syed Ibrahim and Vasantha Pattabhi, 20 May 2005, Trypsin Inhibition by a Peptide Hormone: Crystal Structure of Trypsin-Vasopressin Complex. Journal of Molecular Biology Volume 348, Issue 5, pp 1191-1198.

· Bernard Offmann, Cours, 13 avril 2003, Universite de La Reunion, Departement de Biochimie et Biologie Moleculaire.

· Diego A. Moreno, PhD, Nebojsa Ilic, PhD, Alexander Poulev, PhD, Dawn L. Brasaemle, PhD, Susan K. Fried, PhD, and Ilya Raskin, PhD, October 2003, Inhibitory Effects of Grape Seed Extract on Lipases, Journal Nutrition, Volume 19, Issue 10, pp 876-879.

· Docteur Denis LAIRON, 2007, Le systeme lipase et colipase pancreatique, U 476
INSERM / 1260 INRA, Faculte de Medecine de la Timone, Marseille, France.

· Donald Voet et Judith G. Voet ; 1998 ; Biochimie ; pages 355-356, 358; edition De Boeck Universite.

· Dr. Anjuman Begum, Shin Numao, Iben Damager, Chunmin Li, Tanja M.

Wrodnigg, Christopher M. Overall, Gary D. Brayer, and Stephen G. Withers,

November 12, 2004, In Situ Extension as an Approach for Identifying Novel Amylase

Inhibitors, Journal Biol. Chem., Vol. 279, Issue 46, pp 48282-48291.

· Dr. P. Gautam, 2006, AU-KBC RESEARCH CENTRE, Anna University, Chennai.

· E. Marcotte, fall 2005, cours de "Oxidation of Fatty Acids", source: Lehninger -
Principles of Biochemistry by Nelson/Cox, 4th ed. W. H. Freeman Publishing, 2005.

· Encyclopedia Britannica, 2007.

· Franco, 0.L., Rigden, D.J., Melo, F.R., and Grossi-De-Sa', M.F, January 2002, Plant a-amylase inhibitors and their interaction with insect a-amylases, European journal of biochemistry. Volume 269 Issue 2 pp 397-412.

· Gerrard, J.A., Prince, M.J. and Abell, A.D., 2000, Kinetic Characterisation of EneDiol-Based Inhibitors of a-Amylase, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 10, No14, pp 1575-6.

· H.W. Breuer, 2003, Review of acarbose therapeutic strategies in the long-term treatment and in the prevention of type 2 diabetes. Int J ClM Pharmacol Ther, Volume 41, pp 421- 440.

· Konarev, Alexander V: Anisimova, Irina N: Gavrilova, V A: Vachrusheva, T E: Konechnaya, G Yu: Lewis, Mervyn: Shewry, Peter R, 2002 Feb, Serine proteinase inhibitors in the Compositae: distribution, polymorphism and properties, Volume 59, No 3, pp 279-91

· M Yamamotol, S Shimural, Y Itohl, T Ohsaka, M Egawa and S Inoue, 2000, Anti-obesity effects of lipase inhibitor CT-II, an extract from edible herbs, Nomame Herba, on rats fed a high-fat diet, International Journal of Obesity , Volume 24, pp 758-764.

· M. Machius, L. Ve' rtesy, R. Huber, and G, Wieland, 1996, Carbohydrate and protein-based inhibitors of porcine pancreatic alpha -amylase: structure analysis and comparison of their binding characteristics, J. Mol. Biol. Volume 260, pp 409-421.

· Marcin Sienczyk and Jozef Oleksyszyn, 2004, A convenient synthesis of new aaminoalkylphosphonates, aromatic analogues of arginine as inhibitors of trypsin-like enzymes, Tetrahedron letters, Volume 45, No 39, pp 7177,7251-7254.

· Masahiko Hirota, Kinuko Kuwata, Masaki Ohmuraya, Michio Ogawa, 2003, Significance of trypsin inhibitor gene mutation in the predisposition to pancreatitis, Hirota et al. / International Congress Series 1255, pp 41-48.

· Minxie Qian, Silvia Spinelli, Hugues Driguez, and Francoise Payan, 1997, Structure of a pancreatic a-amylase bound to a substrate analogue at 2.03 A° resolution; Protein Sci. Volume 6, pp 2285-2296.

· Nicola Pohl, December 2005, Acyclic Peptide Inhibitors of Amylases, J Chemistry & Biology, Vol. 12, pp 1257-1258.

· Nushin Aghajari, Georges Feller, Charles Gerday and Richard Haserl, 2002, Structural basis of a-amylase activation by chloride, Protein Science, Volume 11, pp 1435-1441.

· Olivier Gaillard, 2003, Immunoreactive trypsin (TIR), Immunoanal. biol. Spec, , Volume. 18, No 5, pp. 254-255

· Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher, 08/09/2006, Hydrolases, Department of Biotechnology, Aachen University.

The Columbia Encyclopedia, 2006, Columbia University Press

.Ca par6e

Expirimenble

Chapitre IV: extraction et quantification des composes phenoliques

1. Extraction des composes phenoliques

La recolte des plantes a ete effectuee en octobre 2006, de la region de Laghouat "Sidi Makhlouf', ce sont sept plantes, elles sont sechees a l'ombre pendant sept mois.

Les parties aeriennes de ces plantes (sauf pour le Gondale, ce sont des racines) sont finement broyees puis stockees dans des sachets en papier jusqu'a l'utilisation.

La procedure suivie est celle appliquee dans le laboratoire des sciences fondamentales, elle comporte trois sous &apes:

1.1. La maceration

La masse choisie est de 5 g de chaque poudre de plante, elle est maceree dans un mélange hydro-alcoolique (methanol (CH₃OH)/eau 80/20: v/v) pendant 24 h a temperature ambiante et a l'obscurite.



Zwadet Elkhrouf

Serr

Figure IV. 1. La poudre de chaque plante aprês le broyage.

1.2. La &pigmentation

Aprês filtration des extraits hydro-alcooliques, ils subissent une evaporation sous vide dans un rotavapeur a une temperature de 60°.

La phase aqueuse de chaque extrait est la^y& un ou plusieurs fois jusqu'a l'epuisement total avec un demi-volume de l'hexane dans une ampoule a decanter afin d'eliminer toutes traces de composes apolaires (pigments, lipides, etc.).



Figure IV. 2. Le lavage par l'hexane de deux extraits des plantes "Zewadet elkhrouf' et
"Gondale".

1.3. La purification

La phase aqueuse ainsi obtenue est ensuite la^y& un ou plusieurs fois avec un volume d'acetate d'ethyle. L'addition d'un mélange de deux solutions aqueuses (4m1): sulfate d'ammonium (NH₄)₂SO₄ 20 % (m/v) et l'acide orthophosphorique H₃PO₄ 2% (m/v) facilite le passage des composes phenoliques de la phase aqueuse vers le solvant « l'acetate d'ethyle».

La phase organique obtenue est sechee sur sulfate de sodium anhydride Na₂SO₄pour eliminer toutes traces d'eau. Aprês filtration le solvant est evapore sous pression reduite a 60°C. Les extraits phenoliques obtenus sont sous forme d'une poudre ou pfite, de couleur jaune, marron et vert militaire suivant la nature de la plante, ils sont aussi peses pour calculer le rendement de chaque plante.

Le residu est repris dans 10 ml de methanol pur et conserve a --10°C dormant l'extrait phenolique purifie.

Le tableau IV. 1 presente l'aspect, la couleur et la masse de chaque extrait phenolique de chaque plante :

Tableau IV. 1. La couleur, l'aspect et la masse de chaque extrait phenolique

Plante	Couleur	Aspect	Masse (g)		Rendement (%)	Foulia
Vert militaire	Poudre+pfite	0.3	5.8		Gondale
Jaune	Poudre	0.3	5.8		Lelma
Vert militaire	Pfite	0.1	2		Remth
Marron clair	Pfite	0.04	0.8		Reguig
Vert militaire	Pfite	0.06	1.2		Serr
Marron	Poudre +pfite	0.37	7.4		Zewadet Elkhrouf
Vert militaire fonce	Poudre +pfite	0.36	7.2



Figure IV. 3. Les extraits alcooliques bruts

2. Quantification des composees phenoliques

2.1. Dosage des phenols totaux

Le principe de ce dosage est adapte par Singleton et Ross (en 1965) avec le reactif de Folin -- Ciocalteu (B.I.GINER-Chavez ,1996).

Le reactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune, constitue de polyheterocycles acides contenant l'acide phosphotungestique H₃PM₁₂0₄₀ et l'acide phosphomolybdique H₃PW₁₂0₄₀ dont la reaction est :

Oxydation des phenolates --> reduction des polyheterocycles --> formation d'un complexe molybdene(Mo₈0₂₃)-tungstene (W₈0₂₃) stable bleu qui absorbe fortement a une longueur d'onde de l'ordre 760 nm. Le phenol standard utilise dans cette methode est l'acide gallique dont la formule chimique est presentee dans la figure IV. 4.



Figure IV. 4. L'acide gallique (Acide 3,4,5-trihydroxybenzoIque).

2.1.1. La courbe d'etalonnage

A partir d'une solution mere aqueuse preparee de l'acide gallique de concentration massique 0.5 g/1, des solutions filles sont ainsi preparees de concentration allant de 0.06 g/1 jusqu'a 0.28 g/1.

A l'aide d'une micropipette, 100 gl de chaque solution est introduite dans des tubes a essais, suivi de l'addition de 500 gl du reactif de Folin-Ciocalteu (10 fois dilue dans l'eau), apres 2 minutes 2 ml de carbonate de sodium Na₂CO₃ a 20% (m/v) ont ete ajoutes (favoriser un milieu alcalin pour declencher la reaction d'oxydoreduction), par la suite ces solutions sont maintenus a l'obscurite pendant 30 minutes a temperature ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution est effectuee a l'aide d'un spectrophotometre de Shimadzu 1601 (figure IV .5) a une longueur d'onde de 760 nm contre un blanc (méme solution sans la solution d'acide gallique) ce qui nous permet de tracer la courbe d'etalonnage (figure IV .6).



f -4111111F"'

Figure IV. 5. Le spectrophotometre UV-visible de Shimadzu (1601).



0

0,1

0,2

0,3

co			C
0,8		8
0,6		-E 0
		.c%
0,4
0,2
0

Concentration (g/I)

Figure IV. 6. La courbe d'etalonnage de l'acide gallique.

2.1.2. Traitement des echantillons

Une quantite de 100g1 de chaque solution d'extraits dillies est introduite dans des tubes a essais, l'addition de 500g1 du reactif de Folin- Ciocalteu (10 fois dilue dans l'eau), apres 2 minutes, on ajoute 2 ml de carbonate de sodium Na₂CO₃ a 20% (m/v) afin de favoriser un milieu alcalin pour demarrer la reaction d'oxydoreduction, par la suite ces solutions d'extraits sont maintenus a l'obscurite pendant 30 minutes a temperature ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution d'extraits est effectuee de la fawn decrite precedemment.

2.1.3. Resultats et discussion

L'analyse quantitative des phenols totaux des extraits phenoliques a ete realisee par la méme procedure decrite precedemment. La teneur en composes phenoliques de chaque extrait de plante a ete alors calculee a partir de la courbe d'etalonnage et exprimee en milligrammes par 100 grammes de la matiere seche equivalent en acide gallique.

Les resultats obtenus sont presentes dans le tableau IV. 2.

Tableau IV.2 : La teneur en phenols totaux des plantes investiguees.

Teneur en

plante C: g/1 polyphenols: mg/100g

Foulia 1,85 370

Gondale 0,18 37

Lelma 1,21 241

Remth 1,10 215

Reguig 1,21 241

Serr 1,10 214

Zwadet Elkhrouf 0,81 162

La teneur en polyphenols dans les plantes etudiees varie de 37mg/100g a 370mg/100g. Remarquons que les quatre plantes renferment presque la méme quantite de phenols totaux. Si on compare nos resultats a ceux déjà realises au laboratoire (M. Yousfi et al, 2006, 2007) on peut dire que les plantes investiguees sont pauvres en composes phenoliques.

Les teneurs en phenols totaux determines par colorimetrie (tableau W. 2) sont toujours tres faibles par rapport aux rendements des extraits bruts (tableau IV. 1), ce resultat indique que l'extrait brut obtenu par extraction liquide- liquide avec de l'acetate d'ethyle contient des composes autres que les polyphenols.

2.2. Dosage des flavondides

La quantification des flavonokles a ete effectuee par une methode adapt& par Zhishen et al (Zhishen et al, 1999) avec le trichlorure d'aluminium et la soude. Le trichlorure d'aluminium forme un complexe jaune avec les flavonokles et la soude forme un complexe de couleur rose absorbe dans le visible a 510 nm. Le flavonokle standard utilise dans cette methode est la catechine dont la formule chimique est represent& dans la figure IV. 7.



Figure IV. 7. La catechine (-)-trans-3,3',4',5,7-Pentahydroxyflavane (Augustin Scalbert, 2004)

2.2.1. La courbe d'etalonnage

A partir de la solution mere de la catechine (utilisee comme &talon pour tracer la courbe d'etalonnage) preparee dans le methanol de concentration massique 1 g/1, on prepare des solutions filles de concentrations allant de 0.1 a 0.8 g/l.

Dans une fiole, on met 1 ml de chaque dilution de solution fille de la catechine (Figure IV.7) ou de l'extrait lors de la quantification des flavonokles, on ajoute 5 ml d'eau distill& puis 0.3 ml de nitrite de sodium NaNO₂ a 5% (m/v) dans l'eau et apres 5 minutes on rajoute 0.6 ml de trichlorure d'aluminium A1C1₃ a 10 % (m/v) dans l'eau, on remarque que les flavonokles reagissent avec lui pour former un complexe jaune. 5 min apres, on additionne 2 ml de la soude NaOH (1M) et on constate le changement de coloration du jaune vers le rose qui absorbe dans le visible a 510 nm. Ceci est complete a 10 ml avec de l'eau distillee, suivi d'une legere agitation afin d'homogeneiser la solution pour la lecture contre un blanc d'eau distill& en employant le méme spectrophotometre ultraviolet. A partir des valeurs des absorbances obtenues, nous avons trace la courbe d'etalonnage de la catechine (Figure IV.8).

I

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

y = 2,2272x R² = 0,9974

O

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

concentration (g/1)

Figure IV. 8. La courbe d'etalonnage de la catechine.

2.2.2. Resultats et discussion

La quantification des flavondides dans nos extraits a ete determine en utilisant la courbe d'etalonnage et les resultats sont exprimes en equivalent de la catechine, les resultats obtenus sont consigns dans le tableau W. 3.

Tableau IV.3. La teneur en flavonoIdes et leur pourcentage des plantes investiguees.

plante	C: g/1	Teneur en flavomfides mg/100g		Taux de flavomfides (%)	Foulia
0.72	144	38,91		Gondale
0,127	25	67,56		Lelma
1.32	264	109,12		Remth
0.4	80	36,74		Reguig
0,55	110	45,22		Sen-
0,77	155	72,43		Zwadet Elkhrouf
0,13	26	15,43

Dans toutes les plantes, on remarque que la taux des flavonoIdes est compris entre 15,43 et 72,43% et inferieur aux taux des phenols totaux, sauf pour la plante "Lelma", ce resultat peut étre explique que la plante "Lelma" contient des composes possedant des structures chimiques similaires aux flavondides, ou des flavonoIdes de couleur rose ce qui augmente l'absorbance de l'extrait a 510 nm.

3. Conclusion

Les sept plantes ont subi le méme traitement de sechage et d'extraction comme it est decrit precedemment. La teneur en composes phenoliques et en flavonokles depend de differents facteurs (nature de l'espêce, conditions physiologiques, la genetique, type d'extraction: le solvant, le mode "a froid, a chaud", agitation ou non, ...). Les resultats obtenus aprês les analyses sont résumés dans l'histogramme figure IV. 9.

Teneur Ingig _{3_}

2,5 - 2 - 1 ,5- 1-				1 d t							IiI Phenols (mg/g) Flavonoides (mg/g)
					0						0,5-
								Plantes

Figure IV. 9. La teneur en composes phenoliques et les flavonokles dans chaque plante. Dans la plante "Lelma" le taux des flavonokles est nettement superieur au taux des poly phenols, celui est interprets que peut étre ces composes ont une structure semblable de celle des flavonokles donc ils absorbent dans la méme longueur d'onde.

Bibliographie

· Augustin Scalbert, 1 avril 2004, Fruits et legumes, polyphenols et sante, laboratoire des maladies metaboliques et micronutriments, INRA, Centre de Recherche de Clermont-Fen-and/Theix, relu par Edith Florentin (professeur agregee).

· B.I. Giner-Chavez, 1996, condensed tannins in tropical forages -these Ph. D, Cornell University, Ithaca, USA.

· J. Zhishen, T. Mengcheng, W. Jianming, 1999, the determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals, J Food Chem, Volume 64, pp 555-559.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, S. Maamri, F. Djireb, P. Stocker, December 2006, Phenolic extracts from various Algerian plants as strong inhibitors of porcine liver carboxylesterase, J Enzyme Inhib Med Chem, Volume 21, No 6, pp 719-26.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, N. Vidal, JF. Lesgards and P. Stocker, July 2007, Screening of some Algerian medicinal plants for the phenolic compounds and their antioxidant activity, J European Food Research and Technology, Volume 224, No 6, pp 801-809.

Z1 Ids des extraits

p6andires sur (es

enzynes

ai--d Amyrase



Alpha dextrines

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 1. a- Amylase
1. Principe de la methode

L'activite enzymatique peut étre mesuree par differentes techniques physico-chimiques (colorimetrie, spectrophotometrie, fluorimetrie) ; cherchant generalement la disparition du substrat ou l'apparition de produit en suivant l'evolution de la densite optique.

Dans ce travail on s'interesse a l'evaluation de l'effet des composes phenoliques des extraits (des plantes investiguees) sur l'activite (inhibition) enzymatique de l'alpha amylase d'Aspergillus oryzae. Elle hydrolyse l'amidon (il existe sous forme de granules, qui se composent de plusieurs molecules de million d'amylopectine ainsi qu'un nombre encore plus grand de molecules d'amylose (R. Bowen, 2006) en produit principal le maltose incolore suivant cette reaction :



a- amylase



Maltase +



Maltatriase

Figure V. 1. 1. L'action de l'a- amylase sur l'amidon

2. Procedure experimentale

L'analyse des inhibiteurs de l'alpha amylase est effectuee par la quantification du sucre reducteur libere dans le milieu (maltose).

L'activite inhibitrice de l'enzyme est exprimee par la diminution des unites du maltose libere dans le milieu reactiormel.

La methode suivie est celle de Bernfeld (1955), elle est basee sur le dinitrosalicylique DNS qui stoppe la reaction enzymatique (changement de pH) et forme un complexe avec le maltose dormant une coloration rouge dont l'absorbance est mesuree a 530 nm.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 1. a- Amylase
2.1. La courbe d'etalonnage du maltose

A partir d'une solution mere aqueuse preparee du maltose de concentration massique 0.03 mo1/1, des solutions filles sont ainsi preparees de concentration allant de 0.0005 mo1/1 jusqu'a 0.002 mo1/1. Dans un tube, on introduit 2 ml de la solution du maltose puis on ajoute 1 ml du reactif DNS (1 g de DNS, 200 mg de phenol cristallin, 20 g de double tartarate de sodium, et 50 mg sulfite de sodium dissous dans la soude de 1% [eau/volume] [prepare frais]) qui est chauffe a 100 °C pendant 5 min, aprês refroidissement, le mélange est complete a 10 ml d'eau distillee. La lecture de l'absorbance de chaque solution est effectuee a l'aide d'un spectrophotomêtre de Shimadzu 1601 a une longueur d'onde de 530 nm contre un blanc (méme solution sans la solution du maltose) ce qui nous permet de tracer la courbe d'etalormage (figure V. 1. 2) (Sigma Aldrich, 1999) :

^g0,9 § 0,8 4 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025

Concentration du maltose mol/I

Figure V. 1. 2. La courbe d'etalormage de maltose.

2. 2. Activite de 1' a- amylase

Le milieu reactiormel contient 100 ill des extraits phenoliques, 50 IA de l'a- amylase sont pre incubes pendant 30 minutes, aprês lml de solution d'amidon 1% (m/v) est ajoute puis incube a 37°C pendant 10 minutes, par la suite le milieu est traite de la méme fawn que la courbe d'etalormage du maltose et la lecture est effectuee a 530 nm. Un blanc a ete place sans extrait phenolique, et encore sans l'a-amylase (E. Kokiladevi et al, 2005).

La representation graphique 1/V = f ([polyphenols]), nous renseigne sur le type d'inhibition et permet de determiner les constantes cinetiques en presence et en absence des extraits phenoliques.

3. Resultats et discussion

A l'aide des mesures spectrophotometriques realisees sur l'activite enzymatique de l'a amylase et comparativement a la representation de Michaelis-Menten, on apercoit que cet enzyme presente une cinetique michaelienne (figure V. 1. 3).



1

0,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Am idon (NM)

Figure V. 1. 3. La cinetique enzymatique de l'a -amylase.

Les differentes parametres cinetiques de l'enzyme (V., K_M) sont determines selon l'equation en double inverse de Lineweaver Burk [1/ V = f (1/ S)] (figure. V.1.4).



Figure V. 1. 4. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne a- amylase.

A partir de la representation de Lineweaver-Burk de l'a- amylase, la vitesse maximale V. est de 3, 846 mol/s et la constante de Michaelis K_M est de 4, 347 mM.

L'etude de l'effet des extraits phenoliques sur l'activite de l'a- amylase est effectuee a l'aide d'un spectre UV-visible Shimadzu 1601, mesurant la concentration de maltose libere qui est transforms par la suite en une vitesse en mol/s.

D'apres les traces (figure V. 1. 5) representant la variation de l'inverse des vitesses reactionnelles en fonction des concentrations des extraits phenoliques exprimees en 1.1M (en considerant une masse molaire moyenne des polyphenols de l'ordre de 500g) pour differentes concentrations de substrats, nous avons determine le type et la constante d'inhibition (K_i) de chaque echantillon.

-



· S1

· S2 A S3

120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80



· S1

· S2

· S3

- 60 -40 -20 0 20 40 60



· S1 S2 ^A S3

Figure V. 1. 5. Representations graphiques 1/V = f ([polyphenols]) de chaque extrait phenolique tel que 1/V (s/ADO), ([S₃]> [S₂]> [Si]).

Les constantes d'inhibition (K_i) sont calculees a partir de ces graphes par la projection du point d'intersection des droites sur l'axe des abscisses, tandis que le type d'inhibition est deduit a partir du point de rencontre de ces traces. Le tableau V. 1. 1 regroupe les differents resultats obtenus.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 1. a- Amylase
Tableau V. 1. 1. Le type d'inhibition et la constante d'inhibition de chaque plante

Plante Type d'inhibition K_i (pM)

Foulia I I

Gondale / I

Lelma Non competitif 58

Remth / I

Reguig / I

Serr Non competitif 46

Zwadet Elkhrouf incompetitif ND

ND: Non determine

Les resultats obtenus montrent que parmi les sept plantes it y'a seulement trois plantes qui ont un pouvoir inhibiteur de l'a-amylase de type non competitif pour "Lelma" et "Serr" et de type incompetitif pour "Zwadet Elkhrouf'.

Nous avons teste les extraits phenoliques des sept plantes etudiees vis-à-vis a l'inhibition enzymatique car on peut trouver les extraits qui inhibent mais qui ne peuvent pas apparaitre dans les traces 1/V= f (I), pour cela nous avons appliqué la methode de Qiang II et al (Qiang .H et al, 2006) qui determine le pourcentage d'inhibition suivant cette relation:

Inhibition (%) = [1 - (test d'activite / contrOle)]* 100

tel que: test d'activite est le test en presence l'inhibiteur, le contnile est le test sans inhibiteur. Les resultats obtenus sont consigns dans le tableau V.1. 2 et presentes dans l'histogramme (figure V. 1. 6).

Tableau V. 1. 2: Le pourcentage d'inhibition de chaque plante.

Plante	Pourcentage d'inhibition Inhibiteur 1 Inhibiteur 2
Foulia	22,84	7,71
Gondale	22,63	52,57
Lelma	12,65	23,25
Remth	17,48	20,37
Reguig	5,14	21
Serr	8,12	9,46
Zwadet Elkhrouf	24,48	15,94



q Inhibiteur 1

q Inhibiteur 2

% d'inhibition 60

50 40 30 20 10

Plante s

0

^b tp* 4.° 00

Figure V.1.6. Le taux d'inhibition de l'a-amylase avec deux concentrations d'inhibiteur croissantes (Rd < [I₂]) et une seule concentration de substrat.

Nous remarquons que l'extrait "Gondale" possede un pourcentage d'inhibition le plus eleve de l'ordre de 52,57 %, alors que cet extrait ne repond pas au graphique 1/V = f (I) car ce type de graphique a ete obtenu a des concentrations nes faibles en phenols.

Le taux d'inhibition augmente lorsque la concentration d'inhibiteur augmente a l'exception de deux plantes : "Foulia" et "Zwadet Elkhrouf' et ceci peut étre explique par l'effet activateur qui est du a la concentration elevee en composes phenoliques.

4. Conclusion

Les inhibiteurs de l'a amylase sont diversifies et generalement synthetiques utilises comme medicament contre le diabete exemple l'acarbose, mais toujours on s'interesse a la nature pour la recherche des inhibiteurs de cette enzyme, beaucoup des plantes medicinales sont connus dans ce domain ; nos plantes sont des plantes sahariennes qui contiennent les phenols connus par leur pouvoir d'inhiber les enzymes et surtout les flavonokles du a leurs structures chimiques.

Parmi les sept plantes seulement trois plantes qui ont le pouvoir inhibiteur de l'enzyme sachant que ces plantes ont subit la méme procedure d'extraction des composes phenoliques ce qui explique que l'inhibiteur est specifique capable de bloquer le site actif de l'enzyme.



Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine
1. Principe de la methode

Dans cette partie du travail, on s'interesse a l'evaluation de l'effet des composes phenoliques des extraits (des plantes investiguees) sur l'activite enzymatique de la trypsine pancreatique bovine.

Cette enzyme hydrolyse le Na- Benzoyle- DL- Arginine -p- Nitroaniline (BAPNA) en produit principal le Na- Benzoyle- DL- Arginine incolore et le -p- Nitroaniline qui est de couleur jaune detectable en visible suivant cette reaction (figure V. 2. 1):

	H 0 H

H-,INT NH₂

	0 ^NO	BAPNA Tiypsine
			^1-^12^N
^N.,NH

-p- Nitroaniline

H₂N NTT₎ (405 nm)

Na- Benzoyle- DL- Arginine

Figure V. 2. 1. L'action de la trypsine sur le BAPNA (Anonyme, 2004). 2. Procedure experimentale

L'analyse des inhibiteurs de la trypsine est effectuee par la mesure de la vitesse de la reaction enzymatique dans le mode cinetique (kinetic) dans le spectrophotometre Shimadzu 1601. Le milieu reactionnel (3 ml) contient 200 1.t1 de la trypsine (0,16 mg/ml) dans 1,6 ml de tampon tris (trishydroxymethylaminomethane) C₄1-1₁₁110₃ de concentration molaire 50 mM avec le chlorure de calcium CaC1₂ de concentration molaire 10 mM et de pH= 8,2. La cinetique enzymatique (t = 300 secondes) debute apres l'addition de 1 ml de substrat (a differentes concentrations) ; le blanc est depourvu de l'enzyme et les inhibiteurs.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine L'activite inhibitrice des polyphenols est mesuree de la méme fawn en introduisant 200 IA de differentes concentrations des extraits phenoliques.

3. Resultats et discussion

A l'aide des mesures spectrophotometriques realisees sur l'activite enzymatique de la trypsine et comparativement a la representation de Michaelis-Menten, on apercoit que cet enzyme presente une cinetique michaelienne (figure V. 2. 2).

V (AA/s)

0,03

0,025 -

0,02 -

0,015 -

0,01

0,005 -

0 0,5 1 1,5 2

S(mM)

Figure V. 2. 2. La cinetique enzymatique de la trypsine.

Les differentes parametres cinetiques de l'enzyme (V., K_M) sont determines selon l'equation en double inverse de Lineweaver Burk [1/ V = f (1/ S)] (figure V. 2. 3).



1/V (s/AA)

90

1/K

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

1/S (1/mM)

Figure V. 2.3. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne trypsine.

A partir de la representation de Lineweaver-Burk de la trypsine, la vitesse maximale V. est de 0.0769 AA/s et la constante de Michaelis K_M est de 2 mM.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine Parmi les sept plantes etudiees, on trouve uniquement que l'extrait "Foulia" qui possêde un pouvoir inhibiteur vis-a-vis de la trypsine (Figure. V. 2. 4). Le type d'inhibition dans ce cas est non competitif avec une constante d'inhibition K_i de l'ordre de 16 gM.



-30 -20 -10 0 10 20 ₃₀ ^I (P^M)

Figure V. 2. 4. Representation graphique 1/V = f ([polyphenols]) de Foulia tel que ([S₁] < [S₂] < [S3] < [S4] < [^S5])^.

Nous avons essaye de determiner le pourcentage d'inhibition de tous les autres extraits y compris l'extrait "Foulia", pour ce faire nous avons fixe la concentration des inhibiteurs et nous avons calcule le taux d'inhibition suivant la methode de Qiang II et al (Qiang .H et al, 2006). Les resultats obtenus sont regroupes dans le tableau V.2.1 et representes dans l'histogramme (figure V. 2.5).

Tableau V. 2.1. Le pourcentage d'inhibition de chaque plante.

Plante	Pourcentage d'inhibition Substrat
Foulia	20,04
Gondale	5,44
Lelma	16,83
Remth	22,03
Reguig	21,78
Serr	21,78
Zwadet Elkhrouf	15,10

o

% 30 d'inhibition

20- °

d

^--7

plantes

^10-
·S^IS)

Figure V. 2. 5. Le taux d'inhibition de la trypsine avec une concentration fixe de substrat et d'inhibiteur.

On remarque que les valeurs du pourcentage d'inhibition varient de 5,44 % pour l'extrait "Gondale" a 22.03 % pour l'extrait "Remth", les valeurs trouvees prouvent que le taux d'inhibition est independant de la concentrations des phenols, on peut conclure que l'inhibition enzymatique depend du type des composes phenoliques (relation structure -- activite).

4. Conclusion

Les inhibiteurs de la trypsine sont diversifies et generalement synthetiques utilises comme medicament contre plusieurs maladies par exemple la pancreatite, mais toujours on cherche des extraits naturels des plantes qui peuvent etre des inhibiteurs de cette enzyme, beaucoup des plantes medicinales sont connus dans ce domain ; nos plantes sont des plantes sahariennes qui contient des principes actifs connus par leur pouvoir d'inhiber les enzymes et notamment les composes a structure phenolique.

Parmi les sept plantes seulement une seule plante qui a le pouvoir inhibiteur de l'enzyme sachant que les sept plantes ont subit les mémes procedures experimentales ce qui explique que l'inhibiteur est specifique capable de bloquer le site actif de l'enzyme.

L'inhibition enzymatique de la trypsine depend de differentes parametres tel que : La concentration de substrat.

Le type d'inhibiteur et la nature de sa structure chimique (sa relation avec le site catalytique).

La concentration de l'inhibiteur.

Lipase

1. Principe de la methode

Nous avons aussi evalue l'effet de nos extraits phenoliques sur l'activite de la lipase pancreatique porcine.

Cette enzyme hydrolyse l'huile de maIs (poly insature) riche en triglycerides en produit le glycerol et principalement l'acide linoleique detectable dans l'UV a 232.5 nm suivant cette reaction (figure V. 3. 1):

H₂C-- 0 -- CO -- C (CH₂)₇ CH = CH-- CH₂ -- CH = CH (CH₂)₄CH₃ H C-- 0 -- CO -- C (CH₂)₇ CH = CH-- CH₂ -- CH = CH (CH₂)₄CH₃ H₂C-- 0 -- CO -- C (CH₂)₇ CH = CH-- CH₂ -- CH = CH (CH₂)₄CH₃

L'huile de ma'is (riche en tri linoleine)

Lipase

CH₂-- OH

CH -- OH

3 (CH₃ (CH₂)₄ CH = CH -- CH₂ -- CH = CH (CH₂)₇ -- COON) +

CH₂-- OH

Acides linoleiques Glycerol

Figure V. 3. 1. L'action de la lipase sur l'huile de maIs.

2. Procedure experimentale

L'analyse des inhibiteurs de la lipase est effectu& par la mesure de l'absorbance du produit libere puis transforms en une vitesse.

Le milieu reactiormel (3 ml) contient lml de la lipase pancreatique porcine de concentration 1,1 mg/ml dissout dans le tampon tris 0,2 M de pH = 7,7, 1 ml d'eau distill& et 1 ml d'huile de maIs 5 mg/ ml prepare dans l'eau et 200 mg de tween 20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) pour la solubilisation de l'huile dans l'eau, le mélange est incube a 37°C pendant 30 minutes puis la reaction est stopp& par l'ajout de lml d'ethanol, la lecture est effectu& 232.5 nm contre un blanc depourvu de l'enzyme.

L'activite inhibitrice des extraits est mesur& de la méme fawn en introduisant 1 ml de differentes concentrations des extraits phenoliques.

3. Resultats et discussion

A l'aide des mesures spectrophotometriques realisees sur l'activite enzymatique de la lipase et comparativement a la representation de Michaelis-Menten, on apercoit que cet enzyme presente une cinetique michaelienne.

E0,025 - > 0,02 - 0,015 - 0,01 - 0,005 - 0 '
0 0,001 0,002 0,003		0,004 0,005 concentration (g/m1)

Figure V. 3. 2. La cinetique enzymatique de la lipase.

Les differentes parametres cinetiques de l'enzyme (V_max, K_M) sont determines selon l'equation en double inverse de Lineweaver Burk [1/ V = f (1/ S)].



Ze c

E

160 140

120 100 80

60

y = 0,123x + 15,805 R² = 0,9923/

1/S (ml/g)

Figure V. 3.3. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne lipase.

A partir de la representation de Lineweaver-Burk de la lipase, la vitesse maximale V_max est de 0.0625 AA/min et la constante de Michaelis K_M est de 0.008 g/ml.

Nous avons essaye de tracer les graphes 1/V = f (I) pour tous les extraits, mais malheureusement nous n'avons pas abouti car un test realise nous a demontre que les extraits phenoliques etudies absorbent dans la méme longueur d'onde que l'acide linoleique qu'elle est de 232,5 nm, pour cela nous avons prefere d'evaluer le pouvoir inhibiteur de nos extraits vis-a-vis de la lipase par la determination du pourcentage d'inhibition seulement en appliquant la methode de Qiang .I-1 et al (Qiang .H et al, 2006), les resultats sont consigns dans le tableau V. 3. 1 et representes dans l'histogramme (figure V. 3. 4)

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes											3. Lipase
Tableau V. 3. 1. Le pourcentage d'inhibition de chaque										plante. d'inhibition Inhibiteur 2 Pourcentage
Plante							Inhibiteur 1				Inhibiteur 3
Foulia							15,60			21,70	71,03
Gondale							3,40			32,73	21,23
Lelma							29,03			10,31	69,44
Remth							11,20			11,51	70,43
Reguig							15,60			29,74	25
Sen-							29,46			10,31	44,44
Zwadet Elkhrouf							28,32			38,71	42,06
% d'inhibition 80 - 60 - 40 -
												q Inhibiteur 1 q Inhibiteur 2 q Inhibiteur 3
20-
0												plante s

Figure V. 3. 4. Le taux d'inhibition de la lipase avec trois concentrations d'inhibiteur croissantes ([I_i] < [1₂] < [I₃]) et une seule concentration de substrat.

Nous remarquons que parmi les sept plantes seulement "Foulia" et "Zwadet Elkhrouf' sont des bons inhibiteurs de la lipase, car le taux d'inhibition augmente en fonction de la concentration des extraits phenoliques par contre pour les autres extraits aucune relation est remarquee entre la concentration des extraits et le taux d'inhibition.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 3. Lipase
4. Conclusion

La lipase est une enzyme importante dans le corps humain et son activation peut étre benefique ou nefaste presente generalement dans le problême de l'obesite, it y a plusieurs types d'inhibiteurs synthetiques exemple : -polylysine, parmi les plantes etudiees deux plantes peuvent étre classees parmi les bons inhibiteurs de la lipase a savoir : "Foulia" et"Zwadet Elkhrouf'.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes

Bibliographie

· Anonyme, 2004, Experiment 3: protease kinetics.

· E. Kokiladevi, A. Manickam and B. Thayumanavan, 2005, characterization of Alpha-amylase inhibitor in Vigna sublobata, J Botanical Bulletin of Academia Sinica, Volume 46, pp 189-196.

· Qiang He, Yuanping Lv, Kai Yao, 2006, Effects of tea polyphenols on the activities of a-amylase, pepsin, trypsin and lipase, J Food Chemistry, Volume xxx, pp xxx-xxx.

· R. Bowen, 2006, Polysaccharides dietetiques : Structure et digestion.

· Sigma Aldrich, 1999, Enzymatic assay of a- amylase Inhibitor, Sigma quality control test procedure.

Evaluation de factiviti

antioydante

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

Les termes antioxydants et radicaux libres sont des termes populaires utilises par les nutritionnistes et autres professionnels de la sante. Ces dernieres armees ont vu apparaitre un debordement d'informations sur le role du stress oxydatif dans le declenchement d'un certain nombre de maladies graves, telles que certains cancers, les maladies cardiovasculaires et les maladies degeneratives liees au vieillissement, ainsi que sur le role therapeutique possible des antioxydants dans ces maladies (Kristiina Pelli et Marika Lyly, 2003).

1. Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des atomes, ou un groupe d'atomes, avec un nombre impair d'electrons sur la loge exterieure, et ils peuvent se former quand l'oxygene interagit avec certaines molecules (Kristiina Pelli et Marika Lyly, 2003).

Les radicaux libres sont des composes caracterises par une structure electronique desequilibree qui leur confere une grande reactivite sur les constituants organiques et sur les structures cellulaires. Ils se foment de fawn inevitable en parallele au metabolisme energetique et par une multitude d'autres voies. Ils favorisent habituellement le bon fonctionnement de l'organisme et la sante des mammiferes, mais leur exces peut étre nefaste. En dehors de toute situation pathologique, leur production est stimulee par toute situation de stress, en particulier par la manipulation maladroite ou brutale des animaux, par l'exercice physique, par le froid, par des niveaux d'alimentation excessifs ou par des desequilibres alimentaires. Elle peut alors atteindre des niveaux nuisibles pour les aspects quantitatifs et qualitatifs des productions animales (B. Aurousseau, 2002).

Le metabolisme cellulaire normal de l'oxygene produit de maniere continue de faibles quantites de derives reactifs de l'oxygene. Le role physiologique de cette production basale de

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

derives reactifs de l'oxygene n'est pas totalement connu, mais certaines de ces molecules pourraient avoir une fonction dans les processus de signalisation cellulaire.

Dans certaines situations, cette production augmente fortement, entrainant un stress oxydatif que l'on definit comme un desequilibre entre la production et la destruction de ces molecules. En raison de leur capacite a endommager presque tous les types de molecules dans l'organisme, les derives reactifs de l'oxygene ont ete impliques dans un tres grand nombre de pathologies, tant aigues que chroniques (Gutteridge, 1993).

L'appellation " derives reactifs de l'oxygene " n'est pas restrictive. Elle inclut les radicaux libres de l'oxygene proprement dit [radical superoxyde (^.0₂:), radical hydroxyl (
^·011), monoxyde d'azote (NO
^·), ...], mais aussi certains derives oxygenes reactifs non radicalaires dont la toxicite est importante [peroxyde d'hydrogene (11₂0₂), peroxynitrite (ON00^-)] (GP. Novelli, 1997)

1.1. Les differents types des radicaux libres

D' apres Halliwell (Halliwell, 1994), les mecanismes de l'action d'un antioxydant peuvent comprendre :

- Le piegeage direct des especes reactives d'oxygene (ERO).

- L'inhibition des enzymes et la chelation des traces metalliques responsables de la production des ERO.

- La protection des systemes de defense antioxydants.

- Le piegeage direct des ERO

L'interaction des flavonokles avec de nombreux radicaux a ete employee dans plusieurs etudes afin de determiner les elements majeurs de l'activite antioxydante. A cause de leurs faibles potentiels redox (Jovanovic, 1994), les flavonokles (Fl-OH) sont thermodynamiquement capables de reduire les radicaux libres oxydants comme le superoxyde, le peroxyle, l'alkoxyle et l'hydroxyle par transfert d'hydrogene :

El - ( )H + R ⁶ H - 0' + RH

Oil R represente l'anion superoxyde, le peroxyle, l'alkoxyle et l'hydroxyle.

Le radical flavonoxy (FL-0
^·) peut reagir avec un autre radical pour former une structure quinone stable.

	OH

quilione

O1-1			c^·
R^.RH

R^. RH

OH _K... )

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

Figure VI. 1. Piegeage des ERO (
·) par les flavondides.

- L'inhibition des enzymes et la chelation des traces metalliques responsables de la production des ERO

Les ions du fer (Fe²⁴) et du cuivre (Cu^2#177;) sont essentiels pour certaines fonctions physiologiques. Its peuvent étre, soit des constituants des hemoproteines, soit des cofacteurs des differentes enzymes du systeme de defense antioxydant (par exemple, Fe pour la catalase, et Cu et Zn pour la superoxyde dismutase). Mais ils sont aussi responsables de la production du radical hydroxyle par la reduction du peroxyde d'hydrogene selon la reaction suivante:

H2O. +Fe²⁺ (Cu⁺) '0H + ^-OH + Fe³⁺ (Cti²⁺)

Les flavonokles sont consideres comme de bons chelateurs de ces ions metalliques.

L'activite antioxydante des flavonokles est assuree grace a sa structure active qu'elle est represent& dans la figure VI. 2. :



HO

Figure VI. 2. Elements essentiels pour l'activite antioxydante des flavonokles (Abdelghafour
MARFAK, 2003).

2. L'activite antioxydante et les antioxydants

2.1. L'activite antioxydante

Les mecanismes de defense anti-oxydante du corps humain peuvent étre divises en deux categories differentes. Premierement, un certain nombre d'enzymes sont synthetisees a partir des proteins et d'autres nutriments et constituants de l'organisme. Le second groupe d'antioxydants doit étre obtenu a partir de l'alimentation, puisque ces derniers ne peuvent étre synthetises par l'étre humain. Its comprennent les nutriments et les metabolites vegetaux mentionnes plus haut : les vitamins E et C, les carotenokles, le selenium, les folates, les flavonokles, les phytoestrogenes et les glucosinolates (Kristiina Pelli et Marika Lyly, 2003). 2.2. Les antioxydants

Les antioxydants sont des molecules capables d'interagir sans danger avec les radicaux libres et de mettre fin a la reaction en chain avant que les molecules vitales ne soient endommagees. Chaque molecule antioxydante ne peut reagir qu'avec un seul radical libre, et par consequent, it faut constamment refaire le plein de ressources anti-oxydantes.

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

2.2.1. Les antioxydants synthetiques

Its sont utilises pour empécher les aliments gras de rancir et pour proteger les vitamines liposolubles (A, D, E et K) contre l'oxydation. Les esters d'acides galliques, le butylhydroxytoluene et le butylhydroxyanisol, appartiennent a cette categorie. Les vitamines C et E ont egalement des proprietes antioxydantes et ont l'avantage d'augmenter la valeur nutritive des aliments. Des recherches ont montre que les antioxydants synthetiques employes par l'industrie alimentaire sont egalement benefiques pour l'organisme (Microsoft Encarta, 2007)

Les antioxydants synthetiques sont generalement prepares en laboratoire, et principalement a partir de composants chimiques. Dans l'industrie alimentaire, l'ajout d'antioxydants naturels dans les aliments est une technique completement nouvelle. Depuis a peu pres 1980, les antioxydants naturels sont apparus comme alternative aux antioxydants synthetiques, et ils sont aujourd'hui generalement preferes par les consommateurs. Toutefois, le fait de trouver communement une substance dans un aliment ne constitue pas une garantie de son absence totale de toxicite. Les antioxydants synthetiques ont ete testes quant a leurs effets carcinogens ou mutagenes, mais de nombreux constituants naturels des aliments n'ont pas encore ete testes (Kristiina Pelli et Marika Lyly, 2003).

2.2.2. Les antioxydants naturels

Parmi les antioxydants naturels on trouve l'acide ascorbique (Vitamine C), les tocopherols (Vitamine E) et les composes phenoliques exemple les flavonoIdes.

3. Test de DPPH

3.1. Principe de la methode

Le DPPH ou 1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyle agit en tant qu'un radical libre stable efficace reduit par un antioxydant, montrant un spectre d'absorption a 517 nm avec une couleur violette, la reduction de ce radical nous donne la coloration jaune (Dong-Sun Lee et al, 2001).

La reaction de la reduction de DPPH^. Avec les composes phenoliques est montre ci-dessous :

+ Hi) OH

H M--M

·

0

₀

Figure VI. 3 : La reaction entre le DPPH et l'hydroquinone (Masahiro Nishizawa et al, 2005).

3.2. Procedure experimentale

On prend 1 ml de la solution de DPPH dissout dans le methanol de concentration 250 1.1A4 avec 1 ml de l'extrait phenolique de concentrations croissantes, apres une incubation pendant

30 minutes on effectue la lecture dans le spectrophotometre a 517 pourcentage d'inhibition suivant cette relation : I% = (1 -- (Aextrait ^ADPPH temoin)) *100

nm, on calcule le

3.3. Resuftats et discussion

Les resultats obtenus nous permet de tracer les graphes figurant la variation du pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration de l'extrait phenolique I% = f (C), les graphes sont representes dans la figure VI. 4.



E 70

E 60

50 40 30 20 10

PI (%) 100 -80 -60 -40 -20 -

Foulia

y= 3,8593x

R² = 0,9818

y = 5,0395x

R² = 0,973

Gondale

0

				0							5
10	15	20 C (pM)			10	15	20

C (pM)



Lelma

Remth

y = 6,1801x

y = 5,5069x

^-8. 100

^E 80

60 40 20

R² = 0,9695

R² = 0,9669

C

80 60 40 20

0

0

5 10 15 20

C (1M)

2 4 6 8 10 12 14

C (pM)

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

E 100

r.

80 60 40 20 0

Reguig y = 8,5847x

il 120

-

a 100

-

80 -60 -40 -20 -

R² = 0,9487

0

2 4 6 8 10 12 14

C (OA)

Serr y = 7,4359x

R² = 0,9912

,

2 4 6 8 10 12 14

C (pM)

Zwadet El khrouf

E 50 r. 40

30 20 10 0

y = 3,2364x R² = 0,9945


·

2 4 6 8 10 12 14

C (pM)

Figure VI. 4. Les graphes PI =f (C) de chaque plante.
Puisque la valeur d'EC₅₀ presente la concentration d'inhibiteur necessaire pour balayer 50 %
des radicaux libres et qui est inversement proportionnelle a l'activite antioxydante, nous avons
determine les valeurs des EC₅₀ de chaque extrait phenolique a partir des representations
graphiques I % = f (I). Les resultats sont groupes dans le tableau VI. 1 et presentes dans

l'histogramme (figure VI. 5). Tableau VI. 1. Les EC50 de chaque plante.			Plante
EC 50 (mg/ml)		Foulia
12,95		Gondale
9,92		Lelma
9,1		Remth
8,1		Reguig
5,8		Serr
6,7		Zwadet
15,4

EC50

(mg/m1)¹⁶

14- 12- 10- 8 - 6- 4 - 2 -

0 MI , Plantes

640 ^,z--

ks>^,

oP ^,z--

,z, *
· ,z, ,

,_i, ₄,1^, , c.0

00 i^. ,^,i,

_be

1

Figure VI. 5. Classement croissant des plantes selon leur EC50.

Si on compare les valeurs de EC₅₀ des sept extraits, on peut dire que l'extrait "Reguig" est le plus puissant antioxydant, alors que l'extrait phenolique "Zwadet Elkhrouf' est l'antioxydant le plus faible. Nous n'avons pas trouve une correlation entre le pouvoir antioxydant EC₅₀ et la teneur en phenols totaux et flavonoIdes. Ce resultat peut étre explique que les extraits etudies renferment des composes phenoliques de structures chimiques differentes et que ractivite antioxydante etudiee par ce test ne depend pas obligatoirement de la concentration des composes phenoliques. L'idee de revaluation de ractivite antioxydante est dans le but de trouver une correlation de ractivite antioxydante et le pouvoir inhibiteur des enzymes. Les tentatives essayees n'ont pas conduit a un resultat significatif et ceci montre q'un extrait inhibiteur d'enzyme ne soit forcement pas un antioxydant puissant.

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

4. Conclusion

Les radicaux libres sont des molecules instables produites en permanence par le corps humain suivant des reactions biochimiques, par exemple la production de l'energie a partir des aliments et de l'oxygene, ils peuvent s'associer a d'autres molecules et entrer en reaction comme ils peuvent endommager ou detruire les parois des cellules. De cette oxydation provient l'alteration de l'ADN et le vieillissement cellulaire qui est a la base de certaines maladies comme l'atherosclerose et le cancer.

L'organisme pour se defendre possede des agents neutralisant les radicaux libres qui sont les enzymes tel que la super-oxyde dismutase et les vitamines "anti-oxydantes" C, E, A, les bioflavonoIdes, les vitamines du groupe P comme les pigments vegetaux qui ont un effet protecteur "le béta-carotene".

A travers cette etude, on peut dire que les plantes etudiees possedent des pouvoirs antiradicalaires importants.

Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante

Bibliographie

· Abdelghafour Marfak, le 12 Decembre 2003, Radiolyse gamma des flavonokles. etude de leur reactivite avec les radicaux issus des alcools : formation de depsides, p 30-34 (these de doctorat), l'Universite de Limoges, Ecole Doctorale Sciences Biologie Sante, Faculte de Pharmacie.

· B. Aurousseau, 2002, les radicaux libres dans l'organisme des animaux d'elevage : consequences sur la reproduction, la physiologie et la qualite de leurs produits, INRA Prod. anim.

· Dong-Sun LEE, Nam-Soon KIM and Sang-Han LEE, 2001, 2, 2-Dipheny1-1- picrylhydrazyl Hydrate, a Stable Free Radical, Is an a-Glucosidase Inhibitor, J Biological & pharmaceutical bulletin, Volume 24, No 6, pp 727-728.

· JM Gutteridge, 1993, Free radicals in disease processes: a compilation of cause and consequence. J Free Radical Res Commun, Volumel9, pp 141-158.

· ICristiina Pelli et Marika Lyly, janvier 2003, les antioxydants dans l'alimentation, Biotechnology Finlande.

· Masahiro Nishizawa, Masahiro Kohno, Minemitsu Nishimura, Akio Kitagawa, and Yoshimi Niwano, 2005, Non-reductive Scavenging of 1, 1-Dipheny1-2- picrylhydrazyl (DPPH) by Peroxyradical: A Useful Method for Quantitative Analysis of Peroxyradical, J Chemical and pharmaceutical bulletin, Volume 53, No 6, pp 714716.

· Novelli GP, 1997, Role of free radicals in septic shock. J Physiol Pharmacol, Volume 48, pp 517-527.

Conclusion générale

Les plantes medicinales restent toujours la source fiable des principes actifs connus par leurs proprietes therapeutiques, ce qui nous amen a la conservation de la biodiversite vegetale locale.

Et comme la phytotherapie suscite un renouveau d'interet, nous nous sommes interesses dans ce travail a Petude des extraits phenoliques de quelques plantes medicinales locales de divers familles botaniques connues par leurs utilisations dans la medecine traditionnelle.

Dans ce travail, par Petendue des domaines de recherches impliques se voulait une contribution a la connaissance de certaines plantes appartenant a diverses familles. Il visait a evaluer les potentialites bioactives du plus grand nombre d'especes afin de les selectionner pour une etude chimique approfondie.

Dans un premiers temps, nous avons evalue la quantite des phenols totaux en adoptant la methode de Folin -Ciocalteu, les resultats montrent que les plantes etudiees sont relativement pauvres en ces composes comparativement a d'autres plantes medicinales locales déjà etudiees auparavant dans notre laboratoire. De méme nous avons dose les flavonokles par la methode de Zhishen et al (complexation des flavonokles avec le trichlorure d'aluminium en presence du nitrite de sodium dans un milieu alcalin), le pourcentage des flavondides dans les extraits phenoliques est relativement moyen.

Dans le but de trouver des plantes possedant des effets inhibiteurs sur trois enzymes a savoir: Pa- amylase, la trypsine et la lipase, nous avons etudie l'effet des extraits des plantes investiguees sur ces enzymes par des methodes colorimetriques simples.

Les extraits des plantes: Atractylis serratuloides, Plantago ciliata et Ifloga spicata sont doues d'un pouvoir inhibiteur de Pa- amylase d'Aspergillus oryzae de types non competitif et incompetitif avec des valeurs de K_i = 46 et 58 11,A4 respectivement.

Un seul extrait des plantes etudiees: Astragalus vogelii fatimensis est un bon inhibiteur de la trypsine pancreatique bovine de type non competitif et de K_i = 16 gM.

La lipase est inhibee par deux extraits de plantes: Astragalus vogelii fatimensis et Ifloga spicata.

Dans un dernier temps, nous nous sommes interesses a etudier Pactivite antioxydante des extraits des plantes dans le but de connaitre leurs capacites antioxydantes et leurs pouvoirs inhibiteurs des enzymes.

Le pouvoir antiradicalaire des extraits vis-à-vis du radical DPPI-1* est important, les valeurs des EC₅₀ varient de 5.8 a 15.4 mg/ml ce qui nous permet de dire que les plantes etudiees sont une source prometteuse des antioxydants naturels. Par contre aucune correlation positive a ete prouvee entre Pactivite antioxydante et l'effet inhibiteur d'enzyme. Ceci indique

que l'effet inhibiteur d'enzyme est independant de la quantite des composes phenoliques ainsi que de leur pouvoir antioxydant.

Ce resultat prouve l'idee que l'activite enzymatique depend de la structure chimique de l'inhibiteur (relation activite - structure).

L'ensemble de ce travail nous a permet de mieux cormaitre Pinter& de l'etude des plantes medicinales de notre region. Les resultats obtenus repondent a beaucoup de questions sur l'utilisation de ces plantes en medicine traditionnelle.

Sans doute de nombreuses perspectives peuvent étre envisagees qui se resument dans l'isolement et l'identification des molecules bioactives responsables a l'inhibition enzymatique.



Index des noms latins

Le nom scientifique Atractylis serratuloides

Astragalus armatus Astragalus vogelii fatimensis

Haloxylon scoparium

Helianthemum lippii Plantago ciliata

Ifloga spicata

La famille Compositae Legumineuse Fabaceae Chenopodiacees Cistaceae Plantaginaceae Asteraceae

.DPPH'

Résumé: La phytotherapie est une medecine traditionnelle utilisee par la population, elle est aussi la connaissance et l'utilisation des proprietes therapeutiques des plantes dues generalement aux metabolites secondaires "principes actifs". Dans le cadre de ce travail nous nous sommes interesses aux extraits phenoliques de quelques plantes medicinales locales et leur effets sur les enzymes: l'a- amylase, la trypsine et la lipase. La premiere partie de cette etude concerne les modes d'extraction et la quantification des composes phenoliques, d'apres les resultats nos plantes montrent des teneurs faibles en phenols totaux (de 0.37 jusqu'i 37 mg/g en equivalent d'acide gallique) et en flavonoIdes (de 0.25 jusqu'i 1.55mg/g en equivalent de la catechine). Dans la deuxieme partie, nous avons etudie l'effet de ces extraits sur l'a- amylase dont on trouve trois plantes ont le pouvoir inhibiteur, la trypsine avec une seule plante inhibante et la lipase avec deux plantes inhibantes. Dans la derniere partie, nous avons cherche une correlation entre le pouvoir antiradicalaire des composes phenoliques d'une part avec la teneur des plantes en polyphenols et d'autre part avec le pouvoir inhibiteur des enzymes, on constate que l'activite antioxydante depend de la structure chimique des phenols totaux et la meme constatations pour l'activite inhibitrice des enzymes. En conclusion, d'autres etudes sont necessaires pour connaitre les structures des composes phenoliques responsables de l'inhibition enzymatique.

Mots des: Plantes medicinales, polyphenols, flavonoIdes inhibition enzymatique, a-amylase, trypsine, lipase, pouvoir antioxydant, DPPH.

Abstract: The traditional medicine or phytotherapy is the art of curing using plants it is also the knowledge of their therapeutic properties due to the secondary metabolites "active ingredients". In this study, we are searching for phenolic compounds in seven medicinal plants of Laghouat suburbs. Firstly we estimated the content of polyphenols in the plants, such as the proportioning of total phenols which was carried out following Singleton and Ross method while the flavonoids were quantified by tri aluminium chloride and sodium hydroxide. Then we studied the effect of these phenolic extracts on a- amylase, trypsin, lipase and also their antioxidant characters using the test of DPPH (free stable radical reduced by polyphenols). The quantitative analysis shows that the total phenols contents lie between 0.37 and 3.7 mg/g equivalent of gallic acid while the flavonoids contents lie between 0.25 and 1.55 mg/g equivalent of catechin. The study of the extracts effects shows that three plants have an inhibiting capacity of a- amylase, one plant for trypsin and two plants for lipase while their antioxidant capacities are weak. According to these results, we resume that enzymatic inhibition can be done with polyphenols which present also an antioxidant capacity. This work shows that medicinal plants in our area should be investigated to better comprehend their therapeutic properties. Further studies are needed to know the relation ship between the chemical structure and the enzymatic inhibition.

Keywords: Medicinal plants, polyphenols, flavonoIds, enzymatic inhibition, a- amylase, trypsin, lipase antioxidant capacity, DPPH.