Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur les enzymes alpha amylase, trypsine et lipase

4. La cinetique enzymatique

4.1. L' activite enzymatique

4.1.1. Reaction catalysee par une enzyme (Bernard Offmann, 2003)

Il y a au moires trois reactions simples:

1. Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)

2. Transformation du substrat lie (ES) en produit lie (EP)

3. Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)

k_i k₂ k₃

+s .₄,¹ ES ...₀"- 7P ...₀"- ' + P

k_d k_₂ k_₃

Figure III.1 : Mecanisme reactionnel de la formation du produit.

Leonor Michaelis et Maud Menten ont deduit de ce modele en 1913 une equation qui predit la vitesse initiale (de formation de P) en fonction de la concentration du substrat:

Equation de Michaelis-Menten

Vo = ^Vmax
^· [ S ]

[ S ] + Km

Tel que K_M est la constante de Michaelis- Menten, et V_max est la vitesse maximale de la reaction enzymatique.

Dont sa representation graphique est port& dans la figure. 111.2.

6 5 4 3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure 111.2. Graphe de Michaelis-Menten: vo en fonction de [S]

4.1.2. Linearisation de l'equation de Michaelis-Menten

Il est difficile de placer correctement a la main une hyperbole dans un graphe. On se trompe tres facilement sur la hauteur de V_max. Pour simplifier revaluation des resultats, on utilise une transformation de l'hyperbole en droite. La plus connue est la transformation en doublereciproque de Lineweaver et Burk :

1 / Vo = 1 / V_max + (KM / V_max)
· 1 / [S]

Cette equation represente une droite de pente K_M / V_max

L'intersection sur l'axe vertical est 1 / V_max et sur l'axe horizontal 1 / K_M.

11 v ₀ = ^{1 1 v}max + ^(KM ^{1 v}max ). ^{1 1} [ ^s ]

0 I 2 3 4 5

Figure III. 3. Graphe de Lineweaver-Burk: 1/Vo en fonction de 1/[S].

Cette representation permet d'estimer les constantes a l'aide de papier millimetre et d'une regle. Elle a cependant le defaut de dormer trop de poids aux valeurs experimentales les plus imprecises, celles des plus petites concentrations de substrat.

4.2. L'inhibition enzymatique

4.2.1. Les inhibiteurs

De nombreuses substances modifient l'activite enzymatique en se combinant a elle, ce qui altere la liaison de substrat et/ou son turnover. Les substances qui diminuent l'activite enzymatique de la sorte sont appelees des inhibiteurs.

Beaucoup d'inhibiteurs sont des molecules de structure voisine du substrat de leur enzyme, mais qui soft ne reagissent pas, soient elles reagissent tres lentement. De telle substance sont frequemment utilisees pour elucider la nature chimique ou conformationnelle d'un site de liaison du substrat, afin de determiner le mecanisme catalytique de l'enzyme. De plus, beaucoup d'inhibiteurs d'enzymes sont des agents chimiotherapeutiques efficaces car un analogue de substrat "non naturel" peut bloquer l'action d'un enzyme. Par exemple, le methotrexate (appele aussi l'aminopterine) ressemble chimiquement au dihydrofolate. Le methotrexate se lie fortement a la dihydrofolate reductase, ce qui l'empéche d'assurer sa fonction physiologique, la reduction du dihydrofolate en tetrahydrofolate.

Les inhibiteurs d'enzyme peuvent agir selon des mecanismes varies. Dans cette section, nous allons etudier plusieurs de ces mecanismes parmi les plus simples, et leurs influences sur le comportement cinetique des enzymes qui suivent le modele de Michaelis-Menten (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

4.2.2. Les types d'inhibition :

4.2.2.1. Les inhibiteurs competitifs

Ils se lient de maniere reversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'acces au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]). En general ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme inhibiteurs competitifs reciproques. Les meilleurs inhibiteurs sont souvent en fait des analogues de l'etat de transition de la reaction.

k1 E -1- S k-1 I -1-

K2 ES -Ow E -1- P

k_ilt k__i

El

Figure 111.4 : Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. Dans l'equation de Michaelis-Menten, K_M est remplace par:

Km = K _m
· {-1 + [IFK_I )

Yo
3 --
		v,,,,,/ 2
		,----- ..--
2 --

Oil K₁= k_i/k__i est la constante de dissociation de l'inhibiteur. Le K_M apparent augmente donc, it y a perte apparente d'affinite pour le substrat. Cependant un supplement de substrat peut compenser cette inhibition et la vitesse maximale Vmax reste la méme.

5 --

4 --

,-----------17:: - --

_---------

,

Kri-

Km^.

Kr_i

1

4 5 6 7 13 9

I

1

Figure 111.5. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur competitif.

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a 1/[S] = 0 : 1N _max est donc le méme, mais -1/Km est de plus en plus petit (fleches colorees), alors que la pente augmente.

Figure 111.6. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee competitivement decrite dans la Figure 111.5 Notez que toutes les droites se coupent sur l'axe

1/V₀ a 1 ^/Vmax^.

Exemples de medicaments: Le methotrexate, un analogue structurel du tetrahydrofolate, est un inhibiteur competitif de la dihydrofolate reductase, sur laquelle it se fixe 1000x mieux que le substrat naturel. C'est un medicament anticancereux (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.2. Inhibition incompetitive

Dans l'inhibition incompetitive, l'inhibiteur se lie directement au complexe enzyme-substrat, sans pouvoir se fixer a l'enzyme libre (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

k_{i 2}

E +S _NI^N''' ES -11^.- E + P 1(_{4 +1}

^kil_rt k-js

^PSI

Figure 111.7: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans ce cas, V. et K_M diminuent du méme facteur (1 + [WIC_'s), alors que K_M / V. reste inchange. L'affinite apparente de l'enzyme pour le substrat augmente donc : (Bernard Offmann, 2003).

^Villa; -- ^Vmax ^{i (1} + ^[I]1KIs )

Km = Km i ti + [1]1K_is )

0 4 b 8 10

Figure 111.8. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur incompetitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites paralleles de pente constante K_M / V.

Chapitre III: les enzymes

0

2

- 0_5

0_5

Figure 111.9. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee incompetitivement decrite dans la Figure 111.8 (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.3. Les inhibiteurs non-competitifs

Its se lient de maniere reversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empéchent pas l'acces. Il s'agit donc d'inhibiteurs allosteriques, c'est-à-dire agissant a un autre (allo-) site.

K1 2

E + S ..₄^10
· ES -lo^. E + P

k-1

+ I +I

k_ilt k__i kisif k-is

kli

El ₄₁^11P' ESI

k.11

Figure III.10: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans le cas particulier oil la fixation de l'inhibiteur ne modifie pas la fixation du substrat, ou reciproquement = K_is et K_i = l'inhibiteur (dit "non-competitif pur") diminue [E]_T sans modifier la repartition entre enzyme libre et lie. Dans ce cas, c'est V. qui est remplacee par:

^vmax = ^vmax ^I (¹ + [I]/K_I )

Le K_M reste constant, mais it y a perte apparente de concentration d'enzyme, donc reduction de V..

vo

a 2 3 ! 7 B 9 10

Figure III.1 1. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur non competitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a -1/K_M

1.5

2

Figure 111.12. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee non competitivement decrite dans la Figure III.11 (Bernard Offmann, 2003).