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Régénération via l'organogénèse ou l'embryogénèse somatique chez le Scorpiurus

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par fatima zohra hamdani
Univeristé hassiba ben bouali de chlef - magister 2001
  

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2.3.2 Aptitude à la caulogenèse

On désigne par le terme caulogenèse, la néoformation de bourgeons de manière directe ou indirecte à partir des différents types d'explants.

2.3.2.1- Description morphologique

Après la mise en culture des explants provenant des différents génotypes ; on assiste à la néoformation de bourgeons qui peut se faire selon deux voies exclusives :

Dans certains cas, des bourgeons prennent naissance directement sur la surface de l'explant sans passer par le stade cal. Généralement, après 3 à 5 jours de culture, des zones verdâtres apparaissent à la surface des explants. On assiste, par la suite, à un gonflement superficiel de l'épiderme, qui entraînera son déchirement et finira par crée une petite entrave à travers laquelle sortira les premières primordias foliaires des bourgeons néoformés(Planche 7: A). On note par ailleurs, que la formation directe des bourgeons néoformés n'est cependant possible qu'avec les explants d'hypocotyles .

Dans d'autres cas, les explants développent, après une semaine de culture , des cals compacts et de coloration verdâtre. Souvent, les cals surmontés d'un amas de petites cellules blanchâtres présentent de grandes prédispositions à la caulogenèse. Ces petites cellules blanchâtres dispersées sur les cals peuvent constituer donc un marqueur (ou indice) morphologique de bonnes aptitudes à la caulogenèse. Ce n'est qu'à partir du 15 éme jour de culture, que des primordia foliaires (des futures bourgeons néoformés) commencent à se différencier à partir des structures nodulaires réparties sur les cals (Planche 7:B,C et D). Vers le 25 éme jours, les cals peuvent être entièrement envahies par des touffes de bourgeons (Planche 7 : E).

Il est important de rappeler par ailleurs, qu' il existe des endroits privilégiés à l'apparition des nouveaux bourgeons comme les zones de blessures par exemple.

A

B

C

D

E

Planche 7: (A) Néoformation de bourgeons directement sur les explants d'hypocotyles. Aspect des nodules méristématiques différenciées après 7 jours (B), 10 jours(C) et 15 jours (D)de culture, sur des cals provenant d'explants d'hypocotyles. (E) Développement de bourgeons néoformés en touffe sur le milieu d'induction D0,1B3 (milieu pourvu de 3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).

2.3.2.2 Amélioration de l'induction de la caulogenèse

Après avoir confirmé la possibilité d'obtenir des bourgeons néoformés avec l'espèce Scorpiurus, lors des essais priliminaires, nous assaillons, cette fois-ci, d'améliorer la production en testant trois facteurs essentiels à savoir la composition hormonale des milieux, la nature de l'explant et le génotype.

2.3.2.2.1 - Influence de la composition hormonale du milieu

La nature et la concentration des régulateurs de croissance employé dans le milieu de culture peut influencer considérablement l'organogenèse. Partant de ce constat, nous avons testé l'influence d'un certain nombre de régulateurs de croissance à savoir : trois (3) auxines (2,4-D, AIA et ANA ) et deux (2) cytokinines (BA et Kinétine). Leur apport, dans le milieu, peut être effectué seul ou combiné et à différentes doses.

Les résultats de la caulogenèse, obtenus avec l'ensemble des milieux ayant exprimé un pouvoir inducteur et ceci quel que soit le génotype ou le type d'explant testé, sont représentés dans le tableau 8. Après lecture de ces résultats, nous pouvons retenir que seules les combinaisons 2,4-D x BA , 2,4-D x Kin , AIA x BA et l'AIA x Kin se révèlent favorable à la caulogenèse mais en général se sont les combinaisons à 2,4-D x BA qui fournissent les meilleures réponses. Les combinaisons faites avec l'ANA se sont montrés totalement inefficaces.

Les résultats du tableau 8, nous enseigne une fois de plus sur l'inefficacité de l'usage seul des auxines ou des cytokinines dans le milieu de culture vis à vis de la caulogenèse.

Dans ce volet, les résultats de l'analyse statistique (comparaison de moyennes) pour comparer les rendements moyens en bourgeons par milieu, en se basant sur le test de NEWMAN et KEULS, révèlent l'existence de deux groupes homogènes :

le 1er groupes, à rendement élevé, renferme les milieux D1B3 et D0,1B3 

le 2 eme groupe, à rendement moyen à faible, englobe les milieux D0,5B0,5 ; D0,5B1 ; D0,5B3 ; A20K11 ; D1B5 ; D0,1 B0,5 ; D0,5 K0,1 et A20 B0,1.

Tableau 8 : Effet de la composition hormonale du milieu sur la caulogenèse . Les résultats sont obtenus après 4 semaines de cultures (quelque soit le génotype ou l'explant testé) . A et B désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Composition hormonale du milieu

Nombre moyen de bourgeons /explant(A)

Pourcentage d'explants caulogène(B)

Rendement

(AxB)

D1B3

D0,1B3

D0,1B0,5

D0,5B0,5

D0,5B1

D0,5B3

D1B5

D0,5K0,1

A20B0,1

A20K11

4.07+2.05

5.41+1.78

1.71+2.27

0.95+2.52

0.69+1.47

1.06+2.81

3.58+3.57

1.26+1.72

1.12+1.96

3.59+3.58

43.98

44.90

01.57

01.68

15.90

04.71

06.14

00.48

00.89

00.27

1.790A

2.430 A

0.027 B

0.16 B

0.080 B

0.050 B

0.22 B

0.0061 B

0.010 B

0.010 B

2*** = 60.96 DDL = 8 (significatif au seuil =0.001)

2.3.2.2.2- Recherche d'explants plus performants

Nous avons tenté, dans cette partie du travail, de tester les performance, en terme de production de bourgeons, des différents types d'explants et ceci quel que soit le génotype ou le milieu de culture utilisée (en particulier sa composante hormonale).

Les résultats de cette étude sont présentés dans le tableau 9

Tableau 9 Variation des aptitudes caulogène des explants . Les résultats sont relevés après 4 semaines de la mise en culture des explants (quelque soit le milieu ou le génotype testé).

Explant

Pourcentage d'explants

Caulogéne (B)

Nombre moyen de bourgeons / explants (A)

Rendement

(AxB)

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

24.79

30.75

39.54

1.327 + 1.34

0.80 + 1.59

0.687 + 1.338

0.329

0.246

0.271

2*** = 25.40 DDL=2 (significatif au seuil =0.001).

Comme on peut le constater, l'ensemble des explants testés (cotylédons, hypocotyles et racines) réagissent, de façon presque similaire, à la caulogenèse. Ainsi, et en dépit de la différence apparente qui existe, le test de NEWMAN et KEULS n'a pas décelé de différence significative entre les rendements. On note cependant que les explants d'hypocotyles ont une production de bourgeons par explants supérieures à celle des cotylédons et des racines. Par contre, le pourcentage d'explants caulogènes des cotylédons et des racines est supérieur à celui des hypocotyles. La corrélation entre le pourcentage d'explant caulogène et le nombre moyen de bourgeons / explant est négatif (R= - 0.745).

2.3.2.2.3- Recherche d'un génotype

Les travaux entrepris dans cette étude , consistent à tester l'aptitude à la caulogenèse des huit génotypes sur tous les milieux ayant manifesté un pouvoir inducteur .

A la lecture des résultats du tableau 10, nous constatons que l'ensemble des génotypes répondrait favorablement à la caulogenèse. Cependant, les réponses varient d'un génotype à un autre .On distingue, selon le test de NEWMAN et KEULS, trois groupes de génotypes . Un premier groupe, constitué du génotype V6 , présente les meilleures aptitudes. Un deuxième , à faible aptitude caulogène, regroupe le B1, le B6 et le B8 . Le reste des génotypes se situent entre ces extrêmes et correspondent au troisième groupe.

Tableau 10  :Aptitudes des huit génotypes de Scorpiurus à la caulogenèse . Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants ( quelque soit le milieu ou l'explant utilisé) . A et B désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Génotypes

Nombre moyen de bourgeons /explant (A)

Pourcentage d'explants caulogène (B)

Rendement

(AxB)

V6

V12

V13

L26

L3

B1

B8

B6

7.49+1.458

8.77+3.710

5.43+1.618

6.02+2.98

6.23+3.03

3.45+3.98

2.03+0.01

6.47+3.63

14.95

08.80

11.18

08.97

13.96

01.44

02.93

01.47

1.12 A

0.77 B

0.60 B

0.54 B

0.87 B

0.05 C

0.059 C

0.095 C

2** = 24.11 DDL =7 (significatif au seuil =0.01)

En ce qui concerne le nombre moyen de bourgeons par explant, on remarque qu'il dépend lui aussi du facteur génotypique. En effet, des génotypes comme le V12 et le B6 parviennent à produire un nombre élevé de bourgeons par explant comparativement au reste des génotypes. Sur ce chapitre, on enregistre que les écart types sont moins importants pour certains génotypes ; c'est le cas des cultures issues des V6,V13 et B8 qui affichent une certaine homogénéité par rapport aux autres.

2.3.2.2.4 Etude des interactions de l'explant , du génotype et de la composition hormonale du milieu sur la caulogenèse

2.3.2.2.4.1 - Effet de l'interaction (génotype * explants)

Dans cette partie du travail, nous avons essayé de connaître l'incidence que peut avoir l'interaction génotype * explant sur la caulogenèse .Le tableau 11 où sont présentés les résultats ayant trait à cela, mettent en évidence le degré d'influence, de ce paramètre, sur la néoformation de bourgeons. Ainsi, nous constatons que, certains explants comme les hypocotyles et les racines des génotypes B1,B6 et B8 se montrent incapables de produire des bourgeons, contrairement aux cotylédons qui eux, réagissent très favorablement et ceci quel que soit le génotype testé. Nous constatons aussi, qu'avec certains génotype comme leV12,leV6, leV13,le L26 et le L3, l'ensemble de leurs explants réagissent positivement à ce processus.

En terme de rendement, les meilleurs résultats (0.753) sont obtenus avec les explants d'hypocotyles du génotype V6.

Tableau 11 : Influence de l'interaction génotype * explant sur la caulogenèse. Les résultats sont obtenus après 4 semaines de culture.

Génotype

Explants

Pourcentage d'explant Caulogéne (B)

Nombre moyen de bourgeons / explants (A)

Rendement

(AxB)

V12

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

43.84

28.11

5.54

1.30+1.99

0.97+1.92

1.06 +2.01

0.570

0.272

0.05

V13

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

25.45

15.96

5.83

1.75+2.60

0.93+2.18

0.76+2.14

0.446

0.148

0.044

V6

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

23.53

37.33

06.84

3.20+3.71

0.99+2.14

2.13+3.63

0.753

0.369

0.145

B1

Cotylédon

06.73

0.40 + 1.13

0.026

B6

Cotylédon

04.68

1.19+2.31

0.055

B8

Cotylédon

04.75

0.48+0.99

0.022

L26

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

22.38

03.14

04.12

1.34+2.84

0.66+1.87

0.82+2.32

0.30

0.02

0.033

L3

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

16.97

03.82

06.60

2.54+2.80

0.88+2.51

1.21+2.15

0.438

0.030

0.080

2*** = 929.96 DDL = 10 (significatif au seuil =0.001,pour tout milieux confondus )

La comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS met en évidence l'existence de 10 groupes homogènes. Le classement par ordre décroissant des rendements est le suivant.

V6H>V12H>V13H=L3H=V6C>L26H=V12C>V13C>V6R>L3R>V12R=V13R= B6C >L26R= L26C = L3C= B1C=B8C.

La corrélation entre le nombre de bourgeons et le pourcentage caulogène varie d'un génotype à un autre. Elle est très importante pour le génotype L26 (R = 0.96) , L3(R=0.95) et V13( R= 0.85) et moyenne pour les génotypes V12(R=0.66) et V6(R=0.61).

2.3.2.2.4.2- Effet de l'interaction (composition hormonale du milieu* explant)

Dans cette partie, nous avons essayé de vérifier l'existence ou pas de corrélation entre la nature de l'explant et la composition hormonale du milieu et ceci quel que soit le génotype.

En se réfèrant au tableau 12, nous remarquons que l'ensemble des explants réagissent différemment selon les milieux testés. En effet ,seuls les milieux à concentration élevée en BA permettent une induction caulogène quel que soit la nature de l'explant mis en culture. Les milieux en question, sont représentés par le D1B5 , le D1B3 et le D0,1B3. Le reste des milieux permettent cette induction mais seulement avec certains type d'explant, le plus souvent, l'hypocotyle .

Sur ce sujet, la séparation des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS a pu mettre en exergue des différences significatives entre les rendements moyens obtenus sur totalité des milieux testés . Les meilleurs rendements sont enregistrés sur les milieux D1B3 et D0,1B3, . Le classement par ordre décroissant des rendements moyens obtenus pour chaque milieu est le suivant :

D0,1B3H>D0,1B3R>B3D1C=D1B3H=D0,1B3C>D1B3R>D1B5H>D1B5R=A20B0,1H>=D0,5B0,5H=D0,5B0,5R=D1B5C>D0,5B0,1C=A20K11H=D0,5K1H>D0,1B0,5H=D0,5B1C=D0,1B0,5R.

On remarque par ailleurs, qu'il existe, en se servant de certain milieu, comme le D1B3, une corrélation négative (R= - 0.89) entre le pourcentage caulogène et le nombre moyen de bourgeon par explant ; l'usage d'autres milieux comme le D0,1B3 conduit lui, à une corrélation positive (R=0.64).

Tableau 12 : : Aptitude caulogène des explants en fonction de la composition hormonale du milieu ( quelque soit le génotype testé). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition

Hormonale

Du milieu

Explants

Pourcentage d'explants

Caulogéne (B)

Nombre moyen de bourgeon/ explant(A)

Rendement

(AxB)

D1B5

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

05.60

04.07

10.57

2.075 + 0.5

0.82 + 0.066

0.69 + 0.176

0.1166

0.0334

0.033

D1B3

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

64.00

41.40

43.40

3.28 + 0.89

5.55 + 3.19

3.37 + 1.32

02.10

02.30

01.80

D0,5 B3

Hypocotyle

4.41

1.06 + 0.15

0.0471

D0,1 B3

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

51.50

42.00

53.60

6.32 + 1.93

4.78 + 1.57

5.31 + 1.87

3.26

2.01

2.25

D0,5 B1

Hypocotyle

Cotylédon

02.67

08.85

0.56 + 1.073

0.131 + 1.768

0.015

0.0116

D0,5 B0,5

Racine

03.54

0.953 + 0.05

0.0338

D0,1 B0,5

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

02.82

01.83

04.15

00.41 + 0.176

1.091 + 0.033

0.20 + 0.01

0.0116

00.02

0.0083

D0,5K1

Hypocotyle

01.23

1.26 + 0.649

0.0156

A20B0,1

Hypocotyle

05.56

1.127 + 0.272

0.0627

A20K11

Hypocotyle

02.50

0.656 + 0.81

0.0165

2*** = 67. 12 DDL = 2 (significatif au seuil =0.001 ).

2.3.2.2.4.3 Effet de l'interaction (génotypes * composition hormonale)

En abordant la question des interactions, nous avons essayé de connaître, cette fois-ci, si les milieux testés interagissent avec les différents génotypes et cela quel que soit la nature de l'explant utilisé .

A la lumière des résultats présentés dans le tableau 13, nous constatons qu'il existe réellement un effet interaction (milieu * génotype) sur la caulogenèse. De manière générale, l'ensemble des génotypes testés expriment des potentialités caulogènes. Néanmoins, ces potentialités paraissent varier en fonction de la composition hormonale du milieu. En effet, certains milieux tels le D0,1B3 , le D1B3 ou le D1B5 possèdent un large pouvoir inducteur , ce qui a permis d'ailleurs, à un grand nombre de génotype de s'exprimer favorablement à la caulogenèse. D'autres milieux comme le D0 ,5B3 ; le A20B0,1 ou le A20K11, permettent à un ou au plus à deux génotypes de s'exprimer.

D'après les résultats de l'analyse statistique, aucune corrélation n'a été décelé entre le pourcentage caulogène et le nombre moyen de bourgeons par explant sur les milieux D0,1B3 (R=0.39) , D1B3(R=0.21). Par contre, elle est très importante sur le milieu D1B5(R = 0.92).

Tableau 13: Aptitude caulogène des huit génotypes de Scorpiurus en fonction de la composition hormonale du milieu (quelque soit l'explant testé). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition

Hormonale du milieu

Génotype

Nombre moyen de bourgeons /explant (A)

Pourcentage d'explant caulogène (B)

Rendement

(AxB)

D0,1B3

V12

V13

V6

L26

L3

11.42+1.04

6.87+1.67

9.31+2.58

10.16+3.17

6.00+2.51

58.66

37.33

54.22

30.66

34.21

6.69

2.56

5.04

3.11

2.05

D1B3

V13

V6

B6

B1

B8

L26

L3

6.52+2.54

7.76+1.68

1.53+0.82

2.4+2.59

2.03+1.88

4.66+1.12

7.64+3.79

48.87

55.00

11.10

15.10

12.00

36.00

58.22

3.18

4.26

0.17

0.36

0.24

1.67

4.45

D0,5 B0,5

V6

B6

7.625+1.65

9.375+1.27

03.50

03.50

0.27

0.332

D1 B5

V13

V12

V6

B1

L3

2.75+1.023

6.15+0.966

4.28+1.001

4.5+1.63

11.04+1.026

01.70

05.70

03.10

01.70

10.60

0.04

0.35

0.132

0.076

1.170

D0,5B3

A20 B0,1

D0,5B1

D0,5B1

D0,1K0,1

A20K11

A20K11

V6

V13

L3

B6

B6

L26

L3

8.5+1.274

5.61+0.766

4.5+1.073

10.5+1.768

4.5+1.06

3.25+1.138

2.00+0.5

04.43

08.00

02.60

14.40

00.80

01.77

01.77

0.376

0.448

0.117

1.197

0.036

0.057

0.035

2 = 18.11NS DDL =20 ( Non significatif).

2.3.2.2.4.4 Effet de l'interaction (composition hormonale du milieu * explant * génotype).

Après avoir testé l'influence des interactions entre de deux paramètres, nous étions amené, dans un dernier essai, à tester l'effet que peut avoir l'interaction entre trois paramètres (composition hormonale * explant * génotype) sur la caulogenèse. Compte tenu du nombre élevé de répétitions ayant des rendements nuls, dans nos résultats, et qui peuvent poser d'énormes difficultés dans le calcul statistique, nous nous sommes limités donc, dans ce travail, à tester seulement deux milieux de culture D0,1B3 et D1B3 sur l'ensemble des génotypes et des explants.

Le tableau 14 regroupe les observations faites des expériences précédentes sur les milieux D1B3 et D0,1B3, déterminant la production caulogène en fonction à la fois de la composition hormonale du milieu, du génotype et de l'explant.

A travers ces résultats, il apparaît que les meilleurs rendements sont obtenus avec les explant d'hypocotyles du génotype V12(9.78) et sur le milieu D3B0,1. Les plus faibles rendements sont enregistrés respectivement avec les explants de cotylédons du génotype V13 et L26 ainsi que les explants de racines du génotype L3.

Afin de proposer une évaluation quantitative de l'aptitude à la caulogenèse des différents milieux testés, nous étions amené à se servir des méthodes statistiques classiques. Dans ce cadre, nous avons effectué une analyse de variance, à partir du rendement de chaque boite de pétri. Les résultats sont prélevés après 4 semaines de culture. Elle correspond à un model complètement aléatoire à 5 répétitions et à 3 facteurs croisés.

· Le facteur composition hormonale du milieu à 2 niveaux : D0,1B3 et D1B3.

· Le facteur génotype à 8 niveaux : V12,V13,V6,B1,B6,B8,L26 et L3.

· Le facteur explant à 3 niveaux : hypocotyle ,cotylédon et racine

Tableau 14: Aptitudes caulogènes des explants des huit génotypes cultivés sur milieux de cultures D0,1 B3 (3 mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4D) et D1 B3 ( 3 mg/l de BA et 1 mg/l de 2,4-D). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition Hormonale du milieu

Génotype

Explants

Nombre moyen de bourgeons /explant (A)

Pourcentage caulogène (B)

Rendement

(AxB)

D1B3

L26

Hypocotyle

5.81+0.54

38.72

2.25

Cotylédon

4.10+0.047

33.17

1.36

Racine

4.06+0.80

61.82

2.51

L3

Hypocotyle

6.73+1.62

64.48

4.34

Cotylédon

9.27+1.21

38.29

3.55

Racine

6.93+2.82

58.87

4.08

V13

Hypocotyle

6.32+8.04

75.15

4.75

Cotylédon

6.47+1.04

24.88

1.61

Racine

6.77+1.15

48.39

2.87

V6

Hypocotyle

7.41+8.17

73.27

5.43

Cotylédon

6.70+0.98

37.91

2.54

Racine

9.18+2.11

53.92

4.95

B 1

Cotylédon

7.20+5.46

66.80

4.81

B6

Cotylédon

4.6+1.29

36.30

1.67

B8

Cotylédon

6.10+2.06

46.22

2.82

D0,1 B3

V12

Hypocotyle

12.79+3.62

76.46

9.78

Cotylédon

11.40+0.56

44.73

5.10

Racine

10.06+0.73

55.46

5.58

V13

Hypocotyle

8.25+0.94

27.15

2.24

Cotylédon

5.44+0.20

24.08

1.31

Racine

6.92+3.57

73.69

5.10

V6

Hypocotyle

10.36+3.20

67.27

6.97

Cotylédon

6.84+2.35

69.15

4.73

Racine

10.74+2.92

66.85

7.18

L26

Hypocotyle

11.88+1.68

31.22

3.71

Cotylédon

7.85+0.75

30.57

2.40

Racine

10.74+1.65

33.33

3.58

L3

Hypocotyle

7.26+2.26

46.14

3.35

Cotylédon

6.73+1.98

38.18

2.57

Racine

4.00+0.85

33.75

1.35

Les résultats de l'analyse de variance sont présentés dans le tableau 15. Ils montrent sans ambages l'existence d'une différence qui peut être, dans certains cas, très hautement significative comme, c'est le cas avec le facteur génotype, de l'interaction (composition hormonale * génotype) ou (génotype * explant ), dans d'autres, hautement significative comme pour le facteur  composition hormonale et l'interaction (composition hormonale * génotype * explant) ou simplement significative comme c'est le cas avec l'interaction (composition hormonale * explant). Cependant certains facteurs comme l'explant n'enregistre aucune différence.

Tableau 15 : Tableau d'analyse de la variance à 3 facteurs croisés .

Source de variation

Somme des carrés

D.D.L

Carré moyen

F. calculé

Var . totale

Var. Milieux

Var. Génotype

Var. Explant

Var. Milieux X Génotype

Var. Milieux X Explant

Var. Génotype X Explant

VAR.Milieux X Génotype X Explant

Var . Résiduelle

1915.78

24.67

637.49

11.31

411.47

25.75

171.12

98.16

535.81

239

1

7

2

7

2

14

17

192

8.02

24.67

91.07

5.66

58.78

12.88

12.22

7.01

2.79

8.84**

32.63***

2.03 NS

21.06***

4.61*

4.38***

2.51**

NS : Non significatif , * : Significatif au seuil =0.05 , ** : Significatif au seuil =0.01

et *** : Significatif au seuil =0.001.

2.3.2.2.5- Influence de la source carbonée

Toujours dans l'espoir d'améliorer davantage les rendements de nos cultures en terme de caulogenèse, nous avons, dans cette partie, essayé de tester l'influence de la source carbonée. Pour conduire cette expérience nous avons retenu un seul génotype le V12 , compte tenu de ses bonnes performances préalablement manifestées, et pour les même raisons le milieu D0,1 B3 est sélectionné.

Quatre sucres comprenant deux monosaccharides (glucose et fructose) et deux disaccharides (saccharose et maltose) ont été testés. Les résultats observées sont reportées sur le tableau 16 . Comme on peut le constater sur le tableau 16, l'ensemble des sucres testés, induisent une caulogenèse mais à des degrés différents. Le maltose et le saccharose se révèlent très favorable à la néoformation de bourgeons face au fructose et le glucose. Les rendements obtenus avec le maltose et le saccharose sont nettement supérieur au rendement moyen relative à l'essai (3.88)

Tableau 16: Effet de la source carbonée sur la caulogenèse. Les expériences sont conduites avec les explants du génotype V12 ensemencées sur milieu D0,1 B3 (3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture. A et B : Désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Source carbonée

Pourcentage d'explants

Caulogéne (B)

Nombre moyen de bourgeons / explants (A)

Rendement

(AxB)

Maltose

Saccharose

Fructose

Glucose

69.02

59.71

26.21

19.60

11.43+1.39

11.42+1.04

2.67+1.53

0.51+0.52

7.89 A

6.82 A

0.70 B

0.10 B

2*** =73.89 DDL =3 (significatif au seuil =0.001) .

A travers ces premiers résultats nous pouvons dire, avec prudence, que les disaccharides paraissent plus favorables à la caulogenèse que les monosaccharides. La comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS à 5% a permis de classer les sucres par ordre décroissant comme suite: 

Maltose = Saccharose > Fructose = Glucose.

L'entrée en production, des bourgeons néoformés, par les explants semble gagner de précocité lorsque le milieu contient du maltose ou du saccharose. Les bourgeons commencent à apparaître souvent vers le 15 ème qui suit l'ensemencement. En présence de glucose ou de fructose, la néoformation des bourgeons ne démarre qu'à partir du 20 ème jours.

A

B

Planche 8: Bourgeons néoformés , induit à partir d'explants hypocotyles, sur milieux D0,1B3 ( milieu pourvu de 3mg/l de BA et 0.1 mg/l de 2,4-D) contenant 30 g/l du maltose ( A) et du glucose (B).

Les rendements les plus élevés sont obtenus avec les explants d'hypocotyles cultivés en présence de maltose ou du saccharose. Il est à noter par ailleurs, que les explants de cotylédons paraissent incapables de produire des bourgeons sur milieu contenant du glucose (tableau 17).

Tableau 17 : Influence de la source carbonée, sur l'aptitude caulogène des explants du génotype V12. L'expérience est conduite sur milieu D0,1 B3 (3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).Les résultats sont prélevés après 4 semaines de culture. % EC : Pourcentage d'explant caulogène, NMB/E : Nombre moyen de bourgeons par explant et R : Rendement.

Nature de l'explant

Explants

Hypocotyle

Cotylédons

Racine

% EC

NMB/E

R

%EC

NMB/E

R

%EC

NMB/E

R

Maltose

Saccharose

Glucose

Fructose

79.25

76.52

32.20

22.42

14.46+0.86

12.78+1.32

0.59+ 0.80

3.88+2.70

11.46

9.78

0.19

0.87

61.01

44.73

_

2.65

8.67+1.76

11.40+1.11

_

2.00+0.49

5.29

5.10

_

0.53

62.09

55.46

11.82

32.24

11.16+1.70

10.06+0.92

0.93+0.55

2.14+0.84

6.93

5.58

0.11

0.69

2***=73.89 DDL =6 (significatif au seuil =0.001)

2.3.2.3-Conclusion

En guise de conclusion, nous pouvons dire que cette partie de notre travail nous a permis de retenir ce qui suit :

- l'existence d'une variabilité génotypique. Les meilleurs rendements ont été enregistrés respectivement avec les génotypes V6 (1.12) , L3(0.87) et V12 (0.77) quelque soit l'explant et le milieu utilisés

- l'existence d'un effet explant. Les cotylédons semblent plus caulogènes que le reste des explants. Il existe cependant, quelques exceptions ou les explants sont incapables d'induire une caulogenèse ; c'est le cas des hypocotyles et des racines provenant des génotypes B1,B6 et B8.

- L'existence d'un effet milieu (composition hormonale). Dans notre cas, sur

- l'ensemble des 10 milieux testé, seuls les milieux D0,1B3 et D1B3 ont permis d'atteindre de bons rendements en terme de bourgeons néoformés.

- La source carbonée semble, elle aussi, avoir une part d'influence dans le processus. Effectivement, les résultats obtenus en présence de maltose ou de saccharose sont meilleurs que le reste des sucres.

2.4 Aptitude à l'embryogenèse somatique

2. 4.1 Induction et développement de l'embryogenèse somatique

Généralement sur les milieux ayant montré des pouvoirs embryogènes, l'embryogenèse somatique peut être induite soit directement sur l'explant ensemencé soit indirectement (en passant par une phase de callogenèse).

Dans le cas d'une embryogenèse somatique directe (qui se reproduit rarement), les embryons apparaissent sur la surface des explants de racines. Le processus commence tout d'abord par l'apparition de petits gonflements, au niveau de l'épiderme des explants, qui évoluent en petites structures de forme sphérique et à aspect lisse verdâtre. Ces structures traversent, par la suite, les mêmes stades de développement morphologique que traversent habituellement les embryons zygotiques (Planche9: E).

.Dans le cas d'une embryogenèse somatique indirecte, c'est la callogenèse qui se déclenche la première, après 5 jours de culture. Après le 8 ème jour, le cal se développe davantage et présente un aspect hétérogène. A ce moment, on distingue des régions très -chlorophylliennes dispersées sur la surface du cal et à partir duquel se développent de petits corps de forme nodulaire ou globulaire et à aspect lisse verdâtre. Ces corps représentent en fait, des embryons somatiques au stade globulaire (Planche 9:A) et qui sont appelés ,par la suite, à évoluer à d'autres stades : cordiforme (Planche 9:B), torpille (Planche9:C) et cotylédonaire (Planche9:D).

Les embryons somatiques produits présentent souvent des malformations morphologiques (embryons monocotylé, tricotylé, en forme de bouteille.....etc.) (Planche11: A,B,C,D). On enregistre cependant, un faible taux d'embryons somatiques à morphologie normale.

2.4.2 Amélioration de l'induction de l'embryogenèse somatique

2.4.2. 1 Influence de la composition hormonale du milieu

De la même manière qu'en caulogenèse, nous avons essayé de voir, dans cette partie de travail, s'il existe ou non un effet milieu en particulier sa composition hormonale, sur l'induction de l `embryogenèse somatique. A cet effet, nous nous sommes servis de 8 génotypes de Scorpiurus et de divers explants pour conduire cette expérience. Les milieux de culture testés sont pourvus d'un cocktail hormonal composé de deux types de régulateurs de croissance à savoir : les auxines et les cytokinines. Les premiers sont représentés par l'AIA, l'ANA et le 2,4-D et les seconds par la BA et la Kinétine. Ces régulateurs sont apportés aux milieux soit séparément, soit en mélange.

La nature des auxines ou des cytokinines influence considérablement la production d'embryons somatiques quel que soit le génotype ou l'explant utilisé.

L'induction de l'embryogenèse somatique semble être nulle lorsqu'on emploi des milieux à auxines ou à cytokinines seuls et à différentes doses. Ceci est valable avec l'ensemble des concentrations employées mais aussi sur l'ensemble des explants et génotypes testés. Seuls les milieux pourvus d'un mélange hormonal (auxine*cytokinine) semble amorcer cette induction. Ainsi, l'apport du 2,4-D et de l'AIA en mélange avec des cytokinines, notamment la BA et la Kinétine, dans le milieu d'induction permet l'obtention d'embryons somatiques. Comme on peut le constater, les résultats du tableau 19, montrent clairement l'effet de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique et cela sans tenir compte du facteur génotype ou explant utilisé.

Tableau 19 : Effet de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique. Les résultats sont obtenus après 4 semaines de cultures (quel que soit le génotype et explant testé) le pourcentage d'embryons normaux est calculé à partir des embryons qui se différencient sur milieu d'induction.. A et B désignent les groupes homogènes séparés par le TEST de NEWMAN et KEULS au seuil 5%

Composition Hormonale

Du milieu

Nombre moyen de structure embryogène (A)

Pourcentage d'explants embryogène(B)

Rendement

( A x B )

Pourcentage d'embryons normaux

D3B0,1

D0,1B0,5

A20 B1

A20 K0.1

7.79 + 4.37

4.47 + 3.23

4.78 + 3.54

5.56 + 3.60

31.19

22.14

32.42

.26.07

2.67 A

1.15 B

1.69 B

1.59 B

53.00

34.00

76.00

84.00

2*** = 8.94 DDL = 3 (significatif au seuil = 0.001)

B

A

D

C

E

Planche9 : Formation et développement des embryons somatiques: Embryons somatiques obtenu, directement sur explant de racine (A), cal embryogène avec embryons somatiques au stade globulaire(B); au stade cordiforme (C); au stade torpille (D) et au stade cotylédonnaire (E).

Les rendements rapportés dans le tableau 19, montrent que les milieux à 2,4-D x BA sont plus favorables que ceux à AIA x BA ou à Kin x AIA. Malgré les différences apparentes observées entre les rendements obtenus en milieu D0,1B0,5 ; B1A20 ou A20K0.1, l'analyse statistique n'en révèle aucune. Néanmoins, il est clair que le milieu D3B0,1 est plus favorable à la production de structures embryogènes que le reste.

On relève par ailleurs ,en partant des résultats du tableau 19, que la corrélation entre le pourcentage embryogène et le nombre moyen d'embryons par explant est très élevée, sur les quatre milieux testés. Toutefois, la bonne corrélation est enregistrée sur le milieu B0,5D0,1 (R=0.98) ,suivie de B1A20 et de A20K0.1 (R=0.95) et enfin de B0.1D3 (0.81). On note aussi que les écart- types augmentent, quand la moyenne des structures embryogènes par explant augmente. Ceci est dû à la production très irrégulière d'embryons somatique par explant.

La structure morphologique des embryons produits semble elle aussi être affectée par la nature de l'auxine utilisée. En effet, comparativement aux milieux à 2,4-D, les milieux à ANA paraissent favoriser mieux le développement d'embryons normaux. Ainsi, nous constatons que le taux d'embryons somatiques à morphologie normale est plus élevé sur milieu à AIA qu'à 2,4-D. Les principales malformations qui caractérisent ces embryons sont : la monocotylédonie, la tricotylédonie ou l'obtention de structure complètement désorganisée ou en forme de bouteille.

Par ailleurs, il n'est pas inutile de rappeler aussi, que certains milieux, notamment ceux pourvus de 2,4-D x BA, peuvent provoquer à la fois et l'induction de l'embryogenèse et le développement des embryons. Par contre, des milieux renfermant de l'ANA, nécessitent des transferts d'embryons sur milieu dépourvu de régulateurs de croissance pour permettre leur développement.

2.4.2.2- Recherche de l'explant le plus performant

Pour évaluer les potentialités embryogènes des explants en fonction de leur nature, nous avons mené cette expérimentation avec les explants de cotylédons , d'hypocotyles et de racines des huit génotypes. Les milieux d'induction retenus sont le D3B0,1 ; le D0,1B0,5 ; le A20K0.1 et le A20B1 .

Les résultats de cette expérience (tableau 20),nous ont permis de conclure que les hypocotyles suivis des cotylédons possèdent les meilleures aptitudes à l'embryogenèse somatique. En effet le classement du rendement des explants par le test de NEWMAN

B

A

C

D

Planche 10 (suite): Principales anomalies morphologiques des embryons somatique .(A) embryon somatique monocotylé. (B) embryon somatique en forme de font de bouteille. (C) embryon somatiques présentant des fasciations au niveau des hypocotyles .(D) amas d'embryons somatiques complètement désorganisés.

& KEULS met en évidence l'existence de trois groupes homogènes: le premier groupe comprend les hypocotyles, le second les cotylédons et le troisième les racines.

On note par ailleurs que le pourcentage embryogène est proportionnel au nombre moyen d'embryon par explant (R=0.86). Quant, aux écart - types du nombre moyen d'embryons produits par explants et ceci quel que soit le génotype ou le milieu utilisé sont importants.

Tableau 20: Variation de l'aptitude embryogènes des explants ( quel que soit le milieu ou le génotype testé). Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture . A et B : désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5% :

Explant

Nombre moyen d'embryons somatiques/explants (A)

Pourcentage d'explants embryogène (B)

Rendement

(AxB)

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

6,56 + 3.98

6.19 + 4.22

4.21 + 2.70

35.51

29.56

26.36

2.33 A

1.83 A

1.11 B

2 *** = 23.51 , DDL =2 (significative au seuil = 0.001)

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