L'objectif essentiel visé par ce travail consiste
à essayer de régénérer in-vitro des
plantes entières de Scorpiurus via l'organogenèse et
l'embryogenèse somatique.
Pour parvenir à cela, nous avons testé trois
principaux facteurs susceptibles d'influencer la
régénération qui sont le milieu de culture, la nature de
l'explant et le génotype .
Dans des essais que nous avons qualifiés de
préliminaires, nous nous sommes parvenu à choisir un certains
nombre de facteurs liés aux conditions d'expérimentation; tel que
la lumière qui semble être nécessaire à
l'organogenèse et l'embryogenèse somatique chez le
Scorpiurus.. L'obscurité semble défavorisée les
deux processus morphogénétique. L'action favorable de la
lumière sur l'embryogenèse et l'organogenèse a
été signalée par plusieurs auteurs notamment
HALPERIN(1966) ; WEBB et al,(1984) in ROGUET,(1989) et LATKOWSKA
et al., 2000
* Concernant la callogenèse, on constate que la
composition hormonale influence considérablement la taille
(importance), la couleur et la texture des cals produits. Ainsi l'usage des
auxines ou de cytokinines, seul dans le milieu de culture, s'est
révélé incapable d'induire une callogenèse sur
l'ensemble des explants testés et cela quelle que soient leurs origines.
Par contre l'adjonction des auxines, en présence de cytokinines, au
milieu de culture la stimule fortement. Des résultats similaire au
notre ont été signalé par (NITSH et NOUGAREDE,1967) sur le
tabac et (SHENG.L et al.,1998) sur le riz.
Par ailleurs, il est utile de rappeler, dans notre cas, que
la présence du 2,4-D associé à une cytokinine (BA ou
Kinétine) favorise considérablement la callogenèse. A ce
sujet , de nombreux travaux rapportent l'efficacité du 2,4-D,
employé seul ou en association avec une cytokinine, vis à vis de
la callogenèse ( SANGHAMITRA et SUMITRA, 1998 ; JAYASREE, 2001).
L'importance de la callogenèse ne dépend pas
seulement de la nature du régulateur de croissance comme nous venons de
le voir mais aussi de sa concentration. Il faut une dose minimale de 0,1 mg/l
de 2,4-D combiné à 0.1 mg/l de BA ou de Kinétine pour
pouvoir obtenir une induction callogène. Pour parvenir à ce
même résultats, en se servant de l'AIA ou de l'ANA comme source
auxinique, il faut un apport d'au moins de 1 mg/l.
La couleur et la texture des cals varient selon la nature des
régulateurs de croissance. Ainsi, on constate par exemple que les
cals induits sur milieux, où la dose de kinétine est
supérieure à celle de l'auxine (quelle que soit sa nature), sont
généralement de couleur vert claire et de texture friable. Sur le
reste des combinaisons, les cals prennent souvent un aspect chlorophyllien et
une texture compacte.
En plus de l'effet hormonal , la nature de l'explant peut
avoir une incidence considérable sur la callogenèse. En effet,
les explants d'hypocotyles et de cotylédons semblent présenter de
bonnes aptitudes .
Le suivi de la cinétique de croissance des cals nous
a permis de mettre en évidence que la callogenèse est
profondément influencée par le facteur génotypique. Ainsi,
nous constatons que l'ensemble des génotypes appartenant à
l'espèce Scorpiurus vermiculatus réagissent mieux
à la callogenèse que le reste. L'implication du facteur
génotypique en callogenèse a été décrit par
BROWN et MEIJER, (1987) sur la luzerne ; SAADI,(1991) sur le
pois ; KALAMANI et RAMASAMY, (1998) sur sorgho
Le présent travail, nous a aussi permis d'obtenir une
organogenèse, avec une production de bourgeons néoformés
(caulogenèse) et de racines (rhizogenèse), et de
régénérer des plantes entières de
Scorpiurus ..
Concernant la rhizogenèse , les résultats de
notre étude nous ont amené à confirmer une fois de plus le
rôle essentiel que jouent les régulateurs de croissances.
Cependant, on constate, que l'usage des auxines ou des cytokinines seules dans
le milieu d'induction, s'est révélé incapable d'induire
une rhizogenèse sur l'ensemble des explants testés et cela quel
que soit le génotype utilisé. Par contre, l'addition d'un
mélange hormonal (auxines * cytokinines) au milieu
d'induction, lui est très favorable. En effet les meilleures
réponses sont enregistrées sur les milieux où sont
combinés les AIA x Kin ou AIA x BA aux doses respectives: 20 mg/l d'AIA
et 0,1 mg/l de Kinétine ou de BA. Cette association hormonale semble
faire bonne recette même sur d'autres espèces telle que le poivre
(CHRISTOPHERE et RAJAM, 1996) ou le prunus (DRUART et al
,(1998).
Il n' y a pas que l'AIA qui se montre bénéfique
pour la rhizogenèse, le 2,4-D aussi, seulement son importance reste
limité. Seul l'ANA affiche une incapacité d'induire ce
processus.
Toujours dans le volet rhizogenèse , nous avons
relevé que la nature des régulateurs naissance à des
racines blanches et poilues moins vigoureuses. Les travaux confirmant cela
sont rapportés par plusieurs auteurs notamment HOBBIE (1998)sur
Arabidopsis ;DRUART et al ,(1998) sur prunus.
Contrairement à nos résultats de nombreux auteurs
mentionnent l'action favorable de l'ANA sur la rhizogenèse en
particulier chez Cucumis hystrix (COMPTON et al.,2001) et
chez Adenophora triphylla ( CHEN et al ., 2001)
Nos expériences nous ont permis aussi de mettre en
évidence une certaine influence génotypique sur la
rhizogenèse. Parmi les génotypes que nous avons testés,
quelques uns se sont montrés récalcitrants c'est le cas de :
B1,B 6 et B8, alors que d'autres comme L3 et V12 ont manifesté de bonnes
capacités rhizogènes. L'influence du génotype sur la
rhizogenèse à été mis en évidence, chez
plusieurs espèces, on cite le cas du pommier (KARHU et ULVINEN,1995) et
celui de la Chamomille recutties (PASSAMONTI et al,1998).
La rhizogenèse varie selon la nature de l'explant
ensemencé. Les plus favorables sont les explants d'hypocotyles, suivis
des racines.
* S'agissant de la caulogenèse, elle se trouve aussi
conditionner par l'action de divers facteurs. Les plus influents sont les
facteurs que nous avons cité précédemment à
savoir : la composition hormonale du milieu, le génotype et la
nature de l'explant.
L'effet de la composition hormonale intervient à la
fois dans l'obtention des bourgeons néoformés et aussi dans
l'enracinement des tiges régénérées (WALKER et
al.,1979; MARGARA,1989) .
Nous avons constaté que, l'usage des auxines ou des
cytokinines seules dans le milieu d'induction est défavorable à
la caulogenèse sur l'ensemble des explants et cela quelle que soit la
concentration utilisée. Les meilleures réponses ont
été enregistrées avec les combinaison 2,4-D x BA, en
particulier sur le milieu B3D0,1( 3mg/lde BA+0,1mg/l de 2,4-D) et à un
degré moindre sur le milieu B3D1( 3mg/l de BA +1mg/l de 2,4-D).
Des résultats similaires aux nôtres, signalent
tous l'intérêt que peut avoir ce type d'association sur
l'induction de la caulogenèse et aussi sur le débourrement de
bourgeons néoformés. C'est le cas de LI et al (1986) sur
Medicago inpulina L. qui précisent que les cytokinines , en
l'occurrence la BA constitue un facteur essentiel pour la néoformation
de bourgeons . Le même constat a été fait par VESTRI et
al (1990) sur le Passiflora coerulea , VENKETESWARAN ,(1990)
sur Psophocarpus tetragonolobus , JADIMATH et al (1998) sur
Guizotia scabra ; CHRISTIANSON et HORNBUCKLE, 1999 sur Funaria
hygrometrica et HANDRO et FLOH (2001) sur Melia
azedarach
En caulogenèse, le facteur génotypique s'impose
comme étant un facteur essentiel et déterminant. Les
résultats, de notre étude, confirment cela, en mettant en
évidence une grande variabilité génotypique vis à
vis de la caulogenèse. Les meilleures aptitudes caulogènes sont
exprimées par le génotype V6 ( avec un rendement de l'ordre de
1.12) pour tous milieux et tous explants confondus. Les réponses de
certains génotypes comme le B1 ; le B8 ou le B6 étaient
faibles. L'effet génotypique sur la caulogenèse n'est pas nouveau
puisque de nombreux auteurs le signalent comme FOUCAULT , (1994), sur le
tabac ; CHRISTOPHERE et RAJAM ,(1996), sur le poivre; SANTALLA et
al .,(1998), sur haricot et TANG et GUO, (2001) sur le pin.
L'importance du facteur génotypique vis à vis
de la caulogenèse s'est confirmé aussi par l'analyse de la
variance. En effet, cette analyse montre qu'environ 33,27 % de la variation
totale des rendements en caulogenèse sont dues à la variation
génotypique.
La nature, des sucres employés dans le milieu,
apporte, elle aussi, sa part d'influence sur la caulogenèse. La
présence du maltose dans le milieu d'induction, entraîne une nette
amélioration des rendements par rapport au rendement moyen de l'essai
obtenu avec la totalité des explants testé. La combinaison du
maltose à la dose de 30 g/l , avec 3mg/l de BA et 0,1mg/l de 2,4-D a
permis une forte stimulation des aptitudes caulogènes.
L'efficacité du maltose comme source carbonée a
été évoquée par plusieurs auteurs notamment DRUART,
(1990) sur le prunus. Le saccharose s'est montré lui aussi
favorable à la caulogenèse. De nombreux auteurs rapportent
l'action positive du saccharose sur la caulogenèse (SAMYN, 1995 ;
SIMPSON et MARKS, 1995 ; GRIBAUDO et RESTAGNO, 1995).
L'action bénéfique du maltose n'agit pas
seulement sur la quantité des bourgeons produits mais aussi sur leurs
qualités. Des résultats presque identiques aux nôtres ont
été rapportés par DRUART,(1995) sur le prunus.
Le transfert des bourgeons néoformés, sur des
milieux dits "de développement" (milieux généralement
pauvres ou complètement dépourvus de cytokinines) a permis leurs
développement et aussi leur enracinement. Il demeure néanmoins
quelques imperfections à corriger, durant cette phase, comme le
brunissement des racines ou l'amélioration du taux de bourgeons
enracinés etc. Ce type de transfert ( transfert des bourgeons, avec
leurs cals d'origines, des milieux d'induction vers les milieux de
développement) est recommandé par de nombreux auteurs (KARHU et
UVINEN, 1995; ANAND et RAO, 2000).
Après enracinement des bourgeons, les nouvelles jeunes
plantules, sont automatiquement transférées sur pots afin de
poursuivre normalement leur développement. Malheureusement ,dans notre
cas, cette étape n'a pas été réussie à cause
peut être de la faible vigueur des racines ou des conditions de culture
inadaptées. Ce constat est appuyé par l'observation faite par
NAIR et al, (1999) sur le cocotier et qui fait état de la
présence d'une corrélation positive entre la vigueur
raçinaire et la survie des plantules en pots.
* Concernant l'embryogenèse somatique, l'impact des
régulateurs de croissance apparaît une fois de plus essentiel dans
les processus morphogènes. L'embryogenèse somatique varie
considérablement en fonction de la nature et de la dose du
régulateur de croissance employé. Effectivement l'usage des
auxines ou des cytokinines seules dans le milieu d'induction est incapable de
conduire à une production d'embryons. Contrairement à nos
résultats, un bon nombre d'auteurs parlent de l'importance de
l'utilisation des auxines seules( en particulier celui du 2,4-D), à
l'obtention des embryons somatiques chez plusieurs espèces comme le
Castanea sativa (PIAGNANI et ECCHER., 1990); le pois (SAADI,
1991); le sorgho (PATIL et KURUVINASHETTI, 1998); le Pinus sylvestris
(HAGGMAN et al ., 1999) et le coton ( ZHANG et al ., 2001).
Les meilleures réponses sont obtenues avec les
combinaisons réalisées entre 2,4-D x BA aux doses
respectives de 3 mg/l et 0,1 mg/l . D'autres combinaisons comme l'AIA x Kin
et l'AIA x BA donnent de faibles rendements. L'action favorable des
combinaisons 2,4-D x BA sur l'embryogenèse somatique a été
signalée par ETIENNE et al (1994) sur
l'Hévéa.
La qualité des embryons a également
été influencée par les régulateurs de croissances.
Les formes dicotylédonnaires sont relativement plus fréquentes
sur les milieux à AIA qu'à 2,4-D. La plupart des auteurs
considèrent que les milieux à 2,4-D, favorisent
fréquemment l'obtention d'embryons anormaux (LIPPMANN et LIPMANN, 1984;
BARWALE et al., 1986; LAZZERI et al., 1987; LAMBERT, 1991;
ZHANG et al ., 2001 ).
L'emploi de l'ANA seul ou combiné aux cytokinines,
dans le milieu d'induction, se montre sans effet aucun sur
l'embryogenèse. Contrairement à nos résultats, d'autres
auteurs utilisent l'ANA avec succès dans de nombreux travaux portant sur
l'embryogenèse somatique : LAPARRA et al .,(1997) chez le
tournesol et BRAR et al ., (1998) chez le coton.
Au cours de la phase d'induction, nos résultats
montrent que l'embryogenèse somatique est sous la dépendance du
génotype. En effet, parmi les génotypes que nous avons
testé, certains se sont montrés récalcitrants, cas des
génotypes L26 et L3 de l'espèce Scorpiurus muricatus ssp
sulcatus alors que d'autres comme V6,V12 et V13 ont manifesté de
bonnes aptitudes embryogènes.
Les rendement obtenus sont nuls pour les génotypes de
l'espèce (tétraploide) Scorpiurus muricatus ssp
sulcatus, faible pour les génotypes de l'espèce
(tétraploide) Scorpiurus muricatus ssp subvillosus et
très élevés pour les génotypes de l'espèce
(diploide) Scorpiurus vermiculatus.. On peut déduire
de nos expériences que l'effet du génotype sur
l'embryogenèse somatique est probablement dû à la
polyploidie,. Des interprétations similaires aux nôtres
ont été faites par BIANCHI et al,(1988) sur la luzerne
et BLONDON et BROWN sur Medicago sativa. Cette relation entre
le génome et l'aptitude à l'embryogenèse somatique a
déjà été reconnue par plusieurs auteurs, SAADI,
(1991) ; BENCHIEKH et GALLAIS (1996) sur le pois ; PATIL et
KURUVINASHETTI, (1998) sur le sorgho et CARNEIRO, (1999) sur le café
.
Nos expériences ont permis de mettre en
évidence une variabilité dans les aptitudes embryogènes,
des différents types d'explants testés. En effet se sont les
explants d'hypocotyles qui ont présenté les meilleures
potentialités embryogènes. Les bonnes performances des
hypocotyles vis à vis de l'embryogenèse sont rapportées
aussi par EVANS et al.,(1981). Cet auteur précise que 40 % des
explants utilisés avec succès en embryogenèse somatique
sont des hypocotyles et des embryon zygotiques .
Le même type d'explant a été testé
avec grand succès par PAMMETIER et al., (1994) et ZHANG et
al .,( 2001) sur coton et NUTI RONCHI et GIORGETTI (1995) sur la
carotte ; BRAR et al., (1998).
Nos résultats, nous ont permis de déduire qu'il
existe aussi le facteur interaction (composition hormonale du milieu *
génotype * nature de l'explant ), qui apporte sa part d'influence sur
l 'embryogenèse somatique. A cet effet, nous constatons que les
aptitudes de certains génotypes tels que le B1, le B6 et le B8
étaient nulles avec l'emploi des hypocotyles et des racines et
positive avec les cotylédons. Néanmoins, ces réactions
positives des cotylédons, ne s'obtiennent qu'avec le milieu
D3B0,1 et elles disparaissent avec les autres milieux .
De nouveau, le facteur génotypique s'identifie comme
étant un facteur incontournable et déterminant dans les
recherches entreprises sur l'embryogenèse somatique. Ce sont les
analyses de la variance qui révèlent cela, en précisant
que 37.10 % de la variation totale est dû à la variation
génotypique.
La source carbonée s'est également
révélée être un facteur pouvant influencer fortement
l'embryogenèse somatique. Les réponses varient en fonction de la
nature des sucres employés.
Parmi tous les sucres testés, dans le milieu
d'induction, le maltose s'est montré comme étant le plus efficace
pour l'embryogenèse somatique suivie du saccharose..
L'efficacité du maltose comme source de carbone a été
évoquée par plusieurs auteurs sur des espèces très
diverses: chez le pois (SAADI,1991); Chez le prunus (DRUART,1990) et
chez l'orange(STANANTINO et al.,1998). L'amélioration des
rendements en présence du maltose peut être due à une
préférence nutritionnelle des tissus à ce type de sucre et
non à un effet osmotique comme l'a constaté SAADI . (1991) sur le
pois.
Au cours de cette étude, nous nous sommes
confrontés à plusieurs problèmes ; le plus important
parmi eux est celui relatif au taux de conversion des embryons somatiques en
plantes entières. Dans cette phase , l'échec était
presque total puisque le taux de conversion n'a pas dépassé les 5
%. Cela est du, en partie, aux expériences limitées ,conduites
lors de cette étude et qui nous semble très insuffisantes pour
résoudre une telle problématique. Les problèmes de
germination des embryons peuvent être attribués soit aux
malformations des embryons (le méristème racinaires ou caulinaire
étant inexistant), soit aux techniques de transferts, des embryons vers
les milieux de germinations. Sur ce dernier point, SVOBODOVA et al.,
(1999) précisent que les dommages causés durant les
procédures de transfert affectent considérablement la conversion
des embryons en plantes entières.
En résumé ce travail nous a permis de
réaliser en grande partie les objectifs que nous nous somme fixés
au départ à savoir l'obtention de bourgeons
néoformés ou d'embryons somatiques , l'optimisation de la
production et la régénération de plantes entières.
Il se termine par la proposition d'un protocole permettant la production de
plante de Scorpiurus par la voie de l'organogenèse et
l'embryogenèse somatique ( Annexe 5).
· Nous voyons chez le Scorpiurus , que seul les
explants issus de plantes cultivées in-vitro sont utilisables (
cotylédon, hypocotyle, racine) . Les possibilités sont donc
réduites à des organes comportant des tissus jeunes.
· La totipotence de ces explants n'est pas toujours
complète et s'exprime à des degrés divers allant d'une
bonne aptitude à l'organogenèse ou à
l'embryogenèse somatique jusqu'à l'inaptitude totale à la
régénération selon leur nature.
· La composition hormonale joue également un
rôle déterminant sur le processus morphogène
(organogenèse ou embryogenèse somatique ). L'induction est
surtout favorisée par la combinaison auxine * cytokinine dans le milieu.
Les meilleures réponses ont été enregistrées avec
les combinaison 2,4-D x BA aux doses respectives de 0,1 mg/l et 3 mg/l
à l'obtention des bourgeons et 3 mg/l et 0,1mg/l pour l'obtention des
embryons somatiques .
· Le facteur génotype influence
énormément la réponse morphogène mais d'une
manière générale se sont les génotypes de l'
espèce Scorpiurus vermiculatus qui expriment les meilleures
réponses aussi bien pour la caulogenèse que
l'embryogenèse somatique .
· La source carbonée à également
influencé considérablement l'organogenèse ou
l'embryogenèse somatique. La présence du maltose dans le milieu
d'induction entraîne une nette amélioration des aptitudes
oraganogènes ou embryogènes des explants .
· La phase de sevrage des plantes ( passage des
plantules des tubes à essais aux pots dans la mini serre ) n'a pas
été réussis probablement à cause d'une part de la
fragilité des plantules et de leur système radiculaire manquant
toujours de vigueur et d'autres part des conditions de sevrage mal
adaptées à notre expérimentation.
Concernant l'embryogenèse somatique, le rendement et
la qualité des embryons somatique doivent être
améliorée d'avantage et devaient conduire à
l'amélioration de la germination..
Une autre voie de recherche très prometteuse devra se
porter sur la maîtrise de l'enracinement des bourgeons et la
résolution du problème d'endurcissement ou la phase
d'acclimatation qui reste une des étapes les plus réfractaires
à réalisée.
En conclusion , cette étude nous a permis d'atteindre
l'objectif que nous étions fixé au départ et elle
représente une première contribution de notre part, pour la
régénération de plantes entières chez le
Scorpiurus. Ainsi les résultats auxquels nous nous sommes
parvenus sont plus qu'encourageant puisque jusqu'alors aucune
référence bibliographique n'a rapporté des
résultats relatifs à l'obtention de plantes entières via
l'embryogenèse somatique ou l'organogenèse chez le
Scorpiurus.. Ce travail mérite d'être poursuivie pour
mieux maîtriser la régénération chez le
Scorpiurus
