II. 2. Méthodes
II. 2. 1. Préparation du milieu de culture
Le milieu de culture PDA est favorable pour la croissance des
champignons phyto - pathogènes. A chaque préparation, une dose de
0,4 g de sodium azide a été ajouté dans 1 l de milieu pour
limiter les contaminations bactériennes des milieux de culture.
Voici le protocole utilisé pour la préparation de
milieu de culture pour la croissance des champignons :
Constituants :
- 200 g de Pomme de terre ;
- 15 g de Dextrose ou de sucre blanc de cannes ; - 20 g d'agar -
agar, gélose ou de gélatine ;
- 1 litre d'eau distillée.
Préparation :
1. Dissoudre 20g d'agar-agar dans 300 ml d'eau distillée,
homogénéiser la solution.
2. Peser 200g de pomme de terre, éplucher la pomme de
terre, mélanger 200g de pomme de terre bien découpé avec
300 ml d'eau distillée,
bouillir à 100° C pendant 20 à 25 minutes,
ensuite recueillir l'eau de la pomme de terre environ 300 ml.
3. Le 300 ml de l'eau venant de la pomme de terre est
mélangé à 300 ml de la solution agar - agar.
4. Ajuster ensuite le volume du mélange au moyen de l'eau
distillée jusqu'à 1000 ml.
5. Auto - claver le mélange à la
température de 125° C, la pression de 1,4 bar pendant 15
minutes.
6. Sous hotte à flux laminaire, couler la solution
obtenue sur des boîtes de Pétri.
7. Laisser sécher pendant 24 à 48
heures55.
En présence de PDA de synthèse, la procédure
devient simple, car il suffit de :
1. Prendre 39 gr de PDA de synthèse,
2. Le mélanger à 1 l d'eau distillée,
3. Secouer doucement jusqu'à obtenir un mélange
homogène,
4. Auto - claver sous une pression de 1,4 bar à la
température de 125°C durant 15 minutes,
5. Laisser refroidir un peu sous le hotte, puis couler la
solution sur les boîtes de Pétri,
6. Laisser sécher pendant 24 à 48
heures56.
55 CLINIQUE DES PLANTES DE KINSHASA, 2009. « Protocole
commun de laboratoire, Milieu pour la croissance des champignons »,
CPK Kinshasa.
56 CLINIQUE DES PLANTES DE KINSHASA, op. cit.
II. 2. 2. Préparation des bio - pesticides
1. Préparation d'extrait de Curcuma
longa
Pour commencer toutes les opérations, il faut
stériliser le matériel ou les mains. Et les étapes de
préparation d'extrait de bio - pesticide sont les suivants :
1.
Pesage
Rinçage Broyage Récolte Emploi
Epluchage : consiste à ôter la couche superficielle
du rhizome de Curcuma longa ;
2. Pesage : peser 20 gr de la biomasse des rhizomes de
Curcuma longa ;
3. Rinçage : laver la quantité obtenue à
l'eau ;
4. Broyage : à l'aide du pilon et du mortier en
porcelaine, il suffit d'écraser pour réduire les rhizomes en
petites particules pour en tirer le jus ;
5. Récolte : il suffit de presser les petites
particules des rhizomes broyées pour que ressorte le jus de Curcuma
longa et l'extraire à l'aide d'une pipette ;
6. Emploi : mettre dans un tube à essai pour mesurer le
pH et vortexer, et sera utilisé directement.
Le jus de Curcuma longa extrait avec un pH de 7,9 sera
mélangé avec 125 ml de milieu de PDA à différentes
doses de la manière suivante :
- 3 ml d'extrait de Curcuma longa + 125 ml de PDA ; - 6
ml d'extrait de Curcuma longa + 125 ml de PDA et - 9 ml d'extrait de
Curcuma longa + 125 ml de PDA ;
2. Préparation d'extrait de Tithonia
diversifolia
Contrairement au Curcuma longa dont les rhizomes ont
été utilisés, chez le Tithonia diversifolia, ce
sont les feuilles qui ont été utilisées. Les
opérations d'extraction du jus de Tithonia diversifolia se
succèdent de la manière suivante :
1.
.
Pesage
Rinçage Broyage Récolte Emploi
Pesage : peser 20 gr de la biomasse des feuilles de Tithonia
diversifolia ;
2. Rinçage : laver la quantité obtenue à
l'eau ;
3. Broyage : à l'aide du pilon et du mortier en
porcelaine, il suffit d'écraser pour réduire les feuilles en
petites particules pour en tirer le jus ;
4. Récolte : il suffit de presser les petites
particules des feuilles broyées pour que ressorte le jus de Tithonia
diversifolia et l'extraire à l'aide d'une pipette ;
5. Emploi : mettre dans un tube à essai pour mesurer le
pH et vortexer, et sera utilisé directement.
Le jus de Tithonia diversifolia extrait avec un pH de
6,5 sera mélangé avec 125 ml de milieu de PDA à
différentes doses de la manière suivante :
- 3 ml d'extrait de Tithonia diversifolia + 125 ml de
PDA ;
- 6 ml d'extrait de Tithonia diversifolia + 125 ml de
PDA et - 9 ml d'extrait de Tithonia diversifolia + 125 ml de PDA ;
3. Préparation d'extrait de Zingiber
officinale
Le jus de gingembre à partir de ces rhizomes sera obtenu
de la manière suivante :
1.
Pesage
Rinçage Broyage Récolte Emploi
Epluchage : consiste à ôter la couche superficielle
du rhizome de Zingiber officinale ;
2. Pesage : peser 20 gr de la biomasse des rhizomes de
Zingiber officinale ;
3. Rinçage : laver la quantité obtenue à
l'eau ;
4. Broyage : à l'aide du pilon et du mortier en
porcelaine, il suffit d'écraser pour réduire les rhizomes en
petites particules pour en tirer le jus ;
5. Récolte : il suffit de presser les petites
particules des rhizomes broyées pour que ressorte le jus de Zingiber
officinale et l'extraire à l'aide d'une pipette ;
6. Emploi : mettre dans un tube à essai pour mesurer le
pH et vortexer, et sera utilisé directement.
Après extraction, le jus de Zingiber
officinale a un pH de 6,4 et sera mélangé avec 125 ml de
milieu de PDA à différentes doses de la manière suivante
:
- 3 ml d'extrait de Zingiber officinale + 125 ml de PDA
;
- 6 ml d'extrait de Zingiber officinale + 125 ml de PDA
et - 9 ml d'extrait de Zingiber officinale + 125 ml de PDA ;
Il faut noter que chaque préparation de 125 ml de
milieu PDA + une dose de différent extrait de plante seront
coulées dans les boîtes de Pétri en 3
répétitions.
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