4- L'isolement de P. infestans :
Il y a de différentes façons d'isoler P.
infestans du tissu infecté, mais les deux voies communes sont
de :
1) transférer le hyphe fongique et sporange directement
sur le milieu dans une boite Pétri,
2) placer le tissu infecté à l'intérieur
d'un milieu sélectif.
Le premier d'entre ceux-ci implique généralement
de cultiver le champignon sur les tubercules de pomme de terre et le
deuxième sur le tissu de feuille ou le tubercule (Caten, 1968).
Dans notre expérience, les génotypes de pomme de
terre sont plus faciles à isoler avec la méthode 1. En tout cas,
il est toujours plus facile d'isoler d'une infection récente qui
commence juste à sporuler.
P. infestans est relativement facile à
maintenir en vie par les inoculations répétées sur le
tissu vivant. D'autre part, P. infestans est quelquefois difficile
à faire entrer dans la culture pure. Donc, il faut garder votre isolat
vivant sur le tissu vivant jusqu'à ce qu'il soit purifié avec
succès (Caten, 1968).
4.1- L'isolement P. infestans de la pomme de terre
infectée :
1. Les lésions de Sporulation sur le tissu de feuille,
pris du champ, sont lavées à l'eau douce et placées dans
une chambre humide (a inversé la boite de pétri avec la
gélose diluée) tout en exposant le côté axial de la
feuille vers le haut.
2. Les plaques sont incubées à 15-18°C
pendant 1 jour ou jusqu'à ce que la sporulation fraiche apparaisse.
3. De petits morceaux du tissu infecté, de la
frontière de sporulation de la lésion, sont coupés et
placés sous les tranches de pomme de terre dans une boite pétrie
vide.
4. Les boites sont incubées à 15-18°C pendant
1 semaine, jusqu'à ce qu'il y ait sporulation abondante sur le
côté supérieur de la tranche.
5. Pour réinoculer les feuilles, choisissez des
sporanges du haut du tubercule et placez-les dans une goutte d'eau sur une
feuille de pomme de terre ou une autre tranche de tubercule. Vous pouvez
répéter les étapes 2-5 plusieurs fois pour garder votre
isolat vivant.
IV.2- L'isolement de P. infestans des tubercules
infectés :
Pour isoler des tubercules infectés, coupez le
tubercule ouvert où l'infection s'est produite et placez-le dans une
chambre humide jusqu'à ce que la sporulation soit produite ; suivez
alors les mêmes étapes sur la section.
IV.3- L'isolement dans la gélose après le
transfert des tranches de pomme de terre :
Une fois l'inoculum apparaît sur le côté
supérieur d'une tranche de tubercule infectée ou d'une feuille,
les sporanges sont récoltés dans une chambre d'écoulement,
en les recueillant avec une aiguille inoculant et en plaçant le sporange
sur le milieu sélectif, Ne touchez pas la tranche de pomme de terre ou
la feuille avec l'aiguille. L'utilisation d'un stéréoscope est
fortement utile, directement de la feuille infectée ou du tissu de la
tige (Caten, 1968).
Il est possible d'isoler le champignon directement du tissu de
feuille infectée, mais il est conseillé de produire l'inoculum
frais au moins une fois (Caten, 1968 ).
Pour isoler directement, un petit morceau de feuille
infectée de la frontière de sporulation, en incluant un petit peu
du tissu vert, qui est découpé et traversé par un colorant
en solution pendant 30 secondes, ensuite rincé dans de l'eau
distillée stérile deux fois de suite, puis séché
avec du papier filtre stérile. Les morceaux de feuille sont alors
placés sur le haut ou à l'intérieur d'un milieu
sélectif. Les plaques sont incubées à 18°C pendant
5-10 jours, ou jusqu'à ce que le champignon commence à grandir et
se nourrir de la gélose. Les bouts d'Hyphe sont alors
transférés à V8 ou sur les plaques agar agar de Seigle
boiles.
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