La lipoprotéine Lp(a):son intérêt dans l'interprétation du bilan lipidique

2.7.2.1. Remarques

La mise en évidence de réactions croisées de la plupart des anticorps-anti-Lp(a) avec le plasminogène, ainsi qu'une meilleure connaissance de l'hétérogénéité de la Lp(a) ont rendu primordial le développement de méthodes de dosage immunologiques plus spécifiques. Néanmoins, pour certains auteurs, les résultats des études cliniques antérieures ne semblent pas devoir être remis en cause : d'une part parce que les concentrations plasmatiques de plasminogène sont le plus souvent stables, d'autre part du fait des différences de taille entre la Lp(a) et le plasminogène qui limitent les interférences susceptibles d'intervenir dans le dosage ²⁸⁶.

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Différentes techniques ont été développées pour doser la Lp(a) plasmatique et, comme pour le dosage des autres apoprotéines, chaque méthode présente des avantages et des inconvénients sans que l'une d'elles puisse être actuellement considérée comme idéale. Le choix de la méthode la plus appropriée sera fonction des données disponibles sur la sensibilité, l'exactitude, la précision et la reproductibilité ainsi que des besoins spécifiques du laboratoire en terme de charge de travail, d'appareillage disponible, de techniciens entraînés, de temps de dosage et de coût par analyse.

2.7.2.2. Méthodes immunologiques

Les différentes méthodes

Immunodiffusion radiale

C'est une technique de dosage immunologique par précipitation en milieu solide développée par Mancini (1965).

L'immunodiffusion radiale a été une des premières méthodes de dosage de la Lp(a) ²⁸⁷. Simple à utiliser, cette méthode ne nécessite pas de dilution des échantillons ni d'équipement particulier. Elle peut être utilisée avec des anticorps polyclonaux ou un mélange d'anticorps monoclonaux.

Néanmoins elle présente de sérieux inconvénients dont certains sont spécifiques de la Lp(a). Elle se prête mal aux grandes séries et manque de sensibilité.

Elle donne des résultats sous estimés par rapport à une méthode gravimétrique.

Le problème majeur de cette méthode est sa sensibilité aux différences de taille de l'analyte mesuré : les isoformes de grande taille de la Lp(a) semblent sous estimées par rapport aux isoformes de petite taille 286.

Cette méthode plutôt semi-quantitative, peut être utile pour dépister la présence d'une Lp(a) avant de la doser 288

Electro-immunodiffusion de Laurell

Plus rapide que l'immunodiffusion radiale, la méthode de Laurel) associe la spécificité de l'immunochimie à la rapidité de l'électrophorèse 289.

Cette méthode a été utilisée par de nombreuses équipes et se révèle sensible, spécifique et précise. L'emploi d'un gel à faible électroendosmose permet une meilleure migration des grosses molécules telles que la Lp(a). Elle peut être considérée comme une méthode de choix car la réaction est objectivée par une fusée de précipitation et la nature lipoprotéique de l'antigène dosé est confirmée par l'emploi d'un colorant des lipides. En cas de réaction croisée entre l'antisérum et un autre constituant sérique, il apparaît un arc de précipitation distinct de l'arc principal.

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Un autre avantage de cette méthode, pour le dosage de la Lp(a), est d'être insensible aux interférences affectant l'immunoprécipitation en milieu liquide.

Néanmoins, les échantillons de patients donnent parfois des fusées moins nettes et dans ce cas la hauteur exacte n'est pas toujours facile à apprécier, ce qui diminue la précision 286. Immunoprécipitation en milieu liquide

La mise en présence d'un anticorps et d'un antigène entraîne, dans certaines conditions, la formation de complexes insolubles. Pour une concentration donnée en anticorps, la quantité de complexe formé est fonction de la concentration en antigène. L'estimation du précipité formé permet le dosage de l'antigène. Cette estimation peut être faite de manière simple et quantitative par turbidimétrie (mesure de la lumière transmise) ou par néphélémétrie (mesure de la lumière diffusée).

Pour le dosage de la Lp(a), l'addition de polyéthylène glycol accélère la formation des complexes antigène-anticorps mais pourrait être à l'origine de résultats élevés par rapport à d'autres techniques. Les avantages sont l'automatisation et la rapidité. Les résultats sont bien corrélés avec ceux des autres méthodes.

Les principaux inconvénients sont la consommation importante d'anticorps et l'impossibilité de doser des échantillons troubles. De plus il est déconseillé de doser des échantillons

congelés 29° 291_.

Ces méthodes sont également sensibles aux différences de taille de l'analyte entraînant des variations de dispersion de la lumière par le complexe antigène-anticorps 286.

Ceci est un réel problème étant donné le polymorphisme de taille de la Lp(a).

Un mode de lecture couramment utilisé pour les dosages par immunoprécipitation en milieu liquide est la mesure néphélémétrique en temps fixé. Ce type de technique est destiné à tenir compte des réactions non spécifiques susceptibles de se produire dans certaines conditions opératoires et/ou pour certains échantillons, et permet de minimiser le risque de réaction non spécifique.

Les techniques néphélémétriques sont moins soumises aux interférences que les techniques turbidimétriques.

Dans le cas de la Lp(a), l'effet des différences de taille doit être soigneusement évalué. En effet l'immunoréactivité de l'antisérum vis à vis des différents phénotypes peut être très différente selon que l'antisérum utilisé, réagit contre tel ou tel épitope.

L'anticorps doit reconnaître les différents phénotypes avec une affinité comparable et devrait donc être testé à l'aide de sérums frais phénotypés en apo(a).

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Théoriquement, on pourrait minimiser le problème en utilisant un calibrant contenant toutes les isoformes majeures d'apo(a), l'idéal étant de calibrer avec les isoformes du patient ce qui est impossible à réaliser en pratique.

Radio immunologie

Le principe général de la radio-immunologie repose sur la compétition entre l'antigène marqué par un isotope et le même antigène non marqué vis à vis d'un anticorps spécifique, la concentration du complexe antigène marqué-anticorps étant inversement proportionnelle à celle du complexe antigène froid-anticorps.

Appliquée au dosage de la Lp(a), cette méthode est très sensible, spécifique et précise, mais elle nécessite une évaluation préalable des fortes et faibles concentrations de Lp(a) par immunodiffusion radiale. Elle est facilement automatisable.

Toutefois il faut utiliser des anticorps-anti-Lp(a) hautement purifiés et un antigène également très pur ce qui est un inconvénient puisque la Lp(a) sous forme pure est instable. Enfin l'emploi des radio isotopes rend cette technique peu accessible en pratique ¹¹³.

Immunolatex

Ce dosage est basé sur l'agglutination par l'antigène de particules de latex sur lesquelles sont fixés des anticorps spécifiques. L'intensité de l'agglutination est mesurée par turbidimétrie à 360 nm.

Pour le dosage de la Lp(a), cette méthode se révèle sensible et rapide, et ne présente pas les inconvénients de l'immunonéphélémétrie. La limite de sensibilité de la méthode est de 0,03 g/I et la gamme de linéarité va de 0,05 à 1,15 g/I. Les sérums sont dilués au 1000ème pour les dosages. La méthode est répétable: 2,6 p.cent et 3 p.cent à respectivement 0,12 et 0,54 g/I de Lp(a), et reproductible: 5,6 p.cent et 7,8 p.cent aux mêmes concentrations. La sensibilité et la précision sont comparables à celles des méthodes radio-immunologiques et permettent le dosage de faibles concentrations 292.

Immuno-enzymologie (ELISA)

Les enzymes capables de se fixer sur une immunoglobuline sans la dénaturer peuvent être utilisées comme marqueurs de réaction "antigène-anticorps". La peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline peuvent ainsi être utilisées comme marqueurs grâce à leur activité catalytique. Si l'addition du substrat de l'enzyme donne une réaction colorée, la mesure de l'intensité de cette coloration permet le dosage de la substance marquée.

La technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) est voisine dans son principe des techniques radio-immunologiques en tubes :

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- Applications à la Lp(a) :

- 1. Méthodes par compétition

Le problème majeur de cette technique est qu'il faut disposer de l'antigène pur. Or, la Lp(a) est difficile à purifier et instable sous forme pure 293.

C'est pour pallier à ces inconvénients que des méthodes "sandwich" avec deux anticorps différents ont été développées.

- 2. Méthode non compétitive dite "sandwich"

L'anticorps immobilisé sur un support solide est mis en présence de l'antigène à doser qu'il fixe par un site spécifique de l'apo(a). Après lavage, un second anticorps marqué avec une enzyme (peroxydase) et reconnaissant un autre site spécifique de l'apo(a) ou mieux un site de l'apoB100, est ajouté. On révèle la fixation du ^2ème anticorps par mesure de l'activité enzymatique après addition du substrat.

Cette technique dite "bi-site" présente de nombreux avantages. Elle ne nécessite pas d'antigène pur. L'utilisation d'anticorps monoclonaux de capture anti-apo(a) pour l'immobilisation et d'anticorps monoclonaux anti-apoB, pour la révélation permet un dosage spécifique, minimisant l'interférence du plasminogène.

Elle est relativement simple à mette en oeuvre, sensible, standardisée et automatisable. Cette approche résout le problème de la spécificité et permet l'expression des résultats en molarité.

Mais si on considère le problème de la standardisation des dosages de Lp(a), les résultats obtenus par mesure de l'apoB de la Lp(a) sont susceptibles d'être différents de ceux obtenus par mesure de l'apo(a).

Le problème de la spécificité peut être résolu par la sélection d'anticorps monoclonaux spécifiques de l'apo(a) et dépourvus de réactivité croisée avec le plasminogène.

Ce point a déjà fait l'objet de recommandations pour la préparation et la sélection des meilleurs anticorps monoclonaux pour le dosage des apo Al et B ainsi que pour la caractérisation des anticorps sélectionnés.

La plupart de ces recommandations sont applicables aux anticorps monoclonaux anti-Lp(a) mais dans ce cas il faut en plus montrer que les anticorps monoclonaux sélectionnés réagissent avec toutes les particules Lp(a) indépendamment des diverses isoformes d'apo(a). Pour éviter toute différence d'immunoréactivité liée au fait que le nombre d'un épitope donné par molécule d'apo(a) peut varier en nombre avec le nombre de K4, il serait préférable de sélectionner les anticorps monoclonaux spécifiques d'épitopes du K5 ou du domaine protéase.

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Du fait des caractère particuliers de l'apo(a), il est souhaitable de connaître les caractéristiques immuno-chimiques des anticorps monoclonaux sélectionnés pour l'immuno-dosage 294.

Les problèmes spécifiques des dosages immunologiques de la Lp(a)

La qualité des immuno-dosages dépend principalement de la qualité des anticorps utilisés et de l'étalonnage. Le dosage immunologique de la Lp(a) pose des problèmes particuliers, liés aux faits suivants:

- complexité structurale et hétérogénéité de la Lp(a)

- homologie entre l'apo(a) et le plasminogène

- absence de standardisation des méthodes

- absence d'un mode commun d'expression des résultats.

Les anticorps utilisés

Un bon anticorps anti-apo(a) ne doit pas donner de réaction croisée avec le plasminogène et doit se lier avec la même affinité à tous les phénotypes de Lp(a). L'idéal serait de sélectionner des anticorps dirigés contre un épitope unique, par exemple situé sur le kringle 5 ou sur le domaine protéase de l'apo(a). De ce point de vue, les méthodes ELISA, où l'anticorps de capture est un mélange d'anticorps anti-apo(a), et l'anticorps de révélation, un mélange d'anticorps anti-apoB, sont plutôt avantageuses.

Le dosage de la Lp(a) est souvent réalisé avec des méthodes utilisant des anticorps anti-kringles 4 qui sont en nombre variable selon les isoformes. Or, dans de nombreuses populations, 80 à 90 p.cent des individus sont hétérozygotes avec des combinaisons variables d'apo(a) de grande et petite tailles. La réactivité antigénique varie probablement entre individus alors qu'il est très important qu'un antisérum de dosage ait la même immunoréactivité vis à vis des différents formes de l'analyte.

L'inconvénient des anticorps monoclonaux-anti-K4 sera de surestimer les concentrations des Lp(a) de grande taille et de sous estimer les plus petites selon l'isoforme ou le mélange d'isoformes du standard.

Les antisérums sont préparés avec différentes espèces animales (chèvre, cheval, lapin principalement). La Lp(a) utilisée pour l'immunisation (ou comme standard pour les dosages) est généralement isolée du plasma humain par ultracentrifugation puis purifiée par filtration sur gel. L'isolement et la purification de la Lp(a) sont longs, de faible rendement et de plus la Lp(a) se conserve mal sous forme purifiée.

Les antisérum obtenus sont ensuite rendus monospécifiques de la Lp(a) par absorption avec des LDL isolées.

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Certains suggèrent d'utiliser l'apo(a) isolée ou obtenue par génie génétique pour l'immunisation mais il n'est pas certain que les anticorps ainsi obtenus aient la même réactivité vis à vis de l'apo(a) dans la lipoparticule.

Les caractéristiques des anticorps choisis (polyclonaux, monoclonaux, ou mélanges d'anticorps monoclonaux) doivent donc être soigneusement évaluées avant de les employer dans une méthode de dosage.

Calibration, standardisation

La comparaison des résultats de dosage obtenus par des méthodes différentes a montré une bonne corrélation des résultats mais des différences absolues parfois considérables qui semblent en grande partie liées à des différences de calibration.

Néanmoins on considère que les résultats des études publiées qui incluaient des groupes témoins adéquats restent valides.

L'exactitude et la standardisation des méthodes de dosages immunologiques des apoprotéines dépendent principalement de la disponibilité d'un étalon primaire convenable comme l'ont montré les récents travaux de standardisation des dosages d'apoA1 et B 295. Pour standardiser les dosages de Lp(a), il faudra suivre les mêmes étapes que ce qui a été fait pour les apo A-1 et B, mais avec une approche plus approfondie du fait des problèmes spécifiques que pose son dosage.

Ceci permettrait de comparer les résultats des différentes méthodes de dosage.

L'étalon primaire doit être réalisé à partir d'une fraction extrêmement pure de Lp(a) dont on détermine le titre par gravimétrie ou par dosage des protéines selon Lowry, l'albumine bovine servant d'étalon.

La masse de Lp(a) est obtenue en multipliant le résultat obtenu par un coefficient de 2,59 qui tient compte de la proportion de protéines dans cette lipoprotéine (27 p.cent) et de la différence de réactivité entre l'albumine bovine et l'albumine humaine.

L'obtention d'un étalon primaire défini est l'étape clé de la standardisation. En effet il permet de déterminer le titre des étalons secondaires (élaborés à partir d'un mélange de plasmas riches en Lp(a) puis lyophilisés dans des conditions particulières pour éviter les dégradations) qui devra être transférable aux calibrants utilisés dans les différents kits commerciaux.

Malheureusement, la Lp(a) délipidée montre un forte tendance à l'auto-association évoluant vers l'agrégation irréversible. Actuellement il n'existe pas de protocole standardisé pour l'isolement de la Lp(a) et la préparation d'un étalon primaire.

La Lp(a) est le plus souvent isolée à partir des fractions d'ultracentrifugation comprises entre les densités de 1,050 et 1,120. Après ultracentrifugation, la Lp(a) est séparée des autres

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lipoprotéines par filtration sur gel. Le rendement de ce mode de préparation est faible (15-20 p.cent) et on ne connaît pas les causes des pertes de Lp(a). Certains auteurs ont préparé la Lp(a) en sélectionnant des zones de densité plus étroites (1,06-1,09) pour éviter les risques de contamination par d'autres apoprotéines mais les Lp(a) ainsi isolées pourraient n'être pas représentatives de la Lp(a) totale du plasma ¹³. De plus les particules Lp(a) de petite taille, (densité faible) paraissent relativement stables alors que les plus grandes (densité plus élevée) ont tendance à précipiter à basse température 118 123 296.

Une autre méthode d'isolement de la Lp(a) met en oeuvre des immonoadsorbants spécifiques (chromatographie d'affinité anti-apo(a)) et permet d'obtenir des fractions de Lp(a) très pures. La chromatographie d'affinité sur lysine-sépharose est également utilisable mais on obtient par cette méthode qu'une fraction de la Lp(a) totale 116.

Une approche assez différente pour la préparation d'un étalon primaire est l'isolement d'apo(a) purifiée. L'apo(a) peut être isolée de la Lp(a) par réduction des ponts disulfures ou synthétisée par les techniques du génie génétique.

Néanmoins avant d'utiliser l'apo(a) ainsi isolée comme étalon, il faut préalablement démontrer que son comportement immunologique, dans la méthode de dosage choisie, est le même que celui de l'apo(a) au sein de la Lp(a) native.

Or, des anticorps monoclonaux préparés avec de l'apo(a) purifiée se sont révélés faiblement réactifs avec des Lp(a) intactes de même que des anticorps monoclonaux anti-Lp(a) sont apparus peu réactifs vis à vis de l'apo(a) obtenue après réduction.

Ceci suggère que certains déterminants antigéniques sont affectés par la réduction des ponts disulfures. Ainsi l'apo(a) native, obtenue par génie génétique, contenant les liaisons disulfures intactes exprimerait plus probablement les épitopes de la Lp(a) que l'apo(a) obtenue après réduction 293.

Les lipoprotéines sont de très grosses molécules et le problème est de savoir si on dose seulement l'apoprotéine ou l'ensemble de la lipoprotéine, ce qui n'est pas clair au niveau des coffrets commercialisés. Il semble que les techniques actuelles mesurent l'apo(a) puis appliquent un facteur pour extrapoler la concentration de Lp(a).

Expression des concentrations

L'expression des concentrations de Lp(a) en unité de masse dans le sérum humain pose un réel problème en raison de la difficulté de standardisation d'un étalon primaire. Diverses méthodes ont été utilisées :

- mesure de la masse absolue. Elle est délicate à réaliser de façon précise et reproductible car elle résulte de l'addition des résultats des dosages des différents

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constituants de la Lp(a) dont la composition chimique est assez variable. Cette expression des résultats devrait être abandonnée.

- mesure de la masse protéique. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées : technique de Kjeldhal, méthode de Lowry ou analyse des acides aminés, cette dernière technique étant longue et délicate. Cette approche est impossible pour la mesure de la Lp(a) qui contient un complexe hétérogène de 2 apoprotéines.

L'expression des résultats en terme de masse d'apo(a), est compliquée par l'hétérogénéité inter et intra-individuelles des particules Lp(a).

Toutes les méthodes immunologiques de dosage de la Lp(a) qui emploient des anticorps spécifiques de l'apo(a), et qui expriment les résultats en terme de masse de Lp(a) ou de masse d'apo(a), ne tiennent pas compte des différences de masse des isoformes (ou des différences de rapport apo(a) / apoB dans la Lp(a).

Si on admet qu'il y a 1 molécule d'apo(a) et une molécule d'apoB par molécule de Lp(a), le rapport des poids (apo(a) / apoB) peut varier de 0,51 à 1,30 pour les isoformes d'apo(a) dont les poids moléculaires vont de 280 à 710 kDa.

Il résulte des remarques précédentes que les conditions générales de standardisation des méthodes analytiques (à savoir similitude de composition de l'étalon primaire, du matériel de référence et des calibrants avec l'analyte à doser) sont impossibles à réaliser pour la Lp(a). Il a donc fallu effectuer des choix arbitraires propres à chaque méthode.

Différentes propositions pourraient conduire à une plus grande homogénéité des résultats et constituer une 1ère approche de la standardisation.

L'emploi d'une seule forme de Lp(a) avec une apo(a) de poids moléculaire intermédiaire ou un mélange des différentes isoformes de Lp(a) devrait minimiser les différences de concentration mesurées, qui reflètent les différences d'immunoréactivité plutôt que les différences de masse de lipoparticules.

Pour harmoniser les résultats des différentes méthodes, il faut disposer d'un matériel de référence avec une valeur cible assignée grâce à l'emploi d'un étalon primaire. Ce matériel de référence ne doit pas manifester d'effet matrice (entre les différentes méthodes), doit posséder les caractères immunochimiques des échantillons de patients et être stable. On sait que les pools de sérum lyophilisés ne constituent pas toujours une matrice correcte pour les dosages d'apoprotéines (par exemple dans le cas de l'apoB). Il est donc important d'évaluer les étalons lyophilisés de Lp(a) et de les comparer avec des sérums frais et des sérums congelés, dans les différentes techniques, tant qu'on ne dispose pas de matériel de référence.

En conclusion, il apparaît que la compréhension des problèmes liés à la complexité de la Lp(a) est essentielle pour la future standardisation des méthodes immunologiques destinées à son dosage.

Pour standardiser les dosages de la Lp(a) un groupe de travail international est en train de suivre les mêmes étapes que ce qui a été fait pour les apoprotéines Al et B ²⁹⁷ :

- choisir les isoformes d'apo(a) de l'étalon primaire,

- établir un protocole commun de préparation de l'étalon primaire,

- choisir la partie de la Lp(a) à mesurer,

- évaluer un matériel de référence convenable,

- adopter un mode d'expression unique des résultats.

L'idéal dans le cas de la Lp(a), serait d'exprimer les résultats en molarité, reflétant la quantité de cholestérol et le nombre de molécules d'apo(a) transportés par les Lp(a).

Ceci permettrait la comparaison des différentes méthodes de dosage.

Conservation des échantillons

Les conditions de conservation des échantillons (additifs, température, durée) influent sur les résultats des dosages de manière variable selon la technique utilisée. Ainsi, Craig a dosé par immunodiffusion radiale et par une méthode ELISA 18 sérums aussitôt après le prélèvement puis après conservation 6 mois à -20°C et à - 70°C. Après conservation il n'existe pas de différence des concentrations mesurées par méthode ELISA alors que par immunodiffusion radiale, une baisse de 46 p.cent en moyenne est observée 29e.

Dans de nombreuses études épidémiologiques prospectives ou rétrospectives, les dosages ont été effectués sur des échantillons conservés. Pour atténuer le biais plus ou moins important dû à la conservation, des auteurs ont apparié les cas et les témoins sur la durée et la température de conservation.