V. Inoculation du virus M33
L'inoculation virale en culture cellulaire a pour but la
multiplication du virus et la production d'HA.
Le tube contenant la suspension virale M33 est
décongelé et le milieu DMEM 5% SVF est éliminé des
bouteilles Roller. L'étape qui suit est l'inoculation. Dans chaque
bouteille Roller 1 ml de la suspension virale est mis, soit environ 1 virus
pour 2 cellules (On compte 200 millions de cellules par bouteille Roller. 1 ml
de semence virale a un titre de 108 virus). 30 ml du milieu DMEM 2%
SVF sont ajoutés dans la bouteille Roller.
Figure 23: Inoculation du virus
Après une heure d'incubation à
température ambiante les bouteilles sont mises dans l'appareil Roller
à 37°C avec une rotation continue pour une durée de 7h.
Enfin, un rinçage avec le milieu DMEM 0% SVF est effectué et un
nouveau milieu DMEM 0% est ajouté et l'incubation se poursuit pour une
durée de 3 jours à 37°C dans le milieu DMEM 0% SVF.
Le procédé de passage cellulaire et inoculation du
virus est résumé comme suit:
1 flasque 25 cm 2 1 flasques 75 cm2 2
flasques 150cm2
4 flasques 225cm2 4 bouteilles Roller Inoculation
virale
ISTMT-IPT 2012-2013
31
ISTMT-IPT 2012-2013
32
V.1. Récolte
Après 3 jours d'incubation vient l'étape de la
récolte. Le surnageant dans chaque bouteille Roller est
récupéré dans un flacon de 500ml. Puis nous avons
ajouté à ce surnageant le Chlorure de sodium
(NaCl) 2,2g% et le Polyéthylène glycol
(PEG 6000) 6g%. Après homogénéisation par agitation. Le
précipité a été mis sous agitation à
+4°C.
V.2. Extraction de l'HA rubéolique
Après 48h sous agitation à +4°C nous avons
procédé à une centrifugation à 4°C à
3000 tours/min pendant une heure. Par la suite le surnageant est
éliminé et le culot est resuspendu dans le Tampon Glycine
de pH 10 (annexe 3) (soit environ 1 ml/bouteille Roller), ensuite la
solution Tween 80 à 1,25% est ajouté au culot
(annexe 3) (soit 1 volume de Tween 80 est ajouté a 9
volume d'HA). Ce mélange est incubé à 4°C pour une
durée de 3 à 5 min.
La solution de Di-éthyle Ether (5 volume
de Di-éthyle Ether) est ajoutée sous agitation
à +4°C pendant 15 min. Le mélange, est par la suite
centrifugé à +4°C pendant 15 min à 3000 tours/min. La
phase aqueuse ainsi obtenue, est récupérée et
conservée à -20°C.
C'est le lot d'HA rubéolique (1/2013).
Figure 24: Lot d'hémagglutinine
V.3. Titrage de l'HA rubéolique par la technique
d'hémagglutination Après la production de l'HA rubéolique
vient l'étape du titrage.
Le titrage de l'HA se fait par la technique
d'hémagglutination.
L'hémagglutination est la capacité de
l'antigène (Ag) viral à agglutiner les globules rouges (GR).
Pour effectuer le test d'hémagglutination il faut:
? GR de pigeon; fournis par le service de Microbiologie
Vétérinaire de L'institut Pasteur de Tunis.
· Tampon Tacetal (annexe 4)
préparé et utilisé pour effectuer les différentes
dilutions.
· Tampon GGB (annexe 4)
préparé et utilisé pour le lavage des GR du pigeon.
· Ag rubéolique (Lot de l'HA rubéolique
1/2013).
V.3.1. Etape de titrage de l'HA
Trois lavages des GR avec le Tampon GGB sont
faits.
Les GR 0,25% sont mélangés avec le Tampon
Tacetal.
Dans une plaque de microtitration, la répartition des
solutions est comme suit:
· 75 ul de Tampon Tacetal ont
été mise dans la 1ère cupule.
· Dans les autres cupules 25 ul de Tampon Tacetal
sont ajoutés.
· Dans la 1ère cupule nous avons mis 25
ul de l'HA rubéolique.
· Le contenu de la 1ère cupule est
mélangé. 25ul de la solution (Tampon Tacetal
+HA) sont passés à la 2ème cupule.
Cette procédure est effectuée de la même
manière dans les 7 autres cupules, sauf dans la dernière
(témoin négatif).
Enfin 25 ul de GR dans toutes les cupules sont
ajoutés.
? Homogénéiser sur une brique de glace à
+4°C et laisser une heure à température ambiante à
l'abri des vibrations et chocs pour faire la lecture de la plaque.
Figure 25: Titrage de l'hémagglutinine
rubéolique
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