Contribution à l’étude de l’effet bactéricide de l’argile sur escherichia.

4. Méthodes

4.1. Protocole expérimental

Les étapes de l'expérimentation sont résumées dans la figure 2

E. coli ATCC 25922

E. coli de laboratoire

Bentonite de Maghnia

Repiquage sur gélose
Mac Conkey

Ré-Identification

Tamisage à 40 ?m

Stérilisation de la
bentonite à 110⁰C / 1h

Test microscopique

Test macroscopique

Tests biochimiques classiques

Galerie API 20E

Préparation d'une
solution mère (100 g /1L)
, et agitation pendant
2h

Préparation des dilutions

de 1⁰/₀ à 10⁰/₀

Standardisation McFarland 0.5

Antibiogramme

Méthode des disques de diffusion sur

gélose

Préparation des
disques à partir de
papier wattman
imbibés dans les
différentes dilutions
remplaçants les
disques d'antibiotiques

Témoins

Des disques
d'antibiotiques

Ensemencer l'E.coli sur la surface de la gélose MH puis l'ajout :

Ne rien ajouter (ni ATB ni argile)

Des disques argileux

Calcule de CMI

Figure 2 : Protocole expérimental

Chapitre II Matériel et méthodes

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4.2. Ré-identification des souches

4.2.1. Repiquage des souches d'Escherichia coli

Cette opération consiste d'abord à prélever quelques colonies d'E.coli à partir de ses milieux et à procéder ensuite à l'ensemencement des boites de pétri contenant le milieu de culture Mac Conkey :

· Refroidir et maintenir à 44-47 °C

· Couler en boîtes de Pétri stériles

· Laisser solidifier sur une surface froide

· Ensemencer l'E.coli à la surface des boîtes afin d'obtenir des colonies isolées par la méthode des stries serrées. Enfin, les boites sont incubées dans l'étuve à 37 C° pendant 24h.

- Les colonies lactose-positif présentent une coloration rouge et sont entourées d'un halo de sels biliaires précipités. Les colonies lactose-négatif sont incolores (Faure, 2010). (Annexe 1).

4.2.2. Tests d'identification d'Escherichia coui

I. Etude morphologique

I. 1. Examen macroscopique

Cet examen permet de déterminer la forme, la taille, pigmentation, contour, aspect et viscosité des colonies sur boîte de Pétri par une observation visuelle (Mami, 2013) ; L'aspect des colonies dépend du milieu, de la durée et la température d'incubation.

I. 2. Examen microscopique I. 2.1. Examen à l'état frais

- Principe

Cet examen nous permet d'apprécier la forme, la mobilité, le mode de regroupement, et l'abondance de notre bactérie.

- Mise en oeuvre

· Déposer aseptiquement sur une lame porte objet, quelques gouttes d'eau physiologique.

· Prélever à l'aide d'une anse de platine stérile une à deux colonies à partir du milieu contenant de la gélose nutritive.

· Emulsionner dans la goutte d'eau physiologique.

· Recouvrir d'une lamelle tout en évitant la formation des bulles d'air.

· Observer sous microscope optique grossissement (×40).

Chapitre II Matériel et méthodes

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- Lecture

A l'issu de cet examen microscopique, on peut observer la forme, le mode de regroupement et la mobilité des souches (Labiod, 2016).

I. 2.2. Coloration de Gram - Principe

La coloration de Gram est une technique qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne. Elle permet de colorer les bactéries et de distinguer leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram+) ou la fuchsine (Gram-). Cette opération se déroule en sept étapes.

-Mise en oeuvre

Réaliser un frottis sur une lame de microscope à partir d'une suspension bactérienne, agiter la suspension afin de l'homogénéiser et d'éviter d'avoir un culot au fond du tube.

· Etaler une goutte de la suspension bactérienne sur une lame propre.

· Procéder à la fixation du frottis en faisant passer la lame trois fois dans la flamme du bec bunsen.

· Plonger La lame pendant une minute dans le violet de gentiane, puis rincée à l'eau déminéralisée.

· Etaler le Lugol et laisser agir une minute puis rincer à l'eau. Cette étape à pour but de stabiliser la coloration violette.

· Verser goutte à goutte de l'alcool sur la lame inclinée obliquement. Surveiller la coloration (15 à 30 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer avec de l'eau.

- Si l'alcool pénètre dans la bactérie, la coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries donc sont de type Gram-, si l'alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram+.

· Réaliser une contre coloration avec de la fuchsine : laisser agir 30 secondes à une minute, laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame entre 2 feuilles de papier buvard.

Enfin, observer à l'objectif à immersion (X100) après dépôt d'une goutte de l'huile de cèdre. - Lecture :

Les bactéries Gram+ apparaissent en violet foncé, tandis que les bactéries Gram- sont colorées en rose (Labiod, 2016).

Chapitre II Matériel et méthodes

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II. Etude biochimique

II. 1. Recherche des enzymes respiratoires

II. 1.1. Test de la catalase -Principe

La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante : (Labiod, 2016).

- Mise en oeuvre

· Déposer sur une lame de verre une ou deux gouttes d'eau oxygénée.

· Prélever à l'aide de l'effilure de pipette pasteur un fragment de colonies et dissocier la culture dans l'eau oxygénée.

- Lecture

La présence d'une catalase se traduit en quelque seconde par la formation de bulles d'oxygène (Labiod, 2016).

II. 1.2. Test d'Oxydase -Principe

Ce test permet de mettre en évidence la phényléne diamine oxydase ou cytochrome oxydase des bactéries à partir de leur culture en milieu gélosé. Le réactif utilisé est un dérivé N-méthylé du paraphénylène diamine (composé réduit incolore) qui, en présence de l'enzyme, est oxydé et libère un composé rose violacé (forme oxydée semi-quinone), noircissant à l'air. La recherche de l'oxydase est un des critères les plus discriminatifs et les plus employés pour l'identification des bactéries, surtout celle des bacilles à Gram négatif en particulier pour Escherichia coui (Hennia, 2016).

-Mise en -oeuvre

Une goutte de suspension bactérienne à étudier a été déposée à l'aide d'une pipette Pasteur stérile sur un disque pré- imprègne du N-diméthylparaphénylene diamine

-lecture

Si le papier demeure incolore au bout de quelques secondes la bactérie est alors oxydase négative par contre si le papier devient violet la bactérie est considérée comme oxydase positive (Essodolom, 2016).