Coupes frontales de moelle épinière
Les segments lombaires T12 à S2 sont isolés et
nettoyés de leurs racines dorsales et ventrales, puis coupés
à l'aide d'un microtome à congélation en coupes frontales
sériées de 40 um recueillies dans du PB.
Immunohistochimie sur coupes flottantes
Fig 9: Schéma de la réaction
immunohistochimique - ABC (avidine/biotine)
Les coupes sont incubées pendant 60 minutes dans du
sérum normal de chèvre à 3% (NGST, Gibco BRL) dilué
dans du PBS contenant 0,3% de Triton X-100 (Prolabo). Cette étape permet
de bloquer les sites antigéniques non spécifiques susceptibles
d'être reconnus par l'anticorps secondaire (obtenu chez la
chèvre). Le Triton X-100 est un détergent qui perméabilise
les membranes et permet ainsi une meilleure pénétration des
différents réactifs.
Puis, les coupes sont incubées avec l'anticorps
primaire (dilué dans du NGST 1%) pendant 20 heures à 4°C.
Le lendemain, après 2 rinçages dans du
NGST 1%, les coupes sont incubées avec l'anticorps
secondaire biotinylé (anticorps anti-lapin obtenu chez la chèvre,
Laboratoires Vector) dilué dans du NGST 1%, pendant 1 heure, sous
agitation, à température ambiante.
Puis, après 2 rinçages au NGST 1%, le complexe
ABC-HRP (kit Vectastain, laboratoires Vector), dilué dans du PB 0,1M,
est ajouté et laissé incuber 1 heure sous agitation à
température ambiante.
La dernière étape (réaction enzymatique)
se fait par ajout de VIP.
La réaction est stoppée par plusieurs
rinçages successifs dans du PB 0, 1M.
Les coupes sont ensuite montées sur des lames
gélatinées, puis séchées à l'étuve
à 37°C pendant au moins 30 minutes.
Une déshydratation est effectuée dans des bains
successifs d'éthanol à 75%, 90 % et absolu.
Après un dernier bain dans du toluène, les lamelles
sont montées sur les lames avec de l'Eukitt (Baume d'inclusion pour
techniques histologiques, O.Kindler GmbH & Co.).
Analyses des résultats et statistiques
Les coupes sont regardées au microscope optique,
objectif 10. Les noyaux marqués sont dessinés grâce
à une chambre claire, sans tenir compte de l'intensité du
marquage. Ils sont ensuite comptés à l'intérieur de six
zones délimitées arbitrairement :
Fig10 : Schéma du système nerveux
périphérique du rat. Les nombreuses ramifications expliquent
comment une stimulation nociceptive localisé peut engendrer du marquage
Fos dans de nombreux segments.
> zone 1 : les couches superficielles (couche I et couche
II)
> zone2 : les couches III et IV
> zone3 : les couches V et VI
> zone4 : la partie ventrale (couches VII,VIII et corne
ventrale)
> zone5 : la couche X
> zone6 : le noyau parasympathique spinal (SPN)
Le comptage des neurones c-Fos est effectué sur 5
coupes par segment, non consécutives et représentatives du
marquage. Cette analyse est réalisée sur les différents
groupes. Si les groupes sont homogènes, on réalise une ANOVA
suivie d'un test de Fisher (PLSD, logiciel Statview 4.0).
Résu ltats
Ø Le RU-486 n'a pas d'effet significatif sur l'expression
spinale de la protéine c-Fos dans les segments T12 à S2 quelque
soit le délai.
Ø Les segments où l'expression du c-Fos est
maximale sont L5 et L6. Ces segments correspondent aux afférences
principales du nerf pelvien (voir fig.13).
Ø La distribution au cours du temps du marquage est la
suivante :
témoins < -3h < 0 h < 1h < 2h
> 4h
Ø Dans tous les segments la distribution du marquage par
couche est la suivante : Couches ventrales > couches V -VI > X > II-IV
<I-II Conclusion :
La parturition induit l'expression du c-fos dans les
régions de projection des afférences nociceptives. La
distribution du marquage laisse supposer que la composante nociceptive est
surtout mediée par le nerf pelvien en provenance du corps de
l'utérus et du col de l'utérus.
Compte tenu du temps nécessaire pour l'induction et la
synthèse de la protéine C-Fos, le marquage à 1h et
à 2h est probablement dû aux stimuli qui ont lieu avant et pendant
l'expulsion du premier petit.
Ces premiers résultats suggéreraient que lors de
la parturition chez le rat les segments spinaux qui reçoivent des
stimulations nociceptives sont ceux qui reçoivent les afférences
de l'utérus, du segment inférieur de l'utérus, de la
vessie et du rectum.
Il n'est pas démontré qu'il s'agit forcement des
afférences nociceptives. Mais la présence des neurones
immuno-positifs dans les couches I-II, V-VI, X et du SPN10 le
suggèrent fortement (cf. Fig. 12).
10 noyau parasympathique spinal
Fig. 13 : Graphique supérieur
: Distribution du nombre moyen par coupe de 40 um des neurones
exprimant la protéine c-Fos dans la moelle épinière chez
des rates non gestantes et des rates parturientes à 1 heureet 2 heures
aprèla naissane du premier petit.
Fig.12 : Répartition des
neurones c-fos en fonction des
Schéma inférieur : projection
des afférences sensitives issues de l'utérus.
Il est à noter le pic de l'expression de la
protéine c-Fos dans les segments L5 et L6, qui correspondent aux
afférances du nerf pelvien.
L'expression c-fos ets maximale à 2h, elle est
également très forte à 1h. Compte tenu du délais
d'expression de la protéine, on peut admettre que celle-ci est induite
par les contractions utérines qui précédent l'expulsion du
premier petit.
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