Aspects génétiques et moléculaires de la réponse générale aux stress chez Escherichia coli : le régulon RpoS

II) Caractérisation des promoteurs du régulon RpoS

Le facteur óS reconnait in vitro des séquences -10 presques identiques à celles du facteur ó70 (CTATA(c/a)T pour EóS, et TATAAT pour EóS, Tanaka et al., 1993, cité par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003), ce qui peut s'expliquer par une similarité importante des « DNA Binding domaine » des deux facteurs ó (Lonetto et al., 1992, cité par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003). Cependant, le facteur óS est aussi capable de reconnaitre des promoteurs qui lui sont spécifique et ne reconnait pas certains promoteurs spécifiques à ó70. Cette reconnaissance spécifique est importante pour la compréhension des phénomènes de régulations dépendants de RpoS. On peut expliquer de plusieurs manières la reconnaissance d'un promoteur par óS : par une spécificité de séquence du promoteur (auquel cas ó70 ne pourrai pas reconnaitre le même promoteur), par la nécessité d'une protéine régulatrice supplémentaire indispensable à la reconnaissance d'un promoteur donné par óS, ou par des facteurs intracellulaires, comme le degré de compaction de l'ADN, l'alarmone ppGpp, la concentration élévée en sels (Hengge-Aronis 1998 et 2002, Ishihama, 2000, Vicente et al. 1999, cités par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003).

Des études ont été menées afin de définir par biologie moléculaire une séquence consensus pour les promoteurs reconnus exclusivement par óS, mais aussi pour déterminer quelles étaient les bases moléculaire de la reconnaissance des promoteurs par óS et ó70.

Lacour, Kolb, et Landini (2003, référence 5.) ont étudié l'importance des nucléotides dans la région -10 du promoteur du gène aidB, impliqué dans la réponse aux agents alkylants de l'ADN. Ce gène est régulé par la protéine Ada (Volkert et al., 1986), qui, sous sa forme méthylée, peut activer la transcription par Eó70 et EóS, mais en l'absence de Ada, l'expression de aidB est strictement dépendante de EóS (in vitro, Eó70 se fixe au promoteur PaidB en raison de l'excès d'ARN polymérase Eó70 mais est incapable de former le complexe ouvert et donc d'activer la transcription, et EóS peut activer la transcription in vitro sans protéine annexe). Ce promoteur (PaidB) est donc un modèle potentiel d'étude des promoteurs exclusifs de óS ne nécessitant pas l'intervention d'une autre protéine. Dans d'autres études, 7. CHECROUN, et al, 2004, et 6. LACOUR, et al, 2004 ont déterminé quelles étaient les caratéristiques de DNA Binding Domaine de óS et de ó70 qui étaient impliqués dans cette sélectivité.

Matériels et méthodes

Souches et plasmides. Les souches utilisées par LACOUR, KOLB, LANDINI(référence 5., 2003), et LACOUR, et al, (référence 6. 2004), sont MV1161 et son dérivé rpoS^- MV2792 (souches dérivées de K12). Ces souches ont été transformées par le plasmide pRS1274, portant une fusion lacZ sous le contrôle d'un promoteur PaidB sauvage ou mutant (dont PaidB_(C12T)). (figure 6) Les mutants de PaidB ont été produits par PCR avec des amorces permettant la substitution contrôlée de certains nucléotides, et insérés dans le plasmide pRS1274 (pour la transcription in vivo) ou pJCD01 (pour la transcription in vitro), grâce aux sites de restriction BamHI-EcoRI. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, et 6. LACOUR, et al, 2004)

Les souches utilisées par 7. CHECROUN, et al, 2004 sont de nombreux dérivés de MC4100 mutées sur rpoS (Diaz et al.1991, cité par 7. CHECROUN, et al, 2004) et portant différentes mutations sur le promoteur du gène osmEP (obtenues de la même manière que les mutants PaidB, fig 7) en fusion avec lacZ. Les souches sont transformées par le plasmide pBDArpoS décrit ci-dessous, et sont cultivées en LB avant d'être déposées sur milieu de MacConkey (colonies rouges si lac+)

Obtention de facteurs sigma mutants. Les protéines ó70 mutés et taggés 12-Histidine ont été obtenues en mutant directement le gène RpoD (codant ó70) sur le plasmide pET-21ó grâce au kit QuickChange (Strategene). Les mutations effectuées donnent pour phénotype ó70_(Q437H), ó70_(T440I) et ó70_(T440E). Les óS mutants ont été obtenus par amplification PCR du plasmide pBADrpoS (contenant rpoS sous contrôle du promoteur araB) avec amorces permettant l'introduction contrôlées de mutations. Ces mutations ont été localisées dans les régions 2 et 4 de óS grâce au choix des primers (6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004). Les mutants óS étudiés par 6. Lacour et al., 2004 portent les acides aminés Q152A et E155A.

Transcription In Vivo. Les bactéries ont été cultivées une nuit en LB à 37°C, puis les cultures ont été diluées à DO_600nm=0.02 pour réduire l'activité â-galactosidase. L'activité â-galactosidase a été mesurée comme indiqué précédement, et comparée à celle mesurée chez une souche transformée par un plasmide pRS1274 sans promoteur (contrôle). (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Purification des facteurs ó et de l'ARN polymérase coeur, reconsitution de l'holoenzyme. Les protéines ont été purifiées selon le protocole décrit par Tanaka et al., 1995 et Gribskov et al., 1983 (cités par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003). L'holoenzyme (EóS ou Eó70) a été reconstituée par incubation de l'enzyme coeur avec soit óS soit ó70 au ratio 1:4 pendant 30 min à 37°C. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Transcription In Vitro. L'expérience de transcription unique a été réalisée dans un tampon K-glu200 avec le plasmide pJCD01 (3nM) surenroulé portant soit le PaidB sauvage soit un des mutants créés, et l'holoenzyme EóS(50nM) ou Eó70(100nM), ainsi que les dNTP (500ìM) dont du [á³²P]UTP et incubés 15min à 37°C. La réaction a été arrêtée par addition de 10ìL de tampon (formamide, EDTA, xylène cyanol et bleu de bromophénol). Après chauffage à 65°C, les échantillons ont été déposés sur un gel de polyacrylamide de séquençage à 7%. La quantification des produits de transcription a été réalisée avec un PhosphorImager et normalisée à la production standart d'ARN. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Gel Retard. L'holoenzyme reconstituée Eó70 ou EóS (5 à 50 nM) et des fragments d'ADN de 180pb correspondants aux promoteurs (1nM) ont été incubés pendant 16min à 37°C, puis déposés sur une gel de polyacrylamide non dénaturant à 5%. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, et 6. LACOUR, et al, 2004)

Dosage â-galactosidase. La mesure de l'activité â-galactosidase a été effectuée comme indiqué précédement, en absence d'arabinose. (7. CHECROUN, et al, 2004)