Résultats et discussion
Un promoteur consensus ? Les auteurs Lacour,
Kolb, et Landini (référence 5., 2003) ont choisi de focaliser
les mutations du promoteur PaidB sur quatres
éléments : (i) un dinucléotide TG, typique des
promoteurs ó70-dépendants à boîte -10
étendue, mais ici à une position unusuelle (-16/-15 au lieu de
-13/-12, cette position ne permet pas la transcription par Eó70), (ii)
le résidu -13C (Eó70 a besoin absolument d'un T à cette
position), (iii) le résidu -12C, premier nucléotide de
l'hexamère -10, (iv) enfin, le -6A a été muté en T
car un T à cette position semble conservé dans les autres
promoteurs óS-dépendants. Globalement, il a été
montré grâce au gel retard que EóS (l'ARN polymérase
chargée du facteur sigma S) a plus d'affinité pour PaidB
que Eó70. In vivo, il a été confirmé
l'incapacité de Eó70 à activer la transcription si le
dinucléotide TG est en position -16/-15 au lieu de -13/-12, alors que
EóS en est capable : il est suggéré que ceci est dû
à la flexibilité du domaine 2.5 (reconnaissance de la boîte
-10) de óS. La substitution ou délétion du C en -13 a pour
effet la perte de spécificité de la reconnaissance du promoteur
par óS. Particulièrement, la substitution du C en G favorise
grandement la reconnaissance par ó70. On en conclue que ce
nucléotide -13C aide beaucoup à la fixation et à la
formation du complexe ouvert par EóS, ce qui confirme des observations
effectuées sur d'autres promoteurs de gènes du régulon
RpoS. La substitution du -6A n'a eu aucun effet sur la transcription de
aidB, ce qui prouve que les nucléotides apparaissant
conservés dans les analyses in silico des promoteurs n'ont pas
toujours de signification physiologique, ou alors ce nucléotide a une
importance chez d'autres promoteurs mais n'a pas de rôle à jouer
chez PaidB. La substitution du C en -12 en T améliore
grandement la transcription par Eó70 (quasi nulle si le
nucléotide -12 est un C) : la sélectivité de EóS
est perdue si cette position est occupée par un T. Les auteurs ont
étudiés les promoteurs de 57 autres gènes
dépendants à óS, et on constaté que 33% d'entre eux
avaient autre chose qu'un T à cette position (dont 16% de C). Des
expériences complémentaire de mutagénèse sur
certains de ces promoteurs leur on permis de déterminer deux classes de
promoteurs óS-dépendants : ceux qui possèdent autre chose
qu'un T en -12, et qui sont strictement dépendants de óS sans
nécessiter de facteurs additionnels, et ceux qui peuvent être
reconnus par ó70, possédants toujours un T en premier position de
l'hexamère, et pour lesquels la sélectivité
ó70/óS dépend d'un autre facteur (protéine
additionnelle).
Les expériences de transcription in vitro
confirment parfaitement ces observations, à la différence que
l'excès d'holoenzyme peut parfois forcer la fixation sur le promoteur,
les résultats ne sont donc pas du même ordre. Ces
expériences ont donc permis de déterminer l'importance
physiologique de la conservation de certains nucléotides des promoteurs
óS dépendants. Les auteurs proposent alors un nouveau consensus
pour les promoteurs strictement dépendants de RpoS :
TG(N)0-2CCATA(a/c)T, opposée à TGGTATAAT,
séquence optimale pour la reconnaissance par Eó70. Un recherche
dans la base de donnée Colibri montre que cette séquence est
retrouvée dans les 200pb précédent 14 ORF ou
opérons en plus de aidB.
La sélectivité sans facteurs additionnels peut
alors être expliquée par une tolérance accrue de óS
aux divergence de la séquence -10 des promoteurs par rapport à
ó70 : ó70 ne supporte pas la substitution du T en -12, et ne peut
pas permettre la formation du complexe ouvert si le dinucléotide TG
n'est pas en position -13/-12. óS lui peut reconnaitre les promoteurs
divergeants sur ces points, avec (dans le cas du TG) ou sans (dans le cas du
-12T) l'aide de protéines additionnelles. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI,
2003).
Mécanismes moléculaires de la
sélectivité ó70/óS. Le gène
osmEP dépend de ó70 en phase stationnaire, et de
óS en phase exponentielle, et de mutants de ce promoteurs ont
été isolés. Parmi eux, osmEP13T, qui
possède un T à la place du C normalement présent en -13.
Ce mutants et d'autre mutants de osmEP (comme osmEP32G) ont
été utilisés par Checroun et al (référence
7., 2004) pour identifier de mutants de RpoS supprimant ces mutations, afin de
caractériser les interactions promoteur-acides aminés
impliquées dans la sélectivité de óS. Le criblage
est effectué sur milieu MacConkey : les colonies rouges (lac+)
portent un óS capable de transcrire le gène rapporteur sous
contrôle d'un promoteur osmEP muté. Les mutants
suppresseurs obtenus sont indiqué table 2. Les mutations supresseurs
n'affectent que trois acides aminés : Q152, E155 et R299, qui
appartiennent aux régions 2.4 (Q152 et E155), correspondant à la
zone impliquée dans la reconnaissance de la boîte -10 chez
ó70, et 4.2 (R299) semblable à la zone impliquée dans la
reconnaissance de la boîte -35 chez ó70. Ces acides aminés
correspondent aux Q437, T440 et R584 chez ó70. (figure 8) Les
activités de transcription des promoteurs mutants par ces óS
mutants ont été mesurées (figure 9). Des homologues de
óS chez 21 autres bactéries Gram- portent les même acides
aminés à ces mêmes positions. Il résulte de cette
étude que R299 interagit avec la guanine du dinucléotide CG en
position -31, mais cette interaction ne semble qu'amélorier la
reconnaissance du promoteur. En effet, de nombreux promoteurs óS
dépendants sont pourvus de boîte -35 très
dégénénées ou n'en ont pas (Espinosa-Urgel et al.
1996, cité par 7. CHECROUN, et al, 2004). De plus, il est
démontré que ce sont les acides aminés Q152 et E155 qui
procurent la capacité à óS de reconnaitre les C en
position -13, comme le montre la supression de la mutation osmEP13C
par le mutant rpoS Q152R. Des données structurales sur
l'analogue de óS chez Thermus aquaticus montre que les
équivalents de ces deux acides aminés appartiennent à deux
á-hélices formant une pince sur le grand sillon au niveau des
nucléotides -12/-13, ce qui expliquera leur rôle majeur dans la
reconnaissance de ces nucléotides (Protein Data Bank).
Une autre étude semblable, menée par Lacour, et
al (référence 6, 2004), utilisant le promoteur PaidB (sauvage ou
portant une substitution du -12C en T), visait à identifier des mutants
de ó70 capable de transcrire ce promoteur. (figure 10) Il en a
été conclu que les facteurs ó70 mutés Q437H et
T440E étaient capables de former un complexe ouvert compétent
avec le promoteur PaidB qui porte un C en -13, mais conservait une
infériorité par rapport à óS vis-à-vis de
l'affinité et de l'efficacité de transcription. La grande
spécificité de óS pour les promoteurs comprenant ce
nucléotide et sa capacité à les transcrire efficacement
dépend donc en majeure partie de ces deux nucléotides.
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