B/Prélèvements effectués
Les mêmes prélèvements sont
réalisés comme dans la série A à J0 -J 8 - J19 et
J21.
C/Techniques de prélèvement
· Méthode non destructive
Le nombre 60 de prélèvements par
échantillon a été choisi pour constituer un
échantillon statistiquement représentatif et nécessaire
pour détecter avec une probabilité de 95% un
prélèvement positif si l'infection est présente dans la
population à un taux de 5% ceci conformément aux recommandations
de l'O.I.E (2008) et conformément à la directive
européenne 2160/2003 du 17 novembre 2003 relative au contrôle des
salmonelles et d'autres agents zoonotiques spécifiques présents
dans la chaine alimentaire.
Des frottements énergiques sont effectués
horizontalement et verticalement (10-12 passages) (figure 15 et 16) et les
écouvillons sont constitués en pools (5 unités par pool).
Les oeufs (à couver ou embryonnés) sont mis en sac stérile
et identifiés. Le tout est acheminé sous froid
(température de réfrigération) dans une glacière en
1 à 3 heures après le prélèvement (en fonction de
la distance) au LVRT, laboratoire de l'INMV.
Figure 15 : Prélèvements de surface des
machines et murs
Figure16 : écouvillonnage des oeufs (Couvoir A) et
prélèvement d'eau (couvoir B)
· Méthode destructive
Pour l'analyse du contenu des oeufs à couver et des
oeufs embryonnés, nous avons procédé aseptiquement
à une ouverture par le grand bout de l'oeuf et à l'aide d'une
pipette nous avons récolté le contenu.
Analyse des organes: après sacrifice des
poussins dans la salle d'autopsie du LVRT, les organes (foie, intestin,
estomac, coeur et poumons) ont été prélevés (figure
17) et mis en pool de 5 dans des boites de Pétri stériles pour
être analysés au niveau du service de microbiologie.
Figure 17 : Prélèvements de poussin (1) et
d'organes après autopsie (2)
Prélèvements d'eau
· Pour être analysée, l'eau utilisée
dans le couvoir a été prélevée en début et
en fin de circuit dans des flacons stériles de 100 ml (figure 16) pour
juger de sa qualité en prenant une série de mesures
hygiéniques (se laver et se désinfecter rigoureusement les mains
sont de règle) :
· Le robinet a été aseptisé à
la flamme d'un briquet ordinaire puis on a laissé couler l'eau une
à deux minutes.
· Remplir à ras bord et en prenant soin de ne pas
toucher le flacon stérile de 100 ml avec l'extrémité du
robinet.
· Refermer soigneusement le flacon d'échantillon
d'eau à analyser.
· Acheminer au laboratoire d'analyse sous une
température de réfrigération dans les
quelques heures
qui suivent le moment du prélèvement (au maximum en 3 heures).
2.2.2 METHODES BACTERIOLOGIQUES
2.2.2.1 Traitement des chiffonnettes et des
écouvillons
Les pools des chiffonnettes et écouvillons sont
séparés et divisés en deux pour réaliser un
enrichissement.
Figure 18 : Enrichissement et mise en culture à
37°C
Nous avons opté pour deux milieux de culture:
Un milieu non sélectif : le bouillon T.S.B
qui permet la croissance de la flore totale, c'est à dire
la plus grande majorité des germes aérobies ou anaérobies
(dont les exigeants) sans avoir recours à des substances nutritives
complémentaires.
Un milieu sélectif (Rapapport de
Vassiliadis) pour les Salmonelles, selon
la norme ISO 6579 (2002) recommandées par les laboratoires de
référence.
L'incubation dans une étuve microbiologique pendant 24
heures réglée à 37°C (figure 18).
2.2.2.2 Traitement des oeufs
Les OAC sont pesés à l'aide d'une balance de
précision (figure 10) puis groupés en lot de 12 pools de 5 oeufs
par pool. Après mise en suspension dans un milieu TSE le contenu est
analysé (flore totale et Salmonelles).
2.2.2.3 Traitement des poussins
Avec la même balance, le poids des poussins est pris
à l'âge de J1 au niveau du LVRT. Les
animaux sont
sacrifiés dans la salle d'autopsie pour extraire le TD, le foie,
l'estomac, le coeur
et les poumons. Ces organes sont groupé en lot de 5 par
pool afin d'analyser d'éventuelle contamination.
2.2.2.4 Identification bactérienne
Au bout de 24 heures d'incubation des écouvillons et
des chiffonnettes, à l'aide d'une anse en platine iridium, on a
réalisé des ensemencements sur gélose nutritive
(GN) pour pouvoir réaliser ensuite la catalase et sur
gélose Hektoen pour les Entérobactéries
et les Pseudomonas (figure 19). On a
réalisé un étuvage de 24 heures puis un repiquage pour les
colonies non pures suivi d'un étuvage de 24 heures pour obtenir une
culture pure et pouvoir réaliser une identification à partir des
différents caractères biochimiques.
Figure 19 : boite de petri GN (1) et HECTOEN (2)
Après étalement sur lame, séchage
naturel et fixation par passage sur la flamme du bec Bunsen, on réalise
une coloration de Gram qui consiste à appliquer du violet de gentiane
pendant une minute puis du lugol pendant 20 secondes (mordançage) avant
de rincer à l'eau, réaliser une décoloration à
l'alcool pendant 1 minute, recolorer avec de la fuchsine durant 1 minute puis
laver et sécher la préparation.
L'identification des bactéries
Gram+ ou Gram- se fait
par observation au microscope optique, à l'immersion (grossissement
final X 1000).
A partir des Gram+ : on
différencie les Micrococcaceae
(catalase+) qui comprennent les aeroaerobies
facultatifs coagulase+ (staphylocoques
pathogènes), et les streptocoques
(catalase-) qui renferment les streptocoques D.
A partir des Gram- : le test de
l'oxydase permet de distinguer les entérobactéries
(oxydase-).
Identification des entérobactéries à
l'aide d'une galerie biochimique: Cette galerie (figure 20) comporte les
tests suivants :
Gélose T.S.I (gélose
glucose-lactose-saccharose-H2S): utilisation des sucres et production de
gaz.
Milieu mannitol-mobilité-nitrate :
utilisé pour la différenciation rapide des
entérobactéries, en recherchant la mobilité, l'utilisation
du mannitol et la réduction des nitrates.
Milieu au citrate de sodium (milieu de
Simmons) : milieu solide utilisé pour l'identification
des bacilles GRAM négatif.
Milieu urée-indole : Eau physiologique+
disque O.N.P.G
Milieux O.D.C-A.D.H et
L.D.H
Figure 20 : Galerie des
entérobactéries+salmonelles
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