CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES
2.2.2. Dosage de l'activité lipasique par
titration des AG
L'activité lipasique a été
déterminée, à l'aide d'un pH-stat (SI ANALYTICS
Titroline® 7000), à pH= 8 par titration des
acides gras libérés avec une solution de NaOH (0,1N). Le substrat
utilisé est une émulsion d'huile d'olive à 10 % (10 ml
d'huile d'olive dans 90 ml de gomme arabique à 10
%).
L'activité enzymatique est exprimée en
unité internationale (UI). Une unité d'activité
lipasique correspond à la libération d'une
micromole d'acide gras par minute (umol/min). La cinétique et le calcul
de l'activité enzymatique sont donnés automatiquement par
l'appareil.
2.2.3. Récupération de la lipase
La précipitation est utilisée pour purifier
partiellement et concentrer les protéines solubles dans le surnageant.
L'acétone entre en compétition avec les protéines pour
réagir avec les molécules d'eau. Ceci entraîne une
désolvatation suivie d'une précipitation. La précipitation
fractionnée des protéines a été
réalisée par l'addition de l'acétone froid en faible
quantité au surnageant de culture, sous agitation douce à
4°C jusqu'à de saturation (3v/v) ; après les
protéines précipités sont récupérées
par centrifugation à 12000×g pendant 25min, Le culot est remis
immédiatement en suspension dans le minimum de tampon tris-Hcl
20mmol.
2.3. Optimisation des paramètres de cultures de la
lipase
Dans toute recherche expérimentale, comme c'est le cas
en biochimie, le chercheur essaye toujours de trouver la meilleure
stratégie pour conduire ses expériences. Les plans
d'expériences sont une méthodologie de choix pour répondre
à cette préoccupation. Ils sont, en effet, applicables à
toutes les disciplines expérimentales où l'on recherche le lien
existant entre un gradeur mesurée, y, et des variables, xi, qui peuvent
modifier sa valeur, c'est-à-dire l'étude et l'analyse de la
relation y = f (xi).
Avec la méthodologie des plans d'expériences, on
obtient les informations les plus fiables en un minimum d'essais. Les effets
des différents facteurs intervenant dans le processus
étudié, sont alors quantifiés et les conditions optimales
définies. Avec le développement de l'outil informatique et
l'apparition de logiciels performants, cette tache est rendue encore plus
facile.
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