III. Contrôle
de l'amplification
III-1
Électrophorèse sur gel d'agarose (Delpech. M et al.
1999).
L'ADN, après extraction cellulaire et amplification par
PCR, peut être analysé sur gel d'électrophorèse.
a) Principe
Le contrôle des produits PCR se base sur le principe de
la séparation et l'identification des fragments d'ADN amplifié
des éventuels fragments non spécifiques en fonction de leur
taille et leur purification des restes des réactifs d'amplification dans
un champ électrique homogène. Les ADN sont des
macromolécules polyanioniques uniformément chargées
négativement, la charge relative de l'ADN étant constante. De ce
fait, l'ADN peut migrer dans un champ électrique de la cathode (-) vers
l'anode (+) dans un tampon de migration 1X, soit dans du TAE ou dans du TBE.
Les échantillons sont mélangés à
un colorant, le bleu de bromophénol de masse moléculaire faible
par rapport au fragment d'ADN pour marquer le fond de migration et de les
suivre au cours de l'électrophorèse. Pour nous, le tampon est
coloré par un colorant vert le green. Il s'avere inutile d'utiliser un
autre colorant lors de l'électrophorèse.
On additionne aussi au gel le BET, réactif intercalant
qui se fixe entre les bases nucléiques à l'intérieur de la
double hélice. Cette molécule naturellement non fluorescente
présente une fluorescence orange lorsqu'elle est intercalée entre
les bases nucléiques et après excitation aux longueurs d'ondes
ultraviolettes.
Après migration, on place le gel au dessus d'un
éclairage ultraviolet qui servira à exciter les molécules
de BET* fixées aux molécules d'ADN, lesquelles vont
émettre une lumière rougeâtre visible et photographiable,
permettant de visualiser la position des fragments d'ADN sur le gel.
b) Préparation du gel de
migration
Le contrôle a été
réalisé par électrophorèse horizontale sur un gel
d'agarose à 1,5%, colorés par le BET on ajoute 0,45 g d'agarose
à 30 ml de tampon TBE 1X (Tris-Boric-EDTA). Le mélange est
porté à ébullition sous agitation jusqu'à
dissolution totale de l'agarose et l'obtention d'un liquide transparent.
Après refroidissement, on additionne 10 ul de BET*. On fait couler 30 ml
de gel doucement à l'horizontale dans un bac à
électrophorèse muni d'un ou de plus de peignes de 8 dents selon
le nombre d'échantillons déposés, dont les empreintes
formeront des puits au sein du gel servant au dépôt des
échantillons à tester aussi bien pour le marqueur de taille et le
témoin négatif. On laisse le gel se refroidir jusqu'à ce
qu'il durcisse. Le gel polymérisé est recouvert de 10 ml de TBE
1X et le peigne est retiré.
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