III-2
Électrophorèse et visualisation des produits
d'amplification
On procède, enfin, à l'étape de
révélation des produits amplifiés. La
spécificité des bandes observées sur gel est
confirmée à l'aide des marqueurs de tailles M. Les produits PCR
doivent être visualisés afin de vérifier
l'efficacité de l'amplification et de déterminer le
génotype des échantillons étudiés. Pour cela, les
10 ul de chaque produit d'amplification des échantillons sont
déposés lentement dans les puits du côté de la
cathode selon l'ordre des échantillons dans les tubes PCR. Un marqueur
de taille de poids moléculaire connu est déposé aussi en
parallèle avec les échantillons préalablement
mélangés avec du bleu de bromophénol qui permet de suivre
leur migration au cours de l'électrophorèse pour estimer la
taille des amplicons.
Le gel de migration est recouvert de 20 ml de tampon basique
TBE 1X, de telle manière à assurer un contact entre l'anode et la
cathode. Après diffusion dans le gel, l'électrophorèse est
démarrée à 120V, 50 mA pendant 10 à 20 minutes.
Cette durée dépend toutefois de la taille des fragments
amplifiés.
A la fin de l'électrophorèse, le gel est
visualisé, puis photographié au dessus de l'éclairage UV
qui servira à exciter les molécules de BET fixées aux
molécules d'ADN, lesquelles vont mettre une lumière
rougeâtre visible, mais surtout photographiable pour vérifier la
visualisation puisque le BET permet de visualiser sous UV les fragments d'ADN
ainsi que la position des fragments du marqueur de taille qui doit
apparaître sous forme de bandes fluorescentes. Cette analyse permet de
vérifier la spécificité de la séquence
amplifiée. Pour cela, on doit s'assurer de la taille de la bande
correspondante à cette séquence, ce qui permet de
déterminer des génotypes et de vérifier que le produit PCR
du témoin négatif ne montre pas de bande amplifiée pouvant
correspondre à une contamination par un ADN étranger. Les
réactions ne sont considérées positives que lorsque le
contrôle positif (contrôle interne) est amplifié. Selon la
présence ou l'absence de la bande amplifiée, on peut
déduire le génotype de chaque individu. Par exemple, pour le
génotype a/a, on observe une bande spécifique qui correspond
à l'allèle a et l'absence de la bande correspondant aux produits
amplifies spécifique à l'allèle b. Pour tous les
échantillons, on observe la présence de bandes qui correspondent
au HGH (contrôle interne).
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