Bio-écologie des anophèles de part et d'autre de la falaise des Mbô et leur implication dans la transmission du paludisme d'altitude

2.2.2. La capture par pulvérisation intra-domiciliaire d'insecticide 

Cette méthode encore appelée "Capture au pyrèthre^*(*)" (WHO, 1975)permet de récolter les espèces endophiles et d'avoir des spécimens semi-gravides. Les pulvérisations étaient réalisées dans le maximum de domiciles entre 15h et 17h. A l'intérieur des chambres, des draps blancs étaient étalés sur toute la surface du sol (pour faciliter la visualisation) et les ouverturesétaient fermées. Après avoir mis à l'abri les aliments et ustensiles susceptibles, l'insecticide était pulvérisé. Après le knock-down^*(*)* et la dissipation de l'insecticide, les moustiques assommésétaient ramassés et rangés dans des boîtes pour l'identification et les analyses ultérieures.

2.3. IDENTIFICATION DES MOUSTIQUES

L'identification des moustiques se fait en deux phases :

- l'identification morphologique est faite juste après les récoltes et permet de distinguer les différentes groupes ou complexes d'espèces ;

- l'identification moléculaire faite au laboratoire permet de discriminer les complexes d'espèces qui ne peuvent pas être différenciées morphologiquement.

2.3.1. Identification morphologique

L'identification morphologique des moustiques se faisait au courant de la nuit ou tôt le matin après les captures sous une loupe binoculaire (×40) en s'aidant des clés d'identification des anophèles de Gillies et De Meillon (1968) et Gillies et Coetzee(1987).Les moustiques appartenant au genre Anophelesétaient rangés dans des tubesde 1,5 ml contenant du sillicagel (déssicant) recouvert d'une couche de coton. Ces tubes numérotés étaient alors conservés dans une glacière contenant des "iceblocs" avant d'être rangés à -20°C.

2.3.3. Identification moléculaire

Les analyses approfondies sont effectuées au laboratoire de paludologie de l'OCEAC à Yaoundé. Les échantillons ramenés du terrain sont conservés au congélateur à -20°C. Après l'identification morphologique, ceux appartenant au complexe An. gambiaesont utilisés pour les analyses génétiques.

2.3.3.1. Identification des membres du complexeAn gambiae

Elle se fait par des analyses comparatives du matériel génétique des spécimens. La première partie du travail consiste à isoler ce matériel génétique (ADN), ensuite l'amplifiersuivant la technique de PCR(polymerase chain reaction), et enfin la migration de l'ADN amplifié sur gel d'agarose.

Extraction de l'ADN

Principe : La technique d'extraction est basée sur la notion de solubilité différentielle des molécules entre deux phases non miscibles. L'extraction se fait par la technique de précipitation par l'alcool décrite par Cornel et Collins (1996), sur deuxà trois pattes par moustique.

Protocole : Pour chaque échantillon, les pattes sont placées dans unmicrotube stérile de 1,5 ml contenant 50 ul de tampon de broyage(Annexe 1, Tableau A). A l'aide d'un broyeur à piles, les pattes sont entièrement macérées et le broyat est incubé pendant 30 min dans un bain sec à 65°C. On y ajoute ensuite 13ul d'acétate de potassium 8M et on homogénéise aussitôt la solution grâce à un Vortex. Ce mélange est ensuite incubé 30 min dans la glace pour précipiter les débris cellulaires, puis centrifugé à 1400 tours/min à 4°C pendant 15 min. Le surnageant est transféré dans un autre tube auquel on ajoute 200 ul d'éthanol 100% à -20°C et on laisse au repos à température ambiante pendant 5 min pour que l'ADN puisse précipiter au fond du tube.

Une nouvelle centrifugation à 14000 tours/min pendant 20 min permet la formation d'un culot d'ADN peu visible au fond du tube. Après avoir vidé l'éthanol, le culot est rincé avec 200 ml d'éthanol 70% et passé au séchoir sous vide (speed-vac). L'ADN ainsi isolé est reconstitué dans 100ul d'eau distillée stérile et laissé à 4°Cpendant au moins 12h.

* ^* Plante dont les fleurs produisent une poudre insecticide

* ^** Temps nécessaire pour que l'insecticide agisse sur les moustiques