5) Matériels et Méthodes
5.1) Création des plasmides d'expression
5.1.1) Clonage de PRODH sauvage dans le vecteur
d'expression pQE-31
L'ADNc de PRODH sauvage a été
obtenu au laboratoire par RT-PCR à partir d'ARNm extraits de
cellules humaines, puis cloné dans un plasmide eucaryote pcDNA3
(Invitrogen). Le clonage des 1800 nucléotides de la région
codante de PRODH dans le vecteur d'expression procaryote pQE-31
(Qiagen) se déroule en plusieurs étapes. Des souches E. coli
DH5á transformées par le plasmide pcDNA3 sont mises
en culture et sont utilisées pour réaliser une
minipréparation d'ADN plasmidique. L'ADNc de PRODH sauvage,
encadré par
les sites de restriction reconnus par les enzymes BamHI
et KpnI, est linéarisé par digestion avec ces 2 enzymes
à 37°C pendant 2 heures. En parallèle, le vecteur pQE-31,
qui contient
ces 2 sites de restriction au niveau de son site de clonage
multiple, est également digéré par
BamHI et KpnI dans les mêmes conditions.
Les produits de digestion sont séparés et purifiés
sur gel d'agarose à 0.9 % en découpant les
bandes correspondantes avec le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen).
Après estimation de la concentration finale des produits par mesure des
absorbances à 260 et 280 nm, la ligation entre l'insert PRODH
sauvage et le plasmide pQE-31 linéarisé est
réalisée avec la T4 DNA ligase (New England Biolabs)
à 16°C pendant 24 heures.
Le produit de ligation est transformé dans des souches
chimiocompétentes E. coli BL21 par choc thermique à
42°C pendant 45 secondes. Le vecteur pQE-31 possédant un
gène de résistance à l'ampicilline, le produit de
transformation est étalé sur boîte LB/agar contenant de
l'ampicilline à 50 ug/mL, puis incubé à 37°C pendant
toute une nuit. Le lendemain, plusieurs colonies isolées sont
mises en culture en milieu LB et une minipréparation
d'ADN plasmidique est effectuée pour chacune de ces cultures. Les
produits de ces minipréparations sont séquencés sur
séquenceur automatique Applied Biosystem 373A afin de
sélectionner les colonies qui possèdent le vecteur pQE-31
correctement cloné par PRODH sauvage. La dernière
étape consiste à transformer des souches BL21 contenant
le vecteur pREP-4, qui encode la protéine de régulation
LacI, par le vecteur pQE-31 cloné. Le plasmide pREP-4 contenant
un gène de résistance à la kanamycine, les
bactéries qui possèdent les vecteurs pQE-31 et pREP-4 sont
sélectionnées par ajout de 50 ug/mL d'ampicilline et de 30 ug/mL
de kanamycine dans les milieux de culture. Ces cultures sont finalement
mélangées à 25 % de
glycérol puis stockées à -80°C.
5.1.2) Construction du vecteur pQE-31 contenant
PRO564
La protéine PRO564 correspond à la
protéine PRODH sauvage délestée de 36 acides aminés
à son extrémité N-terminale. De ce fait, nous avons choisi
de réaliser le vecteur de surexpression de PRO564 à partir
du vecteur pQE-31 cloné par PRODH sauvage par une
technique apparentée à la mutagenèse dirigée.
La stratégie consiste à amplifier par PCR la
totalité du vecteur pQE-31 cloné à l'exception de la
région qui correspond à l'extrémité 1-36
de PRODH. Pour cela, nous avons utilisé le kit de
mutagenèse QuikChange Site-Directed
Mutagenesis de la société Stratagene.
Une minipréparation d'ADN plasmidique est
préalablement réalisée à partir de cultures de
BL21 uniquement transformées par le plasmide pQE-31 cloné
par PRODH. Ce vecteur est amplifié par PCR à
l'aide d'amorces sens et anti-sens complémentaires des
extrémités des régions d'ADN à dupliquer. Les
amorces utilisées sont del-PRODH-40-For
(5'-GTGCCAGGAGGTGGGTCGGCCAC-3') et del-PRODH-Rev
(5'-ATGGTGATGGTGA TGGTGAGATCCTCTCATAG-3'). Le mélange
réactionnel de PCR est composé de 2.5 unités
d'enzyme Pfu Turbo (Stratagene), de 5 uL de tampon Pfu 10x,
de 125 ng de chaque amorce, de 0.2 mM de mélange
nucléotidique dNTP, et de 30 ng de vecteur pQE-31. Le volume
final est complété à 50 uL avec de l'eau MilliQ
stérile. Les conditions d'amplification
par la polymérase haute fidélité Pfu
Turbo sont résumées dans la figure suivante :
? 95°C ? 4 min
1) ? 95°C ? 30 sec
? 55°C ? 1 min
? 68°C ? 10 min
20x
? 95°C ? 30 sec
2) ? de 64°C à 55°C ?
1 min
(-1°C à chaque cycle)
? 68°C ? 10 min
10x
Figure 2.4 : Description du
protocole d'amplification PCR utilisé pour réaliser
la
construction PRO564.
Une fois les 30 cycles de PCR terminés, les amplicons sont
vérifiés sur gel d'agarose
1%, puis digérés avec l'enzyme de restriction
DpnI à 37°C pendant 1 heure 30. L'action de DpnI
permet de linéariser de manière spécifique le
plasmide circulaire parental pQE-31, et ainsi de le neutraliser avant
transformation dans E. coli. Les produits de PCR sont purifiés
sur
gel d'agarose à 0.9% avec le kit QIAquick Gel
Extraction en découpant les bandes qui migrent aux tailles
attendues. Après estimation de la quantité de
matériel, la ligation des
extrémités de l'insert par « bout franc »
est entreprise en mélangeant 50 ng d'amplicon avec 3
unités de T4 DNA ligase pendant 30 heures à
16°C. Plusieurs colonies BL21
chimiocompétentes contenant le plasmide pREP-4
sont transformées avec le produit de ligation par choc thermique
à 42°C pendant 45 secondes, puis étalées sur
boîte LB/agar contenant 50 ug/mL d'ampicilline et 30 ug/mL de kanamycine
à 37°C pendant toute une nuit.
Le lendemain, plusieurs colonies isolées sont mises en
culture avec les mêmes concentrations d'antibiotiques et une
minipréparation d'ADN plasmidique est effectuée pour chacune
d'entre elles. La construction du nouveau vecteur pQE-31 encodant la
protéine PRO564 est contrôlée
par digestion avec les enzymes BglI et
EcoRV. L'amplification d'un fragment par PCR pouvant engendrer
des erreurs inhérentes à l'utilisation des
polymérases, la séquence des clones
sélectionnés a été minutieusement
vérifiée avec le séquenceur automatique Applied
Biosystem 373A. Finalement, les cultures bactériennes
qui contiennent la construction attendue sont mélangées
à 25 % de glycérol puis stockées à -80°C.
| 
