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Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

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par Ludovic Carlier
Université de Rouen - Doctorat de biologie structurale 2006
  

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4) Conclusions

Dans le travail qui a été présenté, nous avons abordé la première étape de l'étude structurale de PRODH humaine en la surexprimant chez la bactérie E. coli. Nous avons montré que la production des protéines PRODH sauvage et mature dans cet organisme conduit à l'unique formation de corps d'inclusion, et ceci malgré une optimisation de quelques paramètres d'expression et d'extraction.

Lorsque l'expression d'une protéine sous forme soluble n'est pas possible chez E. coli, une des stratégies alternatives d'obtention de la forme repliée communément utilisée consiste

à renaturer la protéine in vitro à partir de corps d'inclusion purifiés. Cette technique, qui repose sur la renaturation de la protéine par dialyse de l'agent dénaturant, présente cependant

un caractère tout autant incertain. Elle nécessite ainsi de contrôler que le repliement final de la protéine soit natif et biologiquement actif à l'issu de la renaturation. Lorsque nous avons entrepris de produire PRODH chez E. coli, il n'existait aucune donnée structurale connue de

proline déshydrogénase d'une espèce eucaryote suffisamment proche qui permette de vérifier

l'efficacité d'une éventuelle renaturation in vitro. Les données de la littérature font état de 2

tests d'activité de PRODH in vitro, dont l'un repose sur le dosage du produit de dégradation

de la proline par l'O-aminobenzaldehyde (Johnson & Strecker, 1962). Ces tests d'activité, qui n'étaient pas mis en place au Laboratoire de Génétique de Rouen, nécessitent généralement une mise au point qui d'une part, peut être coûteuse en temps et d'autre part, demande une certaine expérience en la matière. Par conséquent, ne disposant d'aucun moyen de vérification

de l'efficacité d'une éventuelle renaturation, nous n'avons pas envisagé d'obtenir la forme repliée de PRODH par renaturation in vitro des corps d'inclusion.

A ce stade du projet, il apparaissait donc que seule l'expression de PRODH sous forme soluble nous permette d'accéder à l'étape supérieure de l'étude structurale. Deux choix stratégiques différents étaient alors possibles : changer d'organisme de production, ou intégrer une structure qui permette un criblage à haut ou moyen débit de plusieurs conditions d'expression chez E. coli. Nous avons opté pour la deuxième stratégie en initiant une collaboration avec le Laboratoire de Marquage des Protéines (LMP) du Département d'Ingénierie et d'Etude des Protéines (DIEP, Direction Docteur André Menez) du CEA de Saclay. Dans le cadre de cette collaboration, j'ai été accueilli au sein du LMP afin de bénéficier des infrastructures d'une plate-forme de production à moyen débit de protéines recombinantes chez E. coli.

Outre la possibilité de tester un grand nombre de conditions expérimentales, le programme de production du LMP permet également de surexprimer en parallèle plusieurs protéines ou domaines dans un délai raisonnable. C'est pourquoi, nous avons entrepris de produire la forme mature de PRODH humaine, ainsi que 3 autres domaines de cette protéine, dans le cadre de cette plate-forme. En effet, de nouvelles données sont apparues dans la littérature lorsque nous produisions PRO564. La publication récente de la première structure

du domaine catalytique de proline déshydrogénase de E. coli (Lee et al., 2003) nous a permis

de modifier notre stratégie d'étude structurale de PRODH. Sur la base de cette structure, nous avons mené une analyse bio-informatique afin de sélectionner 3 domaines potentiels de

PRODH. La description de cette étude fait l'objet du prochain chapitre.

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